Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este trabajo fue demostrar que la glutatión transferasa M2-2 humana (GST M2-2), protege a los astrocitos de los efectos tóxicos del aminocromo, ya que en estudios in vitro utilizando la enzima recombinante, se demostró que esta enzima conjuga aminocromo con glutation reducido (GSH), formando un metabolito resistente a agentes oxidativos biológicos, bloqueando de esta forma los efectos neurotoxicos generados por aminocromo. GST M2-2 está presente en la sustancia nigra y en astrocitos. Para demostrar la función protectora de esta enzima, se infectó la línea celular de astrocitos humanos U373MG con retrovirus (Gammaretroviridae), los cuales llevan en su genoma un plasmidio con los RNA interferentes (siRNA), necesarios para generar una disminución total o parcial de la expresión de esta enzima. Se utilizaron tres siRNA, los cuales van dirigidos a distintas zonas del RNAm, con el fin de producir secuencias erróneas que impidan la síntesis de la proteína funcional. De los tres interferentes utilizados, todos ellos generaron una disminución de la expresión de la enzima GST M2-2 en diferente magnitud, uno de ellos, el denominado arbitrariamente siGST 6, logró una disminución de la expresión de la enzima de un 82%, siendo éste el mayor nivel alcanzado. Para los ensayos de toxicidad se sintetizó y purificó aminocromo y se agregó a la línea celular de astrocitos humanos U373MG. Se realizó una curva de toxicidad utilizando diferentes concentraciones de aminocromo, (0, 50, 100, 200, 300 y 500 uM) y se evaluó su toxicidad tanto en la línea celular U373MG wild type como en la línea celular U373MG infectada con los distintos interferentes. Los resultados sugieren que la línea celular U373MG wild type es más resistente a los efectos tóxicos generados por aminocromo, debido principalmente a la presencia de la enzima GST M2-2. En aquellas células infectadas con los interferentes se produjo una mayor mortalidad, directamente proporcional al grado de inhibición de la enzima GST M2-2, lo que demuestra y comprueba que esta enzima conjuga aminocromo y bloquea los efectos tóxicos de este / Proyecto FONDECYT 1061083 y Beca Fogarty Internacional Research Collaboration Award (FIRCA), RCA R03 TW07044-1

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Previamente hemos demostrado que el sistema Cu2+/ascorbato puede inhibir la actividad enzimática de algunas proteínas tiólicas a través de dos mecanismos: oxidación inducida por ROS y unión inespecífica de Cu2+ a dichas proteínas. Así por ejemplo, la actividad GSH-transferásica citosólica total fue inhibida por Cu2+ 50 μM ya sea en ausencia o presencia de ascorbato. Al igual que el cobre, el hierro es un metal de transición y sus iones generan ROS a través de las reacciones de Haber Wiess y/o Fenton. Por lo tanto, los iones Fe3+ podrían por un lado oxidar grupos tiólicos de proteínas como también unirse a ellos inespecíficamente, inhibiendo así su actividad biológica. En este trabajo describimos la inhibición de la actividad GSH-transferásica total citosólica de hígado de rata inducida por Fe3+/ascorbato. Esta actividad enzimática fue inhibida por concentraciones micromolares de Fe3+ en presencia de ascorbato, efecto que fue revertido por DTT y cisteína de una forma concentración-respuesta. Este efecto inhibitorio se describe en función de los parámetros cinéticos aparentes de la GST-transferasa. Por otra parte, Fe3+/ascorbato redujo el contenido de tioles microsómicos. Sin embargo, concentraciones micromolares de Fe3+ en ausencia de ascorbato, no alteraron la actividad control de la GSH-transferásica, a pesar de que se ensayaron concentraciones hasta 500 μM. Cabe señalar además, que en nuestras condiciones de ensayo, la capacidad redox de los iones Fe3+ fue menor que la de Cu2+, ya que se necesitaron mayores concentraciones de estos iones para obtener efectos lipoperoxidativos microsómicos similares (Fe3+ 250 μM vs Cu2+ 250 ηM). Los mecanismos que pueden explicar las diferencias observadas entre los iones cobre e hierro, se discuten al final de este manuscrito / We previously reported that Cu2+/ascorbate may change some enzymatic activities of thiol proteins through two mechanisms: ROS-induced oxidation and unspecific Cu2+ binding to it. Thus, total cytosolic GST activity was inhibited by 50 or more μM Cu2+ concentrations in either absence or presence of ascorbate. Similar to copper, iron is also a transition metal and the iron ions also generate ROS through Haber Weiss and/or Fenton reactions. Thus, iron ions may alter the biological activity of thiol proteins through ROS-induced oxidation and also by Fe3+-binding to protein’s thiol groups. The present work describes the inhibition of total cytosolic GST activity from rat liver by Fe3+/ascorbate. Micromolar Fe3+ in the presence of ascorbate inhibited the total cytosolic GST activity, inhibition which was prevented by DTT and cysteine as a concentrationdependent manner. We further described this inhibition effect in terms of GST apparent kinetic parameters. In the similar assay conditions Fe3+/ascorbate reduced the microsomal thiol content. Interestingly, μM Fe3+ in the absence of ascorbate did not affect GST activity, although until 500 μM Fe3+ was used. Moreover, to develop similar microsomal lipoperoxidative effects, a greater iron ions concentration (250 μM Fe3+/ascorbate) than of copper (250 ηM Cu2+/ascorbate) was needed. Finally, we discuss the mechanisms which could explain the differences between copper and iron ions observed

No sabem quin nom serà emprat en la posteritat per a caracteritzar la nostra era però amb tota seguretat se la podria nomenar l'Era química, tal és el nombre de molècules sintetitzades per l'home que impregnen l'ambient que ens envolta en la nostra vida diària. Per això el nostre concepte de civilització moderna és inconcebible sense un entorn químic superimpost a l'entorn natural. Si la vida humana és millor gràcies a les nostres creacions químiques, o bé serà destruïda per elles, avui més que mai és una qüestió sense resposta (E. Pellegrino, 1976). Amb aquestes declaracions de Pellegrino, es posa de relleu que el propi home és capaç de provocar, a vegades inconscientment, canvis importants en el Medi Am bient, que alteren les repercussions que podríem conside rar "naturals"i els beneficis perseguits es converteixen moltes vegades en perjudicis. Entre ells, l'anomenada "contaminació ambiental" és la causa de trastorns sobre la nostra salut i origen de noves malalties. En aquesta Tesi s'estudien els efectes sobre l'organisme humà d'alguns d'aquestos agents contaminants, els nomenats electrofílics, que es troben abundantment repartits a l'atmosfera de les àrees industrials i urbanes, en molts ambients laborals, i sobre tot al fum del tabac. Aquestos compostos electrofílics són capaços, una vegada ingressats al nostre organisme, de formar enllaços covalents amb les cèl·lules i provocar en elles lesions irreversibles com a mutagènesi i carcinogènesi. Per agreujar més la situació, l'home disposa de sistemes enzimàtics capaços d'augmentar la toxicitat d'alguna d'aquestes substàncies, o inclus de convertir en tòxiques algunes que d'antuvi no ho eren.Sortosament el nostre organisme compta amb diferents mètodes de defensa contra aquestes agressions, entre els que s'hi troben els sistemes de metabolització que permeten eliminar aquestes substàncies el més ràpidament possible. Els compostos electrofílies segueixen majoritàriament la via metabòlica de la conjugació amb el glutation (GSH), mitjançant l'acció de les Glutation S-Transferasa (GST), la qual cosa priva la toxicitat d'aquests agents i facilita la seva excreció. Així doncs, aquest sistema Glutation-Glutation S-Transferasa té un paper clarament detoxificador i pro tector davant d'aquests compostos. El producte final d'aquesta conjugació és un tioèter inactiu, que s'elimina fàcilment per l'orina. Els tioèters seran, per tant, un reflex del grau d'exposició de l'organisme als compostos electrofílics però, a més, ens permetran diferenciar, a igualtat d'ex posició, la millor o pitjor capacitat de detoxificació de cada individu. De tot això es dedueix que, per a valorar la importància d'un contaminant, no és suficient quantificar la seva concentració ambiental, que és el que podríem nomenar "grau de contaminació externa", sinó que s'han de tenir en compte també les interaccions amb els sistemes biològics (metabolització) que poden modificar el compost inicial. D'aquestes interaccions s'obté el que coneixem com a "grau de contaminació interna" o real, que serà molt variable per a cada individu, i no necessàriament coincidirà amb la contaminació externa. Es per tot això que adquireixen tant de valor els no menats indicadors biològics, com a expressió molt fiable de la nomenada Exposició Interna. Els tioèters urinaris han de considerar-se com a indicadors biològics i incluir-se en els plans de monitorització de Salut Pública, com de fet ja passa a d'altres països. En primer lloc, caldrà una coordinació de les funcions de tots els professionals, com són: químics, fisiòlegs, farmacèutics, farmacòlegs, etc., sobrepassant inclus els límits de competències tradicionalment impostes. Existeixen diferents nivells d'actuació i distintes tasques per a tots, i només petits conflictes territorials i jurisdiccionals poden entorpir la bona coordinació d'aquests especialistes en el gran paper que els té reservat la Salut Pública. El farmacòleg, a part de la funció clàssica de descobrir i desenvolupar nous productes, ha de tenir també un paper preponderant en el control d'agents químics em prats en la ramaderia, agricultura i indústria. Ha de dependre d'ells també l'ensenyar i portar a terme treballs d'investigació bàsica, que permetin després, establir sistemes de vigilància i informació, a fi de què la utilització dels agents químics sigui racional. Per tant, allà on existeixi un problema d'interacció d'agents químics amb la vida, la presència del farmacòleg es fa indispensable i adquireix una gran significació social. (E. Pellegrino, 1976).

CATALÀ:L'enzim carnitina palmitoïltransferasa1 (CPT1), localitzat a la membrana mitocondrial externa, constitueix el principal punt de control de l'entrada d'àcids grassos de cadena llarga (LCFA) al mitocondri i és clau en el manteniment d'àcids grassos circulants. Existeixen tres isotips descrits (CPT1A, CPT1B i CPT1C) que codifiquen per enzims amb diferents característiques cinètiques i patrons d'expressió.1.- Mecanismes de control transcripcional del gen CPT1B humà.El promotor humà de la CPT1B inclou un element de resposta a PPAR i un lloc d'unió a MEF-2. Hem investigat el paper d'aquests elements de resposta i la possible interacció entre PPARα i MEF2C en la regulació transcripcional d'aquest promotor. Dels resultats obtinguts podem concloure que la resposta del promotor a PPARα depèn: del context cel·lular, de l'element de resposta a MEF-2 i de la disposició espacial d'aquest respecte al PPRE. La combinació d'aquests elements cis en el promotor de la CPT1B indueix l'expressió màxima del gen en resposta a diferents senyals. La concurrència de senyals metabòlics i miogènics en aquest promotor genera una conformació transcripcional permissiva d'aquest promotor que porta a una activació sinèrgica del promotor en aquells teixits on es troben els corresponents factors de transcripció (MEF2C, PPARα/RXRα) i el substrat metabòlic de l'enzim, els àcids grassos que activen PPARα. En la mateixa una regió promotor una zona rica en GC capaç d'unir Sp1 ha resultat fonamental per l'expressió basal del gen i per la transactivació per PPARα però no per la de PPARδ. 2.- Relació estructura/funció de l'enzim CPT1 de porc.A nivell cinètic, les CPT1A mostren una alta afinitat per la carnitina i una baixa sensibilitat al malonil-CoA mentre que les CPT1B presenten característiques contràries. Una excepció a aquesta relació és la CPT1A de porc (PLCPT1) que es comporta com una quimera natural entre els isotips A i B, presentant afinitats pels substrats similars a les CPT1A i una IC50 pel malonil-CoA típica de les CPT1B. Utilitzant quimeres entre la CPT1A de rata i la CPT1A de porc hem demostrat que l'extrem C-terminal de les CPT1A es comporta com un únic domini que dicta la sensibilitat total a malonil-CoA de l'enzim. El grau de sensibilitat a l'inhibidor ve determinat per l'estructura adoptada per aquest domini. Utilitzant mutants delecionats hem mostrat que la sensibilitat a malonil-CoA també depèn de la interacció d'aquest únic domini carboxil amb els primers 18 aminoàcids de la proteïna. D'aquests resultats podem concloure que les CPt1A de rata i porc presenten diferent sensibilitats a malonil-CoA perquè els primers 18 aminoàcids dels enzims interaccionen diferent amb el domini C-terminal.Hem aïllat l'isotip muscular de la CPT1 de porc (PMCPT1), una proteïna de 772 aminoàcids molt similar a les CPT1B. Expressada en Pichia pastoris la CPt1B de porc ha resultat ser un enzim amb característiques cinètiques pròximes a les CPT1A. 3.- Efecte de C75 sobre el sistema CPT. Els enzims CPT1 i CPT2 són components del sistema llançadora CPT. Aquest sistema es troba finament regulat pels nivells de malonil-CoA, un inhibidor reversible de la CPT1. Per la seva capacitat d'inhibir la sintasa d'àcids grassos (FAS), el C75 és capaç d'incrementar els nivells intracel·lular de malonil-CoA intracel·lular. Paradoxalment també activa l'oxidació d'àcids grassos de cadena llarga. Per tal d'identificar la diana exacta del C75 en el sistema CPT vam analitzar l'activitat enzimàtica de CPT1A, CPT1B i CPT2 davant el tractament amb C75. Els resultats d'aquests experiments indiquen que el C75 actua sobre el sistema CPT activant CPT1A, CPT1B i CPT2 de manera independent de malonil-CoA. / The outer mitochondrial membrane enzyme carnitine palmitoyltransferase1 (CPTI) catalyzes the initial and regulatory step in the β-oxidation of long-chain fatty acids. There are three characterized isotypes: CPT1A, CPT1B and CPT1C. The human CPT1B promoter includes a functional PPAR responsive element and a myocite-specific site that binds MEF2C. We investigated the roles of these sites and the potential interaction between PPARα and MEF2C regulating this promoter. The combination of cis elements in the promoter of the CPT1B maximally induces the expression of this gene in response to a combination of signals. The concurrence of myogenic and metabolic signals generates a transcriptionally permissive conformation of the promoter that gives rise to a synergistic transcription of the gene in tissues containing the corresponding transcription factors and fatty acids that activate PPARα.Kinetic hallmarks of the CPT1A are high affinity for carnitine and low sensitivity to malonyl-CoA inhibition, while the opposite characteristics are intrinsic to the CPT1B isotype. Pig and rat CPT1A share common Km values for their substrates but differ in their sensitivity to malonyl-CoA inhibition. Using chimeras between rat CPT1A and pig CPT1A, we show that the C-terminal region behaves as a single domain, which dictates the overall malonyl-CoA sensitivity of this enzyme. Using deletion mutation analysis, we show that malonyl-CoA sensitivity also depends on the interaction of this single domain with the first 18 N-terminal amino acid residues. Pig and rat CPT1A have different malonyl-CoA sensitivity, because the first 18 N-terminal amino acids interact differently with the C-terminal domain. Pig CPT1B is a protein of 772 amino acids that shares extensive sequence identity with CPT1B. Expressed in Pichia pastoris, pig CPT1B shows kinetic characteristics similar to those of the CPT1A isotype. CPT1 and CPT2 enzymes are components of the CPT shuttle system. This system is tightly regulated by malonyl-CoA. Because of its ability to inhibit fatty acid synthase, C75 is able to increase malonyl-CoA intracellular levels. Paradoxically it also activates β-oxidation. To identify the exact target of C75 within the CPT system, we expressed CPT1 and CPT2 in Pichia pastoris. We show that C75 acts on recombinant CPT1A, CPT1B and CPT2.

Carbocyclic nucleoside analogs with norbornane moiety that have been synthesized at IOCB AS CR, represent new potential chemotherapeutic agents with significant activity against Coxsackieviruses. The main objective of this work was to study the metabolism and mechanism of action of the original analog carbocyclic nucleoside MS 254, which is characterized by its antiviral and cytostatic effects. The attention was partially paid also to the two structurally related substances (MS 255, MS 320). In this work, we determined cytotoxicity of these compounds in cell culture and the effect of MS 254 on the amount of total and oxidized glutathione, activity of glutathione-S-transferase (GST), glutathione reductase (GR) and the effect on cellular oxidative stress. The kinetics of the conjugation of MS 254 by human GST was also studied. It was found that of the three substances tested MS 255 was the most cytotoxic and MS 254 was the least cytotoxic compound. It was further found that MS 254 does not cause significant oxidative stress and that it increases the activity of GST and GR in a dose-dependent manner. Michaelis-Menten constant of the conjugation of MS 254 with the glutathione (main metabolic pathway) was determined in the milimolar range, indicating a relatively low affinity of MS 254 for GST.

"Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana " Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva a pH fisiológico. Las más abundantes y más ampliamente distribuidas entre todos los seres vivos son la putrescina y la espermidina con dos y tres grupos amino, respectivamente. La espermidina se forma a partir de la putrescina por adición de un grupo aminopropilo. La espermina, con cuatro grupos amino y presente sólo en eucariotas, se forma a partir de la espermidina por adición de un segundo grupo aminopropilo. Las poliaminas han sido relacionadas con procesos fundamentales para la vida, como son la división, el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular, habiéndose demostrado en todos los organismos en los que se han conseguido mutantes deficientes en su síntesis que las poliaminas son esenciales. En plantas se han encontrado múltiples correlaciones entre la variación en la concentración de las poliaminas y procesos tales como la germinación, la embriogénesis, la formación de raíces, la iniciación floral o el desarrollo de flores y frutos. Al inicio de esta tesis se publicó la identificación de la primera putativa espermina sintasa en plantas (ACL5), cuya pérdida de función da lugar a un defecto en la elongación del tallo y alteración del patrón normal de los haces vasculares; sin embargo, nuestro análisis del mutante acl5 nos ha revelado que no había perdido la capacidad de sintetizar espermina. Nuestro rastreo del genoma de Arabidopsis thaliana nos permitió identificar y caracterizar el gen SPM, otra putativa espermina sintasa regulada por ácido abscísico. Los mutantes nulos para este gen no muestran diferencias fenotípicas respecto del silvestre pero el doble mutante spm/acl5 nos ha permitido confirmar que no hay más genes responsables de la síntesis de espermina. No obstante, la sobreexpresión de SPM en el mutante acl5 no ha sido capaz de aliviar su fenotipo. / Gómez Minguet, E. (2008). Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8311 / Palancia

Introducción: La resistencia antimicrobiana es un problema alarmante en la salud pública mundial. A mediados del 2017, la Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó una lista de las bacterias para la búsqueda de nuevos antibióticos, incluyendo sobre todo enterobacterias. En el Perú, hubo reporte de casos de Klebsiella pneumoniae resistente a antibióticos en diferentes regiones del país. Por lo tanto, existe una necesidad de encontrar nuevos sitios diana de acción farmacológica para enfrentar esta problemática sanitaria. Objetivo: Identificar las moléculas orgánicas con capacidad de inhibición de la enzima Glucosa 1-fosfato Timidilil Transferasa (RmlA) de K. pneumoniae resistente a antibióticos utilizando la técnica de acoplamiento molecular. Materiales y métodos: Se realizó un estudio in-silico, mediante programas para acoplamiento molecular por ordenador local. La semejanza de fármacos con el sustrato natural de la enzima fue dada con programas de similaridad de ligandos, se obtuvieron datos teóricos de las interacciones entre los fármacos seleccionados con el sitio activo de la enzima. Finalmente se analizó cada ligando en función de sus energías libres. Resultados: Se analizó computacionalmente 14100 unidades farmacológicas con posible interacción con la enzima RmlA de K. pneumoniae resistente a antibióticos, según las energías libres de interacción los valores enteros están entre 96 a 103 (kcal/mol), frente al valor de acoplamiento del sustrato-enzima de -222.357 (kcal/mol). Conclusiones: Se encontraron posibles fármacos inhibidores de la enzima RmlA de K. pneumonia, es necesario continuar con la valoración y estudio de estos fármacos en estudios laboratoriales para mejorar la propuesta de inhibición enzimática basada en este trabajo de investigación computacional. / Introduction: Antimicrobial resistance is an alarming problem in global public health. In mid-2017, the World Health Organization (WHO) reported a list of bacteria for the search for new antibiotics, including especially Enterobacteriaceae. In Peru, there were reports of cases of antibiotic-resistant Klebsiella pneumoniae in different regions of the country. Therefore, there is a need to find new target sites for pharmacological action to address this health problem. Objective: Identify organic molecules with the capacity to inhibit the enzyme Glucose 1-phosphate Thymidylyl Transferase (RmlA) of antibioticresistant K. pneumoniae using the molecular docking technique. Materials and methods: An in-silico study was carried out, using programa for molecular docking by local computer. The similarity of drugs with the natural substrate of the enzyme was given with ligand similarity programs, theoretical data were obtained on the interactions between the selected drugs with the active site of the enzyme. Finally, each ligand was analyzed based on its free energies. Results: 14100 pharmacological units with possible interaction with the RmlA enzyme of antibiotic-resistant K. pneumoniae were computationally analyzed. According to the interaction free energies, the integer values are between 96 to 103 (kcal/mol), compared to the coupling value of the substrate. enzyme of -222,357 (kcal/mol). Conclusions: Possible drugs that inhibit the RmlA enzyme of K. pneumonia were found; it is necessary to continue with the evaluation and study of these drugs in laboratory studies to improve the proposal for enzyme inhibition based on this computational research work.