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Efeito da temperatura e de ativadores no processo de extração da bromelina / Effect of temperature and of activators on the extraction process of bromelainMoretto, Lauro Domingos 23 April 1992 (has links)
Foram realizados estudos do processo de extração de bromelina de caules de abacaxizeiro Ananás comosus (L.) Merr. cultivar Cayenne, com a finalidade de avaliar o efeito da temperatura de filtração do extrato, da adição de ativadores e de agentes precipitantes sobre a estabilidade da atividade proteolítica e no balanço material. A filtração de extratos a 20, 30, 40, 50 e 60°C, promoveu gradual elevação da atividade proteolítica para as temperaturas ate 50°C e redução a 60°C. A atividade proteolítica foi determinada em Unidades Kunitz. A adição de agentes reconhecidamente ativadores de enzimas proteolíticas como benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico aos extratos filtrados em diferentes temperaturas, promoveu elevação da atividade enzimática, demonstrando um efeito somatório com a temperatura. 0 extrato filtrado a 50°C, contendo ativadores, manteve-se estável durante 60 dias, quando armazenado a 5 e 20°C. 0 balanço material mostrou-se superavitário quando se precipitou bromelina por sulfato de amônio, de extrato filtrado a 40°C, contendo benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico. A acetona demonstrou menor eficiência que o sulfato de amônio, em relação ao balanço material. 0 estudo de estabilidade nas temperaturas de 5, 20, 30 e 40°C, durante 90 dias, das amostras de bromelina obtidas através do inter-relacionamento dos fatores temperatura, ativadores e precipitantes, revelou resultados mais favoráveis na amostra preparada a partir de extrato filtrado a 40°C, contendo benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico, e precipitado por sulfato de amônio. A performance conseguida na ativação e estabilização do extrato e no balanço material não foi ratificada em relação a estabilidade da bromelina em pó. A bromelina em pó, sequramente, necessita de estabilizadores para consolidar as vantagens comprovadas no balanço material, na ativação e estabilização do extrato. / Studies were made on the extraction process of bromelain obtained from the stem of pineapple plant Ananas comosus (L.) Merr. variety Cayenne, with the purpose to evaluate the effect of temperature of the filtration extract, addition of activators and of precipitants agents upon the stability of the proteolytic activity and upon the material balance. The filtration of the extracts at 20, 30, 40, 50 and 60°C results in a gradual increase in the proteolytic activity of the extract till 50°C and a reduction at 60°C. The proteolytic activity was determined in Kunitz units.The addition of commons agents, proteolytic activators like sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate to the filtrated extracts of stem pineapple at different temperatures promote one elevation of the activity showing an addictive effect with the temperature. The filtrated extract at 50°C and with activators was stable for 60 days when stored at 5 and 20°C.The material balance showed a superavit when the precipitation of bromelain was made by ammonium sulphate in relation to others filtrated at 40°C, obtained with sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate.The acetone showed less efficiency than the ammonium sulphate in relation to the material balance. The stability study of the bromelain at the temperature of 5, 20, 30 and 40°C during a period of 90 days and obtained through the interrelationship of factors like temperature, activators and precipitants showed best results to bromelain sample prepared from the filtrated extract at 40°C with sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate and precipitated with ammonium sulphate. The performance related to the activation, stabilization and in the material balance was not confirmed in relation to the stability of the bromelain powder. The bromelain powder, certainly needs stabilizers to consolidate the advantages showed in the material balance in the activation and stabilization of pineapple extract.
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Efeito da temperatura e de ativadores no processo de extração da bromelina / Effect of temperature and of activators on the extraction process of bromelainLauro Domingos Moretto 23 April 1992 (has links)
Foram realizados estudos do processo de extração de bromelina de caules de abacaxizeiro Ananás comosus (L.) Merr. cultivar Cayenne, com a finalidade de avaliar o efeito da temperatura de filtração do extrato, da adição de ativadores e de agentes precipitantes sobre a estabilidade da atividade proteolítica e no balanço material. A filtração de extratos a 20, 30, 40, 50 e 60°C, promoveu gradual elevação da atividade proteolítica para as temperaturas ate 50°C e redução a 60°C. A atividade proteolítica foi determinada em Unidades Kunitz. A adição de agentes reconhecidamente ativadores de enzimas proteolíticas como benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico aos extratos filtrados em diferentes temperaturas, promoveu elevação da atividade enzimática, demonstrando um efeito somatório com a temperatura. 0 extrato filtrado a 50°C, contendo ativadores, manteve-se estável durante 60 dias, quando armazenado a 5 e 20°C. 0 balanço material mostrou-se superavitário quando se precipitou bromelina por sulfato de amônio, de extrato filtrado a 40°C, contendo benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico. A acetona demonstrou menor eficiência que o sulfato de amônio, em relação ao balanço material. 0 estudo de estabilidade nas temperaturas de 5, 20, 30 e 40°C, durante 90 dias, das amostras de bromelina obtidas através do inter-relacionamento dos fatores temperatura, ativadores e precipitantes, revelou resultados mais favoráveis na amostra preparada a partir de extrato filtrado a 40°C, contendo benzoato de sódio, cloridrato de cisteina e edetato dissódico, e precipitado por sulfato de amônio. A performance conseguida na ativação e estabilização do extrato e no balanço material não foi ratificada em relação a estabilidade da bromelina em pó. A bromelina em pó, sequramente, necessita de estabilizadores para consolidar as vantagens comprovadas no balanço material, na ativação e estabilização do extrato. / Studies were made on the extraction process of bromelain obtained from the stem of pineapple plant Ananas comosus (L.) Merr. variety Cayenne, with the purpose to evaluate the effect of temperature of the filtration extract, addition of activators and of precipitants agents upon the stability of the proteolytic activity and upon the material balance. The filtration of the extracts at 20, 30, 40, 50 and 60°C results in a gradual increase in the proteolytic activity of the extract till 50°C and a reduction at 60°C. The proteolytic activity was determined in Kunitz units.The addition of commons agents, proteolytic activators like sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate to the filtrated extracts of stem pineapple at different temperatures promote one elevation of the activity showing an addictive effect with the temperature. The filtrated extract at 50°C and with activators was stable for 60 days when stored at 5 and 20°C.The material balance showed a superavit when the precipitation of bromelain was made by ammonium sulphate in relation to others filtrated at 40°C, obtained with sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate.The acetone showed less efficiency than the ammonium sulphate in relation to the material balance. The stability study of the bromelain at the temperature of 5, 20, 30 and 40°C during a period of 90 days and obtained through the interrelationship of factors like temperature, activators and precipitants showed best results to bromelain sample prepared from the filtrated extract at 40°C with sodium benzoate, cysteine hydrochloride and sodium edetate and precipitated with ammonium sulphate. The performance related to the activation, stabilization and in the material balance was not confirmed in relation to the stability of the bromelain powder. The bromelain powder, certainly needs stabilizers to consolidate the advantages showed in the material balance in the activation and stabilization of pineapple extract.
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Metabolismo do nitrogênio e estado nutricional do cafeeiro (Coffea arabica) / Nitrate reductase and glutamine synthetase activity during coffee plant reproductionReis, André Rodrigues dos 31 August 2007 (has links)
Este trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar atividade da redutase do nitrato (RN), sintetase da glutamina (GS) e conteúdo de proteína total solúvel (PTS) em folhas de cafeeiro durante o desenvolvimento dos frutos em condições de campo. O experimento foi instalado em blocos ao acaso em esquema fatorial 3x6, constituído pela combinação de 3 doses de N (0, 150 e 350 kg ha-1) e avaliado em seis diferentes fases fenológicas (janeiro, fevereiro, março, abril, maio e junho), com sete repetições. No experimento foi utilizada a cultivar Catuaí Vermelho IAC 44 com seis anos implantada num Nitossolo Vermelho Eutroférrico, no município de Piracicaba-SP. Com relação à atividade da RN, GS e PTS em função das doses de N verificou incremento nos valores da atividade destas enzimas e do teor de proteína total solúvel em função da dose de N. As maiores atividades da RN foram obtidas no mês de janeiro (0,834, 1,370 e 1,781 µmol NO2 - g-1 MF h-1), bem como para a GS (82,47, 95,31 e 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS). O teor de proteína solúvel total (PTS) apresentou a mesma tendência (0,62, 5,66 e 6,52 mg mL-1). Estes valores foram obtidos em frutos na fase chumbinho. Durante o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro a atividade das enzimas estudadas e o conteúdo de PTS foliar diminuíram, ao longo do tempo de janeiro a junho (maturação frutos). / The aim of this work was to evaluate the nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) activity, total soluble protein content (PTS) in coffee leaves during the fruits development in field conditions. The study was carried out in ESALQ/USP (University of São Paulo), Piracicaba, São Paulo, Brazil in a Red Nitosol eutrofic. The experimental design was a complete randomized, in a factorial outline 3 x 6, constituted by combination of 3 levels (0, 150 and 350 kg ha-1) of nitrogen in six different periods (January, February, March, April, May and June) in plants (Cultivar Catuaí Vermelho IAC 44). The RN, GS activity and leaves PTS content was linear increased in relation of levels of N applied. In accordance with the present study, the enzymes had presented greater activity during the January than other months (0,834, 1,370 and 1,781 µmol NO2 - g-1 DF h-1) of RN; (82,47, 95,31 and 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS) of GS and (0,62, 5,66 and 6,52 mg mL-1) of total soluble protein (PTS), in the treatments T0, T1 and T2, respectively. In January, the fruits were young grains and this period the coffee plant has high enzymatic activity. However, the capacity of nitrate assimilation during the annual cycle of coffee plants can be change through the environment and climatic variations and this phase (January) was verified a great precipitation. During the coffee fruits development, the RN and GS activity and the foliar PTS content had decreased, this occur due to the process of senescence of leaves, promote it the remobilization to other plant organs, as seed filling.
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Metabolismo do nitrogênio e estado nutricional do cafeeiro (Coffea arabica) / Nitrate reductase and glutamine synthetase activity during coffee plant reproductionAndré Rodrigues dos Reis 31 August 2007 (has links)
Este trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar atividade da redutase do nitrato (RN), sintetase da glutamina (GS) e conteúdo de proteína total solúvel (PTS) em folhas de cafeeiro durante o desenvolvimento dos frutos em condições de campo. O experimento foi instalado em blocos ao acaso em esquema fatorial 3x6, constituído pela combinação de 3 doses de N (0, 150 e 350 kg ha-1) e avaliado em seis diferentes fases fenológicas (janeiro, fevereiro, março, abril, maio e junho), com sete repetições. No experimento foi utilizada a cultivar Catuaí Vermelho IAC 44 com seis anos implantada num Nitossolo Vermelho Eutroférrico, no município de Piracicaba-SP. Com relação à atividade da RN, GS e PTS em função das doses de N verificou incremento nos valores da atividade destas enzimas e do teor de proteína total solúvel em função da dose de N. As maiores atividades da RN foram obtidas no mês de janeiro (0,834, 1,370 e 1,781 µmol NO2 - g-1 MF h-1), bem como para a GS (82,47, 95,31 e 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS). O teor de proteína solúvel total (PTS) apresentou a mesma tendência (0,62, 5,66 e 6,52 mg mL-1). Estes valores foram obtidos em frutos na fase chumbinho. Durante o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro a atividade das enzimas estudadas e o conteúdo de PTS foliar diminuíram, ao longo do tempo de janeiro a junho (maturação frutos). / The aim of this work was to evaluate the nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) activity, total soluble protein content (PTS) in coffee leaves during the fruits development in field conditions. The study was carried out in ESALQ/USP (University of São Paulo), Piracicaba, São Paulo, Brazil in a Red Nitosol eutrofic. The experimental design was a complete randomized, in a factorial outline 3 x 6, constituted by combination of 3 levels (0, 150 and 350 kg ha-1) of nitrogen in six different periods (January, February, March, April, May and June) in plants (Cultivar Catuaí Vermelho IAC 44). The RN, GS activity and leaves PTS content was linear increased in relation of levels of N applied. In accordance with the present study, the enzymes had presented greater activity during the January than other months (0,834, 1,370 and 1,781 µmol NO2 - g-1 DF h-1) of RN; (82,47, 95,31 and 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS) of GS and (0,62, 5,66 and 6,52 mg mL-1) of total soluble protein (PTS), in the treatments T0, T1 and T2, respectively. In January, the fruits were young grains and this period the coffee plant has high enzymatic activity. However, the capacity of nitrate assimilation during the annual cycle of coffee plants can be change through the environment and climatic variations and this phase (January) was verified a great precipitation. During the coffee fruits development, the RN and GS activity and the foliar PTS content had decreased, this occur due to the process of senescence of leaves, promote it the remobilization to other plant organs, as seed filling.
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A PKA modula a localização do SGLT1 e indiretamente a recuperação do pHi, no tratamento com alta concentração de glicose. / PKA modulates the SGLT1 distribution and the pHi recovery rate indirectly, in the high glucose concentration treatment.Silva, Olivia Beloto da 02 May 2012 (has links)
Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. / This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.
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Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em nanopartículas magnéticas e sua applicação em resolução cinética de alcoóis secundários quirais / Immobilization of Burkholderia cepacia lipase on magnetic nanoparticles and its application in enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcoholsRebelo, Lya Pantoja 11 May 2009 (has links)
Esta dissertação apresenta um estudo de diferentes metodologias de imobilização (fisissorção, quimissorção com carboxibenzaldeído e quimissorção com glutaraldeído) da lipase de Burkholderia cepacia em nanopartículas magnéticas e sua aplicação na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos. O método de imobilização por fisissorção resultou na imobilização de 0,21 mg de proteína em 20 mg de nanopartículas magnéticas. Para a mesma quantidade de nanopartículas magnéticas, o método de quimissorção com carboxibenzaldeído imobilizou 0,26 mg de proteína contra 0,28 mg de proteína pelo método de quimissorção com glutaraldeído, a melhor relação encontrada neste trabalho. A atividade enzimática foi avaliada na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos [(RS)-2-bromo-1-(fenil)etanol, (RS)-2-bromo-1-(4-nitrofenil)etanol, (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol e (RS)-1-(fenil)-1,2-etanodiol] via reação de transesterificação enantiosseletiva. O efeito de diferentes parâmetros reacionais para a resolução cinética foi estudado, como agente acilante, quantidade de substrato, solvente, quantidade de nanopartículas magnéticas (suporte), velocidade de agitação, tempo e temperatura reacionais. Os melhores parâmetros encontrados foram acetato de vinila como agente acilante, tolueno como solvente e sob agitação de 800 rpm. Observou-se que após 30 dias de estocagem da lipase imobilizada por fisissorção sua atividade foi mantida. Além disso, estudou-se a reciclagem da enzima imobilizada, durante a resolução cinética. A melhor temperatura e tempo reacional foram determinados para cada método de imobilização. A quimissorção com glutaraldeído foi o melhor método de imobilização para a reciclagem da enzima, pois durante 8 ciclos de resolução cinética a conversão (50 %) e a enantiosseletividade (>99 %) foram mantidas. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o processo de imobilização permite um aumento da estabilidade da enzima quando comparada com a enzima livre, permitindo sua reutilização por vários ciclos reacionais. / This dissertation describes studies about different immobilization methodologies (physisorption, chemisorption with carboxibenzaldehyde and chemisorption with glutaraldehyde) of the Burkholderia cepacia lipase on magnetic nanoparticles and its application in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols. The physisorption method immobilized 0.21 mg of protein per 20 mg of magnetic nanoparticles. Using the same amount of magnetic nanoparticles, the chemisorption method with carboxibenzaldehyde immobilized 0.26 mg of protein against 0.28 mg for the chemisorption with glutaraldehyde, the best result found in this work. The enzymatic activity was determined in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols [(RS)-2-bromo-1-(phenyl)ethanol, (RS)-2-bromo-1- (4-nitrophenyl)ethanol, (RS)-1-(4-nitrophenyl)ethanol and (RS</I<)-1-(phenyl)- 1,2-ethanodiol] via enantioselective transesterification reaction. The effect of several reaction parameters for the kinetic resolution was studied, such as acetyl donor, substrate concentration, solvent, amount of magnetic nanoparticles (support), agitation speed, reaction time and temperature. The best results were obtained using vinyl acetate as acetyl donor, toluene as solvent, and 800 rpm as agitation speed. Regarding the physisorption method, after 30 days as storing time the enzymatic activity remained the same. Besides, the reusability of immobilized lipase was evaluated. The best temperature and reaction time in the kinetic resolution were determined for each immobilization method. The chemisorption with glutaraldehyde was the best immobilization method for the enzyme reusability, because even after 8 cycles of the kinetic reaction, the conversion (50 %) and enantioselectivity (>99 %) remained the same. Based on these results, it is possible to conclude that the immobilization process increased the enzyme stability when compared to the free enzyme, allowing its reusability for many reaction cycles.
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Imobilização da lipase de Burkholderia cepacia em nanopartículas magnéticas e sua applicação em resolução cinética de alcoóis secundários quirais / Immobilization of Burkholderia cepacia lipase on magnetic nanoparticles and its application in enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcoholsLya Pantoja Rebelo 11 May 2009 (has links)
Esta dissertação apresenta um estudo de diferentes metodologias de imobilização (fisissorção, quimissorção com carboxibenzaldeído e quimissorção com glutaraldeído) da lipase de Burkholderia cepacia em nanopartículas magnéticas e sua aplicação na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos. O método de imobilização por fisissorção resultou na imobilização de 0,21 mg de proteína em 20 mg de nanopartículas magnéticas. Para a mesma quantidade de nanopartículas magnéticas, o método de quimissorção com carboxibenzaldeído imobilizou 0,26 mg de proteína contra 0,28 mg de proteína pelo método de quimissorção com glutaraldeído, a melhor relação encontrada neste trabalho. A atividade enzimática foi avaliada na resolução cinética de alcoóis secundários racêmicos [(RS)-2-bromo-1-(fenil)etanol, (RS)-2-bromo-1-(4-nitrofenil)etanol, (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol e (RS)-1-(fenil)-1,2-etanodiol] via reação de transesterificação enantiosseletiva. O efeito de diferentes parâmetros reacionais para a resolução cinética foi estudado, como agente acilante, quantidade de substrato, solvente, quantidade de nanopartículas magnéticas (suporte), velocidade de agitação, tempo e temperatura reacionais. Os melhores parâmetros encontrados foram acetato de vinila como agente acilante, tolueno como solvente e sob agitação de 800 rpm. Observou-se que após 30 dias de estocagem da lipase imobilizada por fisissorção sua atividade foi mantida. Além disso, estudou-se a reciclagem da enzima imobilizada, durante a resolução cinética. A melhor temperatura e tempo reacional foram determinados para cada método de imobilização. A quimissorção com glutaraldeído foi o melhor método de imobilização para a reciclagem da enzima, pois durante 8 ciclos de resolução cinética a conversão (50 %) e a enantiosseletividade (>99 %) foram mantidas. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o processo de imobilização permite um aumento da estabilidade da enzima quando comparada com a enzima livre, permitindo sua reutilização por vários ciclos reacionais. / This dissertation describes studies about different immobilization methodologies (physisorption, chemisorption with carboxibenzaldehyde and chemisorption with glutaraldehyde) of the Burkholderia cepacia lipase on magnetic nanoparticles and its application in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols. The physisorption method immobilized 0.21 mg of protein per 20 mg of magnetic nanoparticles. Using the same amount of magnetic nanoparticles, the chemisorption method with carboxibenzaldehyde immobilized 0.26 mg of protein against 0.28 mg for the chemisorption with glutaraldehyde, the best result found in this work. The enzymatic activity was determined in the enzymatic kinetic resolution of chiral secondary alcohols [(RS)-2-bromo-1-(phenyl)ethanol, (RS)-2-bromo-1- (4-nitrophenyl)ethanol, (RS)-1-(4-nitrophenyl)ethanol and (RS</I<)-1-(phenyl)- 1,2-ethanodiol] via enantioselective transesterification reaction. The effect of several reaction parameters for the kinetic resolution was studied, such as acetyl donor, substrate concentration, solvent, amount of magnetic nanoparticles (support), agitation speed, reaction time and temperature. The best results were obtained using vinyl acetate as acetyl donor, toluene as solvent, and 800 rpm as agitation speed. Regarding the physisorption method, after 30 days as storing time the enzymatic activity remained the same. Besides, the reusability of immobilized lipase was evaluated. The best temperature and reaction time in the kinetic resolution were determined for each immobilization method. The chemisorption with glutaraldehyde was the best immobilization method for the enzyme reusability, because even after 8 cycles of the kinetic reaction, the conversion (50 %) and enantioselectivity (>99 %) remained the same. Based on these results, it is possible to conclude that the immobilization process increased the enzyme stability when compared to the free enzyme, allowing its reusability for many reaction cycles.
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A PKA modula a localização do SGLT1 e indiretamente a recuperação do pHi, no tratamento com alta concentração de glicose. / PKA modulates the SGLT1 distribution and the pHi recovery rate indirectly, in the high glucose concentration treatment.Olivia Beloto da Silva 02 May 2012 (has links)
Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. / This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.
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Nouveau concept de resensibilisation à la chimiothérapie en activant la nucléoside kinase dCK par le masitinib, un inhibiteur de protéines tyrosine kinases / New concept of resensitization to chemotherapy by activating the nucléoside kinase dCK by masitinib, a protein tyrosine kinase inhibitor.Hammam, Kahina 24 November 2014 (has links)
La résistance à la chimiothérapie constitue un frein majeur à son efficacité. Notre équipe a récemment pu montrer que le masitinib, un nouvel inhibiteur de protéines tyrosine kinases, possède une activité de resensibilisation des cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie lorsqu'il est combiné à certaines chimio-drogues. L'objectif des travaux de cette thèse est de déterminer les voies de signalisation, modulées par l'action du masitinib, qui sont impliquées dans la resensibilisation aux chimiothérapies et amélioration de l'activité anti-tumorale.Dans la première partie de la thèse, nous avons pu identifier la nucléoside kinase dCK (désoxycytidine kinase), protéine activatrice d'un grand nombre de chimiothérapies, comme nouvelle cible du masitinib. Cette première étude nous a permis de mettre en évidence un nouveau concept thérapeutique: le masitinib, un composé chimique de type inhibiteur de protéines tyrosine kinases, peut jouer en même temps le rôle d'activateur de nucléoside kinase.Nous avons pu mettre en évidence dans la deuxième partie de la thèse que le traitement combiné entre l'épi-drogue décitabine et le masitinib peut être plus efficace pour la réexpression de certains gènes non ou peu induits par la décitabine seule.En conclusion, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence l'interaction entre un inhibiteur de protéine tyrosine kinases et une nucléoside kinase, dans un concept d'activation enzymatique qui pourra certainement servir de base pour l'élaboration de nouvelles petites molécules chimiques spécifiques de l'activation de dCK ou d'autres nucléosides kinases nécessaires à l'activation des drogues de chimiothérapie. / Resistance to chemotherapy is considered as one of the major blockers of its efficacy. Recently, our team demonstrated that masitinib, a new tyrosine kinases inhibitor, possesse a resensitization activity of cell lines resistant to chemotherapy when associated with chemodrugs.The aim of this work is to determine signaling pathways, modulated by masitinib action, that could explain the resensitization to chemotherapy and improvement of anti-tumoral activity.In the first part of this work, we identified the nucleoside kinase dCK (deoxycytidine kinase), a chemotherapy activating protein, as a new target of masitinib. In summary, this first part of the work allowed us to describe a new and never described concept: masitinib, a small molecule belonging to tyrosine kinases group, can also play a role as nucleoside kinase activator.We were able to demonstrate through the second part of the work that the combined treatment of the epidrug decitabine and masitinib can be more effective than decitabine treatment for the re-expression of some genes non or weakly induced by decitabine when used alone.In conclusion, These data allowed us to introduce an interaction between a tyrosine kinases inhibitor and a nucleoside kinase, as an enzymatic activation new concept. This could be used as a base for the design of new small chemical molecules specific for dCK or other nucleoside kinases essential for the activation of chemodrugs. This concept will obviously help to imagine and evaluate more potential therapeutic combinations of chemodrugs and small chemical molecules to overcome the resistance to chemotherapy dependent on nucleoside kinases.
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Enzymatisch aktivierbare Biokonjugate als oberflächenspezifische AdhäsiveMeißler, Maria 15 March 2018 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass enzymresponsive Peptid-Poly(ethylenglycol)-Konjugate (Peptid-PEG-Konjugate) effizient biotransformiert und proteinresistente Beschichtungen ausbilden können. Die oberflächenspezifische Haftung eines linearen Biokonjugates auf Basis einer literaturbekannten Adhäsionsdomäne für Titandioxid-Oberflächen wurde durch Verlängerung mit einer proteolytisch spaltbaren Erkennungssequenz und einer Suppressionsdomäne temporär unterbunden. Aus einer Serie unterschiedlich modifizierter Biokonjugate wurde eine anionische Suppressionsdomäne als besonders leistungsfähige haftungsunterdrückende Einheit identifiziert. Die Prozessierung des nicht-bindenden Vorläufers mit einer spezifischen Cysteinprotease hervorgehend aus dem Tabakätzvirus (TEV Protease) bewirkte die Abtrennung der eingeführten Modifikation. Durch die Biotransformation wurden die Haftungseigenschaften der polymergebundenen Adhäsionsdomäne zurückgebildet. Das aktivierte Biokonjugat ermöglichte die nicht-kovalente PEGylierung der Metalloxid-Oberfläche. Das Konzept wurde auf divalente Peptid-PEG-Konjugate unter Verwendung verzweigter Adhäsionsdomänen und verlängerter Suppressionsdomänen übertragen. Die proteolytisch aktivierte Dimer-Beschichtung zeigte eine erhöhte Stabilität im Vergleich zum linearen Biokonjugat und demonstrierte vielversprechende Antifouling-Eigenschaften gegenüber der unspezifischen Adsorption eines Modellproteins für Serumproteine des menschlichen Blutes auf Titandioxid-Oberflächen. / The present thesis has shown that enzyme-responsive peptide-poly(ethylene glycol) (peptide-PEG) conjugates can be efficiently biotransformed to create protein-resistant coatings. The surface-specific adsorption of a linear bioconjugate is temporarily suppressed by extending a titanium dioxide adhesion domain known from literature with a proteolytically cleavable recognition site and a suitable interfering domain. From a series of differently modified bioconjugates, an anionic interfering domain was identified as particularly effective to suppress adhesive functions. The enzymatic processing of the non-binding precursor with a specific cysteine protease derived from tobacco etch virus (TEV protease) resulted in the separation of the introduced modification. The adhesive properties of the polymer-bound binding sequence were reproduced by the biotransformation process. The activated bioconjugate allowed the non-covalent PEGylation of the metal oxide surface. The concept was applied to divalent peptide-PEG conjugates using branched adhesion domains and extended interfering domains. The proteolytically activated dimer coating showed increased stability against dilution compared to the linear bioconjugate and demonstrated promising antifouling properties against the non-specific adsorption of a model protein for human blood serum proteins to titanium dioxide surfaces.
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