Saccharomyces cerevisiae posseeix dues glutatió transferases (GST) anomenades Gtt1i Gtt2, amb capacitat de conjugar una molècula de glutatió amb el substrat estàndarCDNB. Aquests dos enzims no són clasificables dins de les classes convencionalsdescrites en base a l'estructura de les GST d'eucariotes superiors, encara que guardencerta similitud estructural amb els membres de la classe Zeta. En aquesta memòria esdescriu la caracterització de tres GST de classe Omega en S. cerevisiae anomenadesGto1, Gto2 i Gto3, codificades respectivament per les ORFs YGR154c, YKR076w iYMR251w. Els enzims d'aquesta classe no tenen activitat sobre CDNB, però són activescom tiol oxidoreductases i posseïxen activitat dehidroascorbat reductasa i dimetilarsenatreductasa. La primera d'elles, Gto1, és peroxisomal i posseïx un senyal de localitzacióde tipus PTS1 en la regió C-terminal. Aquest senyal és reconeguda pel transportadorperoxisomal Pex5, que facilita la seva internalizació en aquest organul. D´altre banda,Gto2 i Gto3 tenen localització citoplàsmica. Els gens GTO de S. cerevisiae s'induïxenper estrès oxidativu però amb patrons distints per als tres gens. La dependènciad'aquesta expressió dels factors de trascripció Yap1, Msn2 i Msn4 es relaciona amb lapresència de seqüències YRE i STRE en els promotors dels gens GTO. El mutant Dgto1és sensible a l'agent oxidant diamida i té una concentració intracel· lular de glutatiómenor que la soca silvestre. Aquest fenotip es relaciona amb que el triple mutant Dgtt2Dgtt1 Dgto1 sigui sensible al cadmi, indicant que les tres GST Gtt1, Gtt2 i Gto1intervenen en la detoxificació d'aquest metall. Altre fenotip rellevant és la dificultat delmutant Dgto1 per a créixer en medis de cultiu amb àcid oleic com única font de carboni,indicant que les funcions peroxisomals en el mutant estan afectades. L'absència deGTO1 en S. cerevisiae causa així mateix el descens en l'expressió de gens involucratsen la via de síntesi de cisteïna i metionina. Com a conseqüència, el mutant Dgto1 creixamb dificultat en absència de treonina, serina o lisina. La manca de GTO1 en S.cerevisiae impedeix que utilitzi eficientment la cisteïna o la cistationina com úniquesfonts de sofre, manifestant defectes en la transulfuració, procés que permet la síntesi demetionina a partir de cisteïna. Això suggereix que Gto1 podria estar regulant l'activitatcistationina b-liasa de Str3 mitjançant la seva activitat tiol oxidoreductasa, atès que Str3també és peroxisomal. Atès que la cisteína 387 de Str3 és important per a la sevaactivitat biològica i està conservada en les cistationina b-liasas d'altres espècies defongs, aquest residu podria ser diana de Gto1 per a la regulació de l'estat redox de laproteïna Str3RESÚMENSaccharomyces cerevisiae posee dos glutatión transferasas (GST) denominadas Gtt1 yGtt2 con capacidad de conjugar una molécula de glutatión con el sustrato estándarCDNB. Estas dos enzimas no son clasificables dentro de las clases convencionalesdescritas con base en la estructura de las GST de eucariotas superiores, aunqueguardan cierta similitud estructural con las de clase Zeta. En esta memoria se describela caracterización de tres GST de clase Omega en S. cerevisiae denominadas Gto1,Gto2 y Gto3, codificadas por las ORF YGR154c, YKR076w y YMR251w. Las enzimasde esta clase no tienen actividad sobre CDNB, pero son activas como tioloxidoreductasa y poseen actividad dehidroascorbato reductasa y dimetilarsenatoreductasa. La primera de ellas, Gto1, es peroxisomal y posee una señal de localizaciónde tipo PTS1 en la región C-terminal. Dicha señal es reconocida por el transportadorperoxisomal Pex5, que facilita su internalización en este organelo. Por otra parte, Gto2y Gto3 tienen localización citoplásmica. Los genes GTO de S. cerevisiae se inducen porestrés oxidativo pero con patrones distintos para los tres genes. La dependencia de estaexpresión de los factores de trascripción Yap1, Msn2 y Msn4 se relaciona con lapresencia de secuencias YRE y STRE en los promotores de dichos genes. El mutanteDgto1 es sensible al agente oxidante diamida y tiene una concentración intracelular deglutatión menor que la cepa silvestre. Este fenotipo se relaciona con que el triplemutante Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 sea sensible al cadmio, indicando que las tres GST Gtt1,Gtt2 y Gto1 intervienen en la detoxificación de este metal. Otro fenotipo relevante es ladificultad del mutante Dgto1 para crecer en medios con ácido oleico como única fuentede carbono, indicando que las funciones peroxisomales en dicho mutante estánafectadas. La ausencia de GTO1 en S. cerevisiae causa así mismo el descenso en laexpresión de varios genes involucrados en la vía de síntesis de cisteína y metionina.Como consecuencia, el mutante Dgto1 crece con dificultad en ausencia de treonina,serina o lisina. La ausencia de Gto1 en S. cerevisiae impide que utilice eficientementela cisteína o la cistationina como únicas fuentes de azufre, manifestando defectos en latransulfuración, proceso que permite la síntesis de metionina a partir de cisteína. Ellosugiere que Gto1 podría estar regulando la actividad cistationina b-liasa de Str3mediante su actividad tiol oxidoreductasa, dado que Str3 también es peroxisomal.Dado que la cisteína 387 de Str3 es importante para su actividad biológica y estáconservada en las cistationina b-liasas de otras especies de hongos, este residuopodría ser diana de Gto1 para la regulación del estado redox de la proteína Str3.SUMARYSUMMARYSaccharomyces cerevisiae contains two glutathion transferases (GST) named Gtt1 andGtt2, which are enzymes with glutathione conjugating activity with the standard substrateCDNB. These two enzymes are not classified into the conventional classes that havebeen established based on the structure of mammalian GST, although they keep certainstructural similarity with Zeta class members. In this report, we describe thecharacterization of three S. cerevisiae Omega class GST named Gto1, Gto2 and Gto3,coded by ORFs YGR154c, YKR076w and YMR251w, respectively. The enzymes ofthis class do not exhibit activity with CDNB but they are active as tiol oxidoreductases,dehydroascorbate reductases and dimetilarsonate reductases. The first of them, Gto1,is located at the peroxisome and is targeted to this organelle throught a C-terminalPTS1-type sequence. This sequence is recognized by the peroxisomal transporterPex5 that facilitates peroxisomal import. On the other hand, Gto2 and Gto3 are at thecytosol. The GTO genes of S. cerevisiae are induced by oxidative stress, although theexpression patterns are different for the three genes. The expression of GTO genesdepends on Yap1, Msn2 and Msn4 transcription factors and correlates with thepresence of YRE and STRE sequences in the promoters of these genes. The absenceof GTO1 causes a hipersensitivity to the oxidant diamide in S. cerevisiae and reducesthe intracelular concentration of glutathione, compared with the wild type stain. Thisphenotype is related to cadmium sensitivity of the Dgtt1 Dgtt2 Dgto1 triple mutant,indicating that Gtt1, Gtt2 and Gto1 participate in the response to cadmium toxicity.Another rellevant phenotype of S. cerevisiae cells lacking GTO1 is the growth defectwith oleic acid as the sole carbon source, indicating that the peroxisome funtions areaffected in the mutant. This mutant also grows defficiently in the absence of threonine,serine or lysine in the growth medium. Lack of GTO1 function also affects negativelythe expression of several genes involved in methionine and cisteine sinthesis. As aconsecuence, the Dgto1 mutant shows defective growth in a medium with cisteine orcistationine as the sole sulfur source as a consequence of defective trasulfuration, aprocess that allows methionine synthesis from cisteine. This suggests that Gto1 couldregulate the cystathionine b-lyase activity of Str3 through its thiol oxidoreductaseactivity, since Str3 is also peroxisomal. As the cysteine 387 residue of Str3 is importantfor the biological activity of this protein and is conserved in fungal species, this residuecould be a target of Gto1 for the regulation of the redox state of Str3.

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat. / El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato. / The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.