The phosphagen kinases are a family of enzymes that catalyze the reversible phosphorylation of specific phosphagens using ATP as the phosphate donor. The evolutionary relationships between the enzymes in this family have been studied for over 30 years and yet aspects of the relationships remain unclear. Here, arginine kinase from Strongylocentrotus purpuratus eggs was purified to homogeneity and analyzed for physical and kinetic characteristics as well as its sequence homology with other phosphagen kinases. The results indicate that dimeric arginine kinase from S. purpuratus eggs evolved from a dimeric creatine kinase after dimeric creatine kinase evolved from a monomeric arginine kinase. The molecular weight/subunit composition and sequence of dimeric arginine kinase from S. purpuratus eggs is more comparable with dimeric creatine kinases than monomeric arginine kinases. However, the kinetic characteristics of dimeric arginine kinase from S. purpuratus eggs, including the absence of substrate cooperativity, are more comparable with other arginine kinases than creatine kinases. These results indicate a unique evolution for the dimeric arginine kinase, as well as the importance sequence composition can have on the three dimensional structure of an enzyme and its kinetic characteristics.

Arginine kinase catalyzes the reversible phosphorylation of arginine using ATP. This phosphotransferase is found throughout invertebrate species; whereas a homologous enzyme, creatine kinase, is found in both vertebrate and invertebrate species. Arginine kinases are found as monomers of 40 kDa or 80 kDa and dimers of 80 kDa while creatine kinases are found as dimers of 80 kDa, monomers of 150 kDa, or octamers of 320 kDa. The significance or advantage of the dimeric state or various quaternary structures is still not understood for this family of enzymes. Here, arginine kinase from Isostychopus badonotus muscle was purified to homogeneity and analyzed for physical, kinetic, and immunological characteristics. The results indicate that arginine kinase from the sea cucumber, I. badonotus, is a dimer with a molecular weight of 87 kDa that displays physical and kinetic characteristics similar to other arginine kinases regardless of their weight or subunit composition. However, immunological cross-reactivity using I. badonotus polyclonal antibodies shows that dimeric arginine kinase from the sea cucumber can react with dimeric arginine and creatine kinases but not with monomeric arginine or creatine kinases. Comparable results are seen with polyclonal antibodies raised against purified monomeric arginine kinase from the American cockroach, Periplaneta americana. Monomeric arginine kinase from the cockroach reacted with monomeric arginine kinases but not with dimeric arginine or creatine kinases or monomeric creatine kinases. Arginine kinase from the sea cucumber and the cockroach is substantially inhibited by the anion nitrate which mimics the transferable phosphoryl group in the assumed rapid equilibrium, random addition reaction. Here, nitrate has been shown to inhibit both the initial velocity and percent of product formed from arginine kinase in I. badonotus and P. americana. Difference spectra for each enzyme in the presence of varying components of the transition state analog suggest that nitrate has an effect on the enzyme itself and inhibits through a mechanism beyond that of stabilization of the dead-end complex. Further characterization of the dimeric state in these enzymes on a structural level included the elucidation of the protein sequence from the American cockroach and a comparison with dimeric arginine and creatine kinases.

LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) Previous issue date: 2012 / The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.

Terpenes are secondary metabolites produced by plants and they have promising roles in plant defense and pharmaceuticals. They are synthesized by terpene synthases and these enzymes are part of a complex plant metabolic pathway. Diterpene biosynthesis requires co-expression of class II and class I diterpene synthases (diTPSs) to convert geranylgeranyl diphosphate (GGPP), the common precursor, into a C20 intermediate substrate. These substrates then use cytochrome p450s (CYPs) as their final steps to form diterpene scaffolds. CYPs are monooxygenases that change the redox status of their substrates into final diterpene products. Medicago truncatula was used as my model organism to investigate how legumes synthesize these secondary metabolites to contribute to crop defense improvement in the future. Seven diTPSs - MtTPS17, MtTPS18, MtTPS19, MtTPS37, MtTPS38, MtTPS39, and MtTPS40 - in M. truncatula have been identified. MtTPS38 was found to produce ent-CPP and MtTPS37 used ent-CPP to yield ent-kaurene. Combinatorial expression showed that MtTPS38 and MtTPS37 react together to produce ent-kaurene, a precursor for an important plant hormone gibberellin (GA). CYPs have also been discovered to be clustered around MtTPS19, suggesting the possibility of MtTPS19 utilizing these CYPs for downstream reactions.

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz originária e cultivada na América do Sul, com alta perecibilidade no período pós-colheita. Seus principais processos de deterioração envolvem reações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas. Neste trabalho foram estudadas raízes de mandioca da variedade Zolhudinha catalogada pela EMBRAPA como IM-158, provenientes da região amazônica, que se destacam pela alta atividade amilolítica. Foram analisadas as condições físico-químicas junto com o isolamento e purificação da α-amilase da raiz e a possível participação desta enzima no processo deteriorativo pós-colheita. Por ser uma variedade de mandioca não comercial, o tempo de cocção foi em média de 4,30 h, teor de umidade em tomo de 64 % e porcentagem de amido de cerca de 30 %. A atividade amilásica decai em 1/3 de sua intensidade no quinto dia pós-colheita, em contraponto a formação de açúcares redutores, cuja concentração aumenta cinco vezes. A purificação foi obtida com duas etapas cromatográficas, com DEAE-celulose e Sephacryl S-200, revelando duas isoenzimas de α-amilase treze vezes mais purificadas, com recuperação protéica de 7,5 % e com pesos moleculares entre 14 e 19 kDa. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a root from a native plant, cultivated in South América, that is hightly perish on the post-harvest time. The mechanisms of the root deterioration are due to enzymatic and oxidative reactions as well as the microbiological attack. In this work were studied roots of Zolhudinha variety, EMBRAPA - IM 158, cultivated in Amazonian area, which distinguishes from others varieties by its higher amylase activity. Physicochemical properties were analyzed during the post-harvest time, the purification of α-amylase were performed to establish a possible involvement on the deteriorative process. As a non-commercial variety, the cooking time of the roots was 4.30 hours on average, with 64 % of water content and 30 % of starch. The amylase activity during the post-harvest decrease 1/3 from the original at the day 5, that matches with the reducing sugar in roots by increase of five times. The purification was achieved by two chromatography steps on DEAE-cellulose and Sephacryl S-200, providing two isozymes of α-amylase, thirteen times more purified with a recovery of 7.5 % of the protein fraction, the estimated molecular weights were between 14 and 19 kDa.

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz originária e cultivada na América do Sul, com alta perecibilidade no período pós-colheita. Seus principais processos de deterioração envolvem reações enzimáticas, oxidativas e microbiológicas. Neste trabalho foram estudadas raízes de mandioca da variedade Zolhudinha catalogada pela EMBRAPA como IM-158, provenientes da região amazônica, que se destacam pela alta atividade amilolítica. Foram analisadas as condições físico-químicas junto com o isolamento e purificação da α-amilase da raiz e a possível participação desta enzima no processo deteriorativo pós-colheita. Por ser uma variedade de mandioca não comercial, o tempo de cocção foi em média de 4,30 h, teor de umidade em tomo de 64 % e porcentagem de amido de cerca de 30 %. A atividade amilásica decai em 1/3 de sua intensidade no quinto dia pós-colheita, em contraponto a formação de açúcares redutores, cuja concentração aumenta cinco vezes. A purificação foi obtida com duas etapas cromatográficas, com DEAE-celulose e Sephacryl S-200, revelando duas isoenzimas de α-amilase treze vezes mais purificadas, com recuperação protéica de 7,5 % e com pesos moleculares entre 14 e 19 kDa. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a root from a native plant, cultivated in South América, that is hightly perish on the post-harvest time. The mechanisms of the root deterioration are due to enzymatic and oxidative reactions as well as the microbiological attack. In this work were studied roots of Zolhudinha variety, EMBRAPA - IM 158, cultivated in Amazonian area, which distinguishes from others varieties by its higher amylase activity. Physicochemical properties were analyzed during the post-harvest time, the purification of α-amylase were performed to establish a possible involvement on the deteriorative process. As a non-commercial variety, the cooking time of the roots was 4.30 hours on average, with 64 % of water content and 30 % of starch. The amylase activity during the post-harvest decrease 1/3 from the original at the day 5, that matches with the reducing sugar in roots by increase of five times. The purification was achieved by two chromatography steps on DEAE-cellulose and Sephacryl S-200, providing two isozymes of α-amylase, thirteen times more purified with a recovery of 7.5 % of the protein fraction, the estimated molecular weights were between 14 and 19 kDa.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

Du fait de l’apparition de microorganismes pathogènes ayant une résistance aux antibiotiques actuels, la recherche de nouvelles molécules bioactives possédant une application médicale est devenue une préoccupation mondiale. Saccharothrix algeriensis, une bactérie filamenteuse de l’ordre des actinomycètes a montré une étonnante capacité à produire des molécules bioactives qui appartiennent aux dithiolopyrrolones, ayant de remarquables propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Lors de ce projet de thèse, l’identification du cluster de gènes de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis est envisagée. Suite au séquençage du génome de Sa. algeriensis, une approche génomique ou « genome mining » est suivie, cette approche a révélé un cluster thi potentiellement responsable de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis. Ce cluster contient 12 gènes, dont 8 gènes de biosynthèse, 3 gènes régulateurs et un gène transporteur. Les analyses in silico des gènes ont montré que la cystéine est le substrat d’une NRPS. Les analyses transcriptionelles ont montré que les trois gènes clés codent pour une NRPS, une thiorédoxine et une thioestérase qui pourraient être impliquées dans la biosynthèse des dithiolopyrrolones. Deux gènes actA et actB codant pour des acyltransférases putatives ont été identifiés. Les analyses transcriptionelles suggèrent qu’actA et actB pourraient être responsables de l’acylation de la pyrrothine. Finalement, la caractérisation de deux activités enzymatiques, acétyltransférase et benzoyltransférase, présentes dans l’extrait brut de Sa. algeriensis, ont permis de déterminer les paramètres optimaux (pH et T °C) de la réaction enzymatique. Enfin, les paramètres cinétiques de ces activités ont des valeurs complètements différentes, ce qui confirme la présence d’au moins deux activités différentes chez Sa. algeriensis. / Due to the emergence in the last decades of new and old infectious diseases to existing antibiotics, the research for new bioactive molecules which possess medical applications become a global occupation. Saccharothrix algeriensis, filamentous bacteria of actinomycetes order showed a surprising ability to produce bioactive molecules belongs to dithiolopyrrolones with remarkable properties of both antibiotics and anticancer. In this thesis, the identification of dithiolopyrrolones biosynthetic gene cluster in Sa. algeriensis was investigated. Through S. algeriensis genome sequencing, a genomics approach "genome mining" was followed, this approach has revealed a potentially thi cluster responsible for dithiolopyrrolones biosynthesis pathway in Sa algeriensis. This cluster contains 12 genes, including 8 biosynthesis genes, three regulatory genes and one transporter gene. The in silico analysis of this cluster showed that the cysteine is the substrate of the NRPS. The transcriptional analyzes showed that the three key genes which encode for NRPS, thioredoxin and thioesterase could be involved in dithiolopyrrolone biosyntheses. Two genes, actA and actB, encode for two putative acyltransferases were identified, the transcriptional analyzes suggests that these genes may be responsible for the acylation of pyrrothine core. The characterizations of two activities, acetyltransferase and benzoyltransferase, in the crude extract of Sa. algeriensis led the determination of the optimal parameters (pH and T °C) to detect these activities. Moreover, the effect of temperature and pH on these activities was determined. Finally, the kinetic parameters of these activities showed different values, which confirm the presence of, at least, two activities in Sa. algeriensis.

Lipases são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em ácidos graxos, mono e diacilgliceróis e glicerol. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas apenas quando estão adsorvidas a uma interface óleo-água. Lipases têm sido amplamente utilizadas em muitos processos industriais, tais como química orgânica, formulações de detergentes e de produtos como cosméticos e farmacêuticos. A principal preocupação na produção de enzimas comerciais é a proteção da sua estabilidade em solução aquosa. A água facilita ou medeia uma variedade de vias de degradação física e química, durante as etapas de purificação, transporte e armazenamento. Por conseguinte, formulações sólidas são desenvolvidas para alcançar uma vida útil aceitável para essas substâncias. Spray drying é comumente usado como uma técnica de desidratação na indústria farmacêutica para fabricação de produtos em pó diretamente do estado líquido. No presente trabalho, a purificação e caracterização bioquímica de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii, bem como os efeitos de adjuvantes no processo de secagem destas enzimas foram estudados. A lipase bruta foi purificada à homogeneidade através de cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. A lipase foi purificada 5,54 vezes, com rendimento de 9% e a atividade específica de 223,6 U/mg. O peso molecular da enzima foi estimado em 65,1 kDa por SDS-PAGE e 73,5 kDa utilizando cromatografia de gel filtração, indicando que provavelmente trata-se de um monômero. A lipase mostrou um pH ótimo em 4,6 e uma temperatura ótima de 35°C. Cerca de 80,2% de sua atividade foi mantida após incubação a 40°C durante 2 horas. A Vmax e Km foram 10,28 mmol/min/mg de proteína e 0,03240 mM, respectivamente, utilizando pNPP como substrato. As lipases presentes no extrato bruto e as lipases ligadas ao micélio foram caracterizadas para avaliar o potencial de utilização em biocatálise. A lipases no extrato bruto apresentaram atividade máxima a 60ºC e pH 6,2, enquanto que as lipases ligadas ao micélio apresentaram atividade máxima a 50ºC e pH 5,4. Nos estudos de efeito da temperatura sobre a atividade enzimática, as lipases no extrato bruto mantiveram-se estáveis a 50°C, com 85,3% de atividade residual após 2 horas de incubação. As lipases ligadas ao micélio mantiveram pelo menos 75,1% de atividade residual após 2 horas de incubação a 80°C. Estes resultados mostram que as lipases de C. kikuchii têm propriedades cinéticas e termoestabilidade desejáveis para aplicações em biocatálise. As lipases presentes no extrato bruto foram secas em spray dryer com diferentes adjuvantes, e sua estabilidade foi avaliada. A recuperação da atividade enzimática após a secagem, com a adição de 10% de lactose, -ciclodextrina, maltodextrina, manitol, goma arábica, e trealose variou de 63 a 100%. A atividade da enzima foi totalmente perdida durante a secagem do extrato bruto na ausência de adjuvantes. A maioria dos adjuvantes utilizados manteve pelo menos 50% da atividade enzimática a 5°C e 40% a 25°C, após 8 meses de armazenagem. As lipases secas com 10% de - ciclodextrina mantiveram 72% da atividade a 5°C no mesmo período. A partir destes resultados preliminares foi realizada a otimização do processo de secagem utilizando -ciclodextrina, maltodextrina e lactose como adjuvantes. A análise estatística dos resultados experimentais permitiu a determinação das condições ótimas para a retenção da atividade enzimática (RAE), a saber: concentração de adjuvantes de secagem de 12,05%, temperatura de entrada do gás de secagem em 153,6oC e vazão do extrato enzimático alimentado de 9,36 g/min, para - ciclodextrina e maltodextrina como adjuvantes. Para lactose, o estudo mostrou que o aumento da quantidade de adjuvante de secagem e/ou diminuindo a temperatura do gás de entrada tem um efeito positivo sobre a retenção da atividade enzimática do produto seco. Após o processo de purificação foi realizada a secagem da enzima parcialmente purificada e da lipase pura, com estes três adjuvantes. A manutenção da atividade enzimática variou 90,6-100% quando foram utilizadas as condições ótimas para cada adjuvante de secagem. Concluindo, as lipases produzidas por C. kikuchii podem ser eficientemente secas por spray dryer, uma vez que a atividade enzimática foi mantida no extrato bruto, na lipase pura e na lipase semi-purificada submetidas à secagem. / Lipases are enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols to fatty acids, mono and diacylglycerols, and glycerol. In contrast to esterases, lipases are activated only when they are adsorbed to an oilwater interface. They have been widely used in many industrial processes such as organic chemical, detergent and cleaning formulations and in products like cosmetics and pharmaceutical products. The main concern in the production of commercial enzymes is to protect their stability in aqueous solution. Water facilitates or mediates a variety of physical and chemical degradation pathways, active during protein purification, shipping and storage. Consequently, dry solid formulations are developed to achieve an acceptable protein shelf life. Spray drying is commonly used as a dehydration technique in the pharmaceutical industry for making powdery products directly from the liquid. In the present work, the purification and biochemical characterization of lipases produced by endophytic fungus Cercospora kikuchii as well as the effects of adjuvants on the spray drying process of theses enzymes were studied. The crude lipase was purified to homogeneity by hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. The lipase purified was 5.54-fold with 9% recovery and the specific activity was 223.6. The molecular mass of the lipase was estimated to be 65.1 kDa using SDS-PAGE and 73.5 using gel filtration chromatography, indicating that the lipase is a monomer. The lipase demonstrated an optimum pH at 4.6, an optimum temperature of 35°C. About 80.2% of its activity was retained after incubation at 40°C for 2 hours. The Vmax and Km were 10.28 mol/min/mg protein and 0.03240 mM, respectively, using pNPP as substrate. The lipases present in crude extract and the mycelium-bound lipases were characterized in order to evaluate the potential for use in biocatalysis. The crude extract showed maximum activity at 60ºC and pH 6.2 while the myceliumbound lipases showed maximum activity at 50ºC and pH 5.4. In tests of the temperature effect on the enzymatic activity, the lipases in the crude extract was stable at 50°C, with 85.3% residual activity after 2 hours of incubation. The mycelium-bound lipases maintained at least 75.1% of residual activity after 2 h incubation at 80°C. These results show that the lipases of C. kikuchii have kinetic properties and stability characteristics suitable to applications in biocatalysis. The lipases present in crude extract were spray dried with different adjuvants, and their stability was evaluated. The recovery of the enzyme after drying with 10% of lactose, -cyclodextrin, maltodextrin, mannitol, gum arabic, and trehalose ranged from 63% to 100%; but the enzyme activity was lost in the absence of adjuvants. Most of the adjuvants used kept up at least 50% of the enzymatic activity at 5°C and 40% at 25°C after 8 months. The lipase dried with 10% of -cyclodextrin retained 72% of activity at 5°C. From these preliminary results the optimization of drying process using -cyclodextrin, maltodextrin and lactose as adjuvants was carried out. Statistical optimization of the experimental results allowed the determination of the processing conditions that maximized the retention of the enzymatic activity (RAE), namely: concentration of drying adjuvants of 12.05 %, inlet temperature of the drying gas of 153.6oC, and flow rate of the enzymatic extract fed to the dryer of 9.36 g/min, for the b-cyclodextrin and maltodextrin as adjuvants. For lactose as adjuvant the study showed that increasing the amount of drying adjuvant and/or decreasing the inlet gas temperature has positive effect on the retention of enzymatic activity of the dried product. After the purification process was carried out the drying of the partially purified enzyme and pure lipase, using these three adjuvants. The retention of enzymatic activity ranged from 90.6 to 100% when was used the optimal conditions for each drying adjuvant. Concluding, the lipases produced by C. kikuchii may be efficiently spray dried since its activity enzimatic was retained in crude extract, pure lipase and in semi-purified lipase after drying.

A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.) possui um período de conservação pós-colheita de cerca de uma semana, que contrasta com o seu ciclo de cultivo, em torno de 10 meses. Os mecanismos de deterioração das raízes ainda não são conhecidos e tampouco foram estudadas as principais vias enzimáticas de degradação do amido, sua principal reserva energética. O objetivo deste trabalho foi de identificar e caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático dessas raízes, que possuem atividade amilolítica. Os resultados mostraram que as enzimas apresentam pH e temperatura ótimos de atividade enzimática em torno de 6,2 e 46°C, respectivamente, confirmados por Análise de Superfície de Resposta. Foram detectadas três bandas com atividade amilolítica em gel de poliacrilamida. Os valores de Ea, Km e Vmáx aparentes encontrados para o extrato enzimático foram de 7,53 kcal/mol, 0,41 mg/mol e 1,11 mg/mL/min, respectivamente. A hidrólise do amido aumenta 95% na presença de Ca+2 e a enzima mantém apenas cerca de 47% da sua atividade original na presença de EDTA. Os resultados mostraram a presença de duas possíveis isoformas de α-amilase e uma β-amilase no extrato enzimático in vitro, podendo estar ativas na raiz íntegra. Um ensaio de acompanhamento da atividade amilásica das raízes durante o armazenamento por 9 dias mostrou um aumento na atividade de água acompanhado de perda de textura e de oscilação na atividade hidrolítica. No entanto, tais alterações devem ocorrer também devido a ação de enzimas exógenas de mofos, que participam do processo de deterioração da mandioquinha-salsa. / Roots of Peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza Brancroft) have a post-harvest conservation time of approximately one-week, a very short period related to its long cultivation cycle, around 10-11 months. The mechanisms of post-harvest deterioration of the roots are unknown as well as the main enzymatic pathways such as the starch degradation, have not been studied. The purpose of this investigation was to identify and characterize the amylolitic activity of this root. The results showed that the optimum enzymatic conditions for the maximum activity are 46°C and pH 6.2 confirmed by Surface Ternary Plots. Three bands with amylolitic activity were detected in native PAGE. The kinetic values were Ea 7.53 kcal/mol, Km 0.41 mg/mol and Vmáx 1.11 mg/mL/min. The starch hydrolysis speed increases almost twice when Ca+2 is present and remained only 20% on the presence of EDT A. The results showed two possible isoforms of α-amylase and one β-amylase in the crude extract. An essay following the amylolitic activity during a 9-day storage period showed an increase of water activity associated to a loose of texture and a oscillating starch hydrolytic activity, although these behavior may have the contribution of exogenous enzymes from molds on the deteriorative process of the Peruvian carrots.