Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_liana_flores_maciel.pdf: 841596 bytes, checksum: bb4ee1890724891a9fe7618cd7fa3c77 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / The business related to equines in Brazil has an important participation in activities as leisure, culture and tourism, being responsible for millions of jobs. The equine distemper caused by Streptococcus equi subsp. equi is a disease of the respiratory tract with economical impact, generating losses with treatment and reduction in the animal performance. To solve this problem, prophylactic measures, such as the vaccination, are important. However, available commercial vaccines do not offer protection to more than 50% of the vaccinated animals. Several studies are being performed aiming the achievement of an efficient vaccine against the Adenitis, where several virulence factors are being evaluated as possible vaccine antigens, specially the M protein (SeM). Thus, the present work aimed the development and evaluation of a recombinant vaccine to the control of the equine distemper composed of the SeM antigen co-administrated with the recombinant Heat-labile enterotoxin B subunit of Escherichia coli (rLTB) and/or aluminium hydroxide (Al(OH)3). A total of 72 female BALB/c mice, divided into eight groups and 18 horses, divided into six groups, were inoculated by intramuscular or intranasal routes. The results obtained in the experiments showed that the rSeM was innocuous and immunogenic in both evaluated species, stimulating the production of specific immunoglobulin anti-rSeM without the addition of immunological adjuvant. Both adjuvant rLTB and Al(OH)3 were not capable to increase the titer of immunoglobulin anti-rSeM in mice, while in horses, the treatment rSeM + rLTB (IM) showed a significant increase in the level of seric immunoglobulin IgG anti-rSeM. Interestingly, the production of anti-rSeM secretory IgA in the upper respiratory tract has a significant increase in horses treated with rSeM + Al(OH)3 (IM). This result is promising to further studies with rSeM as an antigen for vaccines, as well as is the administration of rLTB as an immunological adjuvant. / A equinocultura no Brasil ganha espaço em setores ligados ao lazer, cultura e turismo, sendo responsável por milhões de empregos. A Adenite Equina causada pelo Streptococcus equi subsp. equi é uma doença do aparelho respiratório de elevado impacto econômico, gerando gastos com mão-de-obra e perda de desempenho dos animais. Para amenizar este problema, medidas profiláticas são importantes, como por exemplo, a vacinação. Porém, as vacinas disponíveis no mercado protegem apenas 50% dos animais. Vários estudos vêm sendo realizados para obtenção de uma vacina mais eficiente contra a Adenite, onde vários fatores de virulência do patógeno estão sendo avaliados como possíveis antígenos vacinais, com destaque para a proteína M de S. equi (SeM). Com base nisso este trabalho objetivou o desenvolvimento e avaliação de uma vacina recombinante para controle da Adenite Equina, utilizando como antígeno a rSeM e como adjuvantes a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) e ou hidróxido de alumínio (Al(OH)3). Para este estudo foram utilizados 72 camundongos Balb/c fêmeas divididos em 8 grupos e 18 cavalos divididos em 6 grupos, inoculados por via IM ou IN. Os resultados mostraram que a rSeM foi inócua e imunogênica para ambas as espécies avaliadas, estimulando níveis significativos de imunoglobulinas (lgs) anti-rSeM sem a necessidade de uso de qualquer adjuvante imunológico. Os adjuvantes rLTB e Al(OH)3 não foram capazes de incrementar significativamente os títulos de lgs antirSeM em camundongos, enquanto que em cavalos o tratamento rSeM + rLTB (IM) promoveu um aumento significativo no título sérico de IgG anti-rSeM. Interessantemente, a produção de IgA secretória anti-rSeM no trato respiratório superior de cavalos teve aumento significativo no tratamento com rSeM + Al(OH)3 (IM). Estes resultados são promissores para a continuidade de estudos visando a utilização da rSeM como antígeno vacinal. Da mesma forma, o uso da rLTB como adjuvante em vacinas para cavalos parece ser promissor.

Os vírus da Influenza Equina (EIV) (H3N8 e H7N7) pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A. Apesar de existirem poucos relatos de infecção humana pelo EIV, é conhecido o risco zoonótico e infecção interespécies. Serviços de vigilância epidemiológica da OIE e WHO informam que o subtipo H3N8 é isolado de surtos que ocorrem mundialmente, enquanto o subtipo H7N7, menos patogênico, não é isolado desde 1980, sendo então considerado um vírus extinto. Embora o EIV seja endêmico em nosso meio, há poucos trabalhos nacionais que tenham versado sobre a avaliação atual de anticorpos (Ac) anti-EIV presentes nos equídeos do Estado de São Paulo, o que motivou a realização do presente estudo. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a ação de diferentes tratamentos de soro descritos pela OIE e WHO para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação em soros de 10 equinos vacinados (H3N8 A/Equi/Kentucky/1/1997), sendo eles: a) TPH: tripsina, metaperiodato de potássio seguido de adsorção de hemácias; b) KH: kaolin 20% seguido de adsorção de hemácias; e c) RDEH: RDE seguido de adsorção de hemácias; 2) avaliar a presença de Ac contra os vírus H3N8 e H7N7, em 84 equídeos não vacinados do Estado de São Paulo; 3) comparar a frequência de Ac contra H3N8 entre equídeos amostrados do estado de SP e de um painel de soros de equídeos do município de Mossoró - RN, região onde não há estudos sobre a circulação do EIV. Constatou-se que não houve diferença estatística entre os tratamentos de soro para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação (p>0,05; confiança de 95%), todavia o tratamento RDEH apresentou resultados mais consistentes, corroborando a recomendação da OIE e da WHO de utilizar preferencialmente este tratamento. O perfil sorológico dos animais amostrados de SP sugere que circule o subtipo H3N8 e que o subtipo H7N7 circule de forma subclínica nos equídeos, o que é sustentado por outros trabalhos realizados no Brasil. Há evidências no Brasil sobre a detecção de anticorpos em equinos contra o subtipo H7N7, mesmo não havendo o isolamento deste no mundo desde 1980. No painel de soros do RN, onde a espécie Equus asinus era maioria, verificou-se a igualdade estatística entre as frequências de Equus caballus e Equus asinus positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 (p>0,05; confiança de 95%), dado inédito em nosso meio. A frequência dos equídeos positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 foi estatisticamente maior (p<0,05; confiança de 95%) em SP do que em RN. / The Equine influenza Virus (EIV) (H3N8 and H7N7) belong to Orthomyxoviridae family and Influenza A genus. Although there are few reports of human infection with EIV zoonotic and interspecies infection risk is known. OIE and WHO services on epidemiological surveillance report that H3N8 subtypes are isolated and characterized from worldwide outbreaks while H7N7 subtype less pathogenic has not being isolated since 1980 considered an extinct virus. Although the EIV is endemic in our country there are few national studies that had versed on the current evaluation of horses antibodies (Ab) from São Paulo State which motivated the present study. The study objectives were: 1) to evaluate the effects of different serum treatments described by OIE and WHO for the removal of nonspecific inhibitors of hemagglutination in 10 vaccinated (H3N8 - A/Equi/Kentucky/1/1997) horses sera being: a) TPH: trypsin, potassium metaperiodate followed by adsorption of erythrocytes b) KH: kaolin 20% followed by adsorption of erythrocytes and c) RDEH: RDE followed by adsorption of erythrocytes; 2) investigate the presence of antibodies against H3N8 and H7N7 viruses in 84 unvaccinated equines in São Paulo State; 3) compare the frequency of antibodies against H3N8 sampled between São Paulo State and a panel of equines sera from Mossoró - RN where there are no studies on EIV circulation. There was no statistical difference between the treatments for serum nonspecific inhibitors of hemagglutination removal (p>0.05; 95% confidence) however RDEH treatment showed results more consistent confirming OIE and WHO recommendation to use this treatment with priority. The serological profile of SP samples suggests H3N8 subtype circulates in those animals and H7N7 subtype might circulate in a subclinical form in equines, which is supported by other studies conducted in Brazil. There is evidence of antibodies detection against equine H7N7 subtype in Brazil, even without since 1980 isolation in the world. In animals from RN State which had Equus asinus representing a major fraction there was statistical equal frequencies of Equus caballus and Equus asinus positivity in HI test against H3N8 subtype (p>0.05; 95% of confidence), as unprecedented in the world. The frequency of positive equine against H3N8 subtype on HI test in SP was statistically higher (p<0.05; 95% of confidence) than in RN.

A influenza equina (EI) é uma enfermidade respiratória viral aguda que acomete equídeos de todas as idades. A doença é causada pelo vírus da influenza equina (EIV do inglês Equine Influenza Virus), que podem ser do subtipo viral H3N8 (antigo Equi-2), mundialmente distribuído, e o H7N7 (antigo Equi-1), considerado extinto desde 1980. Os EIVs pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A, possuem genoma RNA fita simples segmentado de senso negativo e são envelopados. A EI tem alta morbidade e baixa mortalidade leva a grandes perdas econômicas no ramo equestre. Os animais acometidos ficam impedidos de serem transportados ou de participarem de eventos equestres no Brasil. A rápida e fácil disseminação do EIV é bastante característico em surtos de EI. Surtos de EI foram descritos em 2012 em diversos países, incluindo o Brasil. Em 2015, um surto de EIV ocorreu em um Hospital Veterinário na cidade de São Paulo-SP. Os objetivos do presente trabalho foram: a) obter isolados do vírus da influenza equina de surtos recentes do estado de São Paulo, Brasil; b) realizar o sequenciamento dos EIVs isolados; c) promover a análise filogenética e evolutiva desses EIVs. Foram isolados 12 EIVs de um surto de EI em um hospital veterinário na cidade de São Paulo em 2015. Promoveu-se o sequenciamento dos oito genes virais dos isolados de 2015 e de uma estirpe de EIV de um surto brasileiro de 2012, e da hemaglutinina de outras duas estirpes do mesmo surto de 2012. Os vírus do surto de 2012 foram cedidos pelo Laboratório de Raiva e Encefalites Virais do Instituto Biológico de São Paulo para as análises. O sequenciamento dos genes HA e NA indicaram que os EIVs de 2012 e 2015 brasileiros são do subtipo H3N8 e pertencem à sublinhagem Flórida 1 e tiveram maiores identidades com os vírus de 2012 da América do Sul, Estados Unidos e Dubai de 2012. Os vírus de 2015 formaram um clado separado dos demais EIV Flórida 1, tanto na análise filogenética quanto na análise de relógio molecular. As análises de mutações de nucleotídeos e aminoácidos, associados à análise de perfil de hidrofobicidade sugerem mudanças em estruturas antigênicas que poderiam acarretar no maior distanciamento em relação à estirpe vacinal A/equine/South Africa/4/03. / The equine influenza (EI) is a viral acute respiratory disease that can affect equines of any age. The disease is caused by the equine influenza virus (EIV) and has two different subtypes H3N8 (formerly Equi-2) that occurs worldwide and H7N7 (formerly Equi-1), considered extinct since 1980. EIVs belong to the Orthomyxoviridae family, Influenza A genus, are enveloped and has negative segmented single strand RNA genome. EI causes high morbidity and low mortality and drives to high economic losses in equestrian industry. In Brazil, the transport and participation in equestrian events are not allowed when horses have EIV. The quickly spread pattern is easily seen in EIV outbreaks. EI outbreaks occurred in 2012 in several countries, including Brazil. In 2015, an outbreak occurred in a Veterinarian Hospital in São Paulo-SP. The objectives of the present study were: a) to obtain isolates of equine influenza virus from recent outbreaks in the State of São Paulo, Brazil; b) to promote the sequencing of these EIVs; c) to perform the phylogenetic and evolutive analysis of these EIVs. Twelve EIVs were isolated from an outbreak in a veterinarian hospital in the State of São Paulo in 2015. The eight viral genes were sequenced from EIVs of 2015 and from one EIV of a Brazilian outbreak, 2012. Also, the HA gene from two other EIVs from the same 2012-outbreak were sequenced. The viruses from the 2012-outbreak were from the Laboratory of Rabies and Viral Encephalitis, Instituto Biológico de São Paulo. Sequencing on HA and NA genes indicates that the Brazilian 2012 and 2015 EIVs are H3N8 subtype, belong to the Florida 1 sublineage and were more identical to the 2012 EIVs from South America, United States and Dubai. In the phylogenetic tree and the molecular clock the EIVs from 2015 grouped in a cluster that was separeted from other Florida 1 EIVs. The nucleotide, amino acid and hydrophobicity analysis suggest changes in antigenic structures that could lead to differences from the vaccine strain A/equine/South Africa/4/03.

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando estabelecer um modelo murino de infecção pelo EHV-1 para investigar a resposta do hospedeiro frente à infecção viral e as alterações neurológicas causadas por esse agente. Camundongos das linhagens BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- e C57BL/6 CD8-/- foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72, A9/92 e A3/97 do EHV-1. Neste estudo, associou-se a histopatologia, a imunoistoquímica e o método de transcrição reversa seguida pela PCR quantitativa em tempo real para investigar a relação entre a infecção pelo vírus com o desenvolvimento de lesões e a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, descarga nasal e ocular, dispnéia, desidratação e sialorréia apareceram entre o 2º e 3º dpi. Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. O vírus foi consistentemente isolado do SNC, pulmões, fígado, baço e timo de todos os camundongos com sinais neurológicos. As alterações histopatológicas consistiram de leptomeningite, hemorragia focal, ventriculite, degeneração e necrose neuronal, neuronofagia, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. A análise imunoistoquímica demonstrou que as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 replicaram-se nos neurônicos do bulbo olfatório, cortex cerebral e no hipocampo. Ao contrário, os camundongos inoculados com a estirpe A3/97 do EHV-1 não apresentaram perda de peso ou quaisquer sinais clínicos ou neurológicos; entretanto, o vírus foi isolado dos pulmões no 3º dpi. As estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 apresentaram tropismo pelo tecido nervoso com capacidade de neuroinvasão e neurovirulência. A estirpe A3/97 do EHV-1 não foi neurovirulenta, apesar de ter sido reisolada do SNC de camundongos BALB/c nude infectados. Detectou-se aumento da expressão de mRNA para TNF-&alpha;, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 com 2 e 3 dpi; entretanto, não houve expressão de mRNA para IFN-&gamma;. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6, que apresentam predominantemente resposta do tipo Th1, mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-&alpha;, IL-6 e CCL2, quando comparados com os BALB/c. A gravidade dos sinais observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico destas citocinas pró-inflamatórias (TNF-&alpha; e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis a infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1 e poderiam servir como modelo para o estudo da patogênese e dos mecanismos que contribuem no desenvolvimento da mieloencefalopatia herpética equina. / Equid herpesvirus type 1 (EHV-1) is a major pathogen which causes respiratory disease, abortions and neurological disorders in horses. The present study was carried out to establish a murine model of EHV-1 infection and investigate host response against the virus and neurological disorders caused by this pathogen. BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- and C57BL/6 CD8-/- mice were intranasally inoculated with EHV-1 A4/72, A9/92 and A3/97 Brazilian strains. In this study, we combined histopathology, immunohistochemistry, and a quantitative real-time RT-PCR method to investigate the relationship between virus infection and the development of lesions and cytokine responses in the CNS of different strains of mice. Intranasal inoculation of EHV-1 A4/72 and A9/92 induced acute and lethal meningoencephalitis in mice. Clinical and neurological signs appeared between the 2nd and 3rd dpi and included weight loss, ruffled fur, a hunched posture, crouching in corners, nasal and ocular discharges, dyspnoea, dehydration and increased salivation. These signs were followed by increased reactivity to external stimulation, seizures, recumbency and death. The virus was consistently recovered from the CNS and visceral organs of all mice with neurological symptoms. Histopathological changes consisted of leptomeningitis, focal hemorrhage, ventriculitis, neuronal degeneration and necrosis, neuronophagia, non-suppurative inflammation, multi-focal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. Immunohistochemical examination demonstrated that EHV-1 strains A4/72 and A9/92 replicated in neurons of the olfactory bulb, cortical regions and hippocampus. In contrast, mice inoculated with the EHV-1 strain A3/97 showed neither weight loss nor apparent clinical or neurological signs of the disease; however, the virus was recovered from their lungs at 3 dpi. While EHV-1 strains A4/72 and A9/92 exhibited a high degree of tropism for the CNS with robust neuroinvasiveness and neurovirulence, the EHV-1 strain A3/97 was not neurovirulent despite being detected in the CNS of infected BALB/c nude mice. Increased mRNA levels of TNF-&alpha;, IL-6 and CCL2 were detected in the nervous tissue of EHV-1 infected mice at 2 and 3 dpi; however, IFN-&gamma; mRNA was not consistently expressed. Mice with the background C57BL/6, which exhibit predominantly Th1-type responses, showed the highest levels of TNF-&alpha;, IL-6 and CCL-2 mRNA in the CNS, when compared to BALB/c mice. The severity of signs observed in infected mice could be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-&alpha; and IL-6) and the chemokine CCL2, which are produced early after viral infection by both cells infiltrating into the CNS from the periphery and/or glial resident cells. These findings indicate that several inbred mouse strains are susceptible to neuopathogenic EHV-1 strains and should be useful models for studying the pathogenesis and mechanisms contributing to equine herpes myeloencephalopathy in horses.

Com o objetivo de avaliar os equinos alojados no Jóquei Clube de São Paulo, Brasil, quanto a presença de anticorpos contra Theileria equi e Babesia caballi, foram testadas 180 amostras de soro sanguíneo por meio da técnica de C-ELISA (Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), metodologia atualmente recomendada pela OIE (Organização Internacional de Epizootíases) por ter alta sensibilidade e especificidade. A frequência de animais com sorologia positiva para Theileria equi foi de 6,66% (12/180), para Babesia caballi foi de 22,3% (40/180) e para infecção concomitante foi de 6,66% (12/180). Os resultados sorológicos obtidos por este estudo revelam que 35,5% (64/180) dos animais possuem anticorpos contra a babesiose equina sendo que a maioria dos animais acometidos tem dois e três anos de idade e portanto estão há menos tempo no hipódromo. Fatores como a ausência de carrapatos vetores, o uso de terapias babesicidas repetidas e o longo tempo de permanência dos animais no Jóquei após o tratamento, favorecem a diminuição dos títulos de anticorpos sem que ocorra reinfecção. Esses fatores podem justificar o menor número de animais com sorologia positiva para a doença nos cavalos com idade acima de quatro anos. Considerando-se esses resultados sugere-se que os animais sejam avaliados sorologicamente ao ingressarem no Jóquei Clube de São Paulo para que o uso de medicamentos contra a doença seja feito de forma adequada e para que os sinais clínicos compatíveis com babesiose equina em animais sorologicamente negativos sejam melhor avaliados e considerados em diagnósticos diferenciais. / In order to evaluate the presence of antibodies against Theileria equi and Babesia caballi in horses kept at the Jockey Club in São Paulo city, Brazil, a total of 180 samples of blood serum was tested using the Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (C-ELISA test). This methodology has been recommended by the International Organization of Epizooties (IOE) due to its high sensitivity and specificity. The frequency of seropositive animals for Theileria equi, Babesia caballi and for both was 6.66% (12/180), 22.3% (40/180) and 6.66% (12/180), respectively. Serological results showed that 35.5% of the animals (64/180) had antibodies against equine piroplasmosis; they were from two to three years old and were at the Jockey Club for a shorter period of time. Factors such as absence of thick vectors, repeated therapy using babesicidal drugs and the long period of time that the animals stayed in the Jockey Club after treatment favoured the lowering of antibody titers with no reinfection. These factors might be responsible for the fewer number of animals with positive serology for the disease in horses over four years of age. Based on these findings, animals should be serologically evaluated at the time of entrance into the Jockey Club so that the use of drugs against the disease be performed properly and clinical signs suggestive of equine babesiosis in serologically negative animals be better evaluated and considered for differential diagnosis.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-06-07T14:31:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-08T13:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T13:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A theileriose, doença endêmica no Brasil, é uma piroplasmose causada pelo protozoário intraeritrocitário, Theileria equi. Provoca perdas associadas tanto a fatores clínicos como a restrição ao trânsito de animais soropositivos. A transmissão de T. equi ocorre principalmente no repasto do carrapato, o qual inocula suas formas infectantes (esporozoítos) nos equídeos, que são os hospedeiros vertebrados. O diagnóstico e a prevenção desta enfermidade se fazem necessários em áreas endêmicas e não endêmicas devido à disseminação dos vetores e do protozoário e de sua alta prevalência. Diferentes plataformas de ELISAs têm sido desenvolvidas com a utilização de antígenos recombinantes. A proteína de superfície de merozoíto EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana do eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos reconhecidos pelo sistema imune. O objetivo desse estudo foi avaliar a proteína EMA-2 de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico. Após expressão da glicoproteína EMA-2 foi desenvolvido um ELISA indireto. O ELISA demonstrou sensibilidade de 90,9% e especificidade de 83,3% quando comparado ao kit comercial de cELISA. A proteína também demonstrou imunogenicidade ao testarmos soros de camundongos imunizados com EMA-2 recombinante, por imunofluorescência. Sendo a proteína EMA-2 antigênica e imunogênica, poderá ser usada, além dos testes de diagnóstico, como antígeno para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. / Theileriosis, endemic disease in Brazil, is a piroplasmosis caused by intra-erythrocytic protozoan, Theileria equi. Causes losses associated with both clinical factors and restriction on the movement of positive animals. Transmission of T. equi occurs mainly during tick feeding which inoculates their infective forms (sporozoites) in horses, which are the vertebrate hosts. The diagnosis and prevention of this disease is needed in endemic and non endemic areas due to the presence of vectors and protozoa. Different ELISAs platforms have been developed using recombinant antigens. EMA-2 is released into the cytoplasm and erythrocyte membrane, suggesting that one of the first antigens recognized by the immune system. The aim of this study was to evaluate the EMA-2 protein of Theileria equi, expressed in Pichia pastoris, as immunobiological. After expression of EMA-2 glycoprotein, an indirect ELISA was developed. The ELISA demonstrated sensitivity of 90.9% and specificity of 83.3% when compared to the commercial kit cELISA. The protein also showed immunogenicity when test the sera of immunized mice with recombinant EMA-2 by immunofluorescence. As the EMA-2 protein antigenic and immunogenic, it may be used diagnostic tests as well as a promising antigen for the development of subunit vaccines.

Os vírus da Influenza Equina (EIV) (H3N8 e H7N7) pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A. Apesar de existirem poucos relatos de infecção humana pelo EIV, é conhecido o risco zoonótico e infecção interespécies. Serviços de vigilância epidemiológica da OIE e WHO informam que o subtipo H3N8 é isolado de surtos que ocorrem mundialmente, enquanto o subtipo H7N7, menos patogênico, não é isolado desde 1980, sendo então considerado um vírus extinto. Embora o EIV seja endêmico em nosso meio, há poucos trabalhos nacionais que tenham versado sobre a avaliação atual de anticorpos (Ac) anti-EIV presentes nos equídeos do Estado de São Paulo, o que motivou a realização do presente estudo. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a ação de diferentes tratamentos de soro descritos pela OIE e WHO para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação em soros de 10 equinos vacinados (H3N8 A/Equi/Kentucky/1/1997), sendo eles: a) TPH: tripsina, metaperiodato de potássio seguido de adsorção de hemácias; b) KH: kaolin 20% seguido de adsorção de hemácias; e c) RDEH: RDE seguido de adsorção de hemácias; 2) avaliar a presença de Ac contra os vírus H3N8 e H7N7, em 84 equídeos não vacinados do Estado de São Paulo; 3) comparar a frequência de Ac contra H3N8 entre equídeos amostrados do estado de SP e de um painel de soros de equídeos do município de Mossoró - RN, região onde não há estudos sobre a circulação do EIV. Constatou-se que não houve diferença estatística entre os tratamentos de soro para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação (p>0,05; confiança de 95%), todavia o tratamento RDEH apresentou resultados mais consistentes, corroborando a recomendação da OIE e da WHO de utilizar preferencialmente este tratamento. O perfil sorológico dos animais amostrados de SP sugere que circule o subtipo H3N8 e que o subtipo H7N7 circule de forma subclínica nos equídeos, o que é sustentado por outros trabalhos realizados no Brasil. Há evidências no Brasil sobre a detecção de anticorpos em equinos contra o subtipo H7N7, mesmo não havendo o isolamento deste no mundo desde 1980. No painel de soros do RN, onde a espécie Equus asinus era maioria, verificou-se a igualdade estatística entre as frequências de Equus caballus e Equus asinus positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 (p>0,05; confiança de 95%), dado inédito em nosso meio. A frequência dos equídeos positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 foi estatisticamente maior (p<0,05; confiança de 95%) em SP do que em RN. / The Equine influenza Virus (EIV) (H3N8 and H7N7) belong to Orthomyxoviridae family and Influenza A genus. Although there are few reports of human infection with EIV zoonotic and interspecies infection risk is known. OIE and WHO services on epidemiological surveillance report that H3N8 subtypes are isolated and characterized from worldwide outbreaks while H7N7 subtype less pathogenic has not being isolated since 1980 considered an extinct virus. Although the EIV is endemic in our country there are few national studies that had versed on the current evaluation of horses antibodies (Ab) from São Paulo State which motivated the present study. The study objectives were: 1) to evaluate the effects of different serum treatments described by OIE and WHO for the removal of nonspecific inhibitors of hemagglutination in 10 vaccinated (H3N8 - A/Equi/Kentucky/1/1997) horses sera being: a) TPH: trypsin, potassium metaperiodate followed by adsorption of erythrocytes b) KH: kaolin 20% followed by adsorption of erythrocytes and c) RDEH: RDE followed by adsorption of erythrocytes; 2) investigate the presence of antibodies against H3N8 and H7N7 viruses in 84 unvaccinated equines in São Paulo State; 3) compare the frequency of antibodies against H3N8 sampled between São Paulo State and a panel of equines sera from Mossoró - RN where there are no studies on EIV circulation. There was no statistical difference between the treatments for serum nonspecific inhibitors of hemagglutination removal (p>0.05; 95% confidence) however RDEH treatment showed results more consistent confirming OIE and WHO recommendation to use this treatment with priority. The serological profile of SP samples suggests H3N8 subtype circulates in those animals and H7N7 subtype might circulate in a subclinical form in equines, which is supported by other studies conducted in Brazil. There is evidence of antibodies detection against equine H7N7 subtype in Brazil, even without since 1980 isolation in the world. In animals from RN State which had Equus asinus representing a major fraction there was statistical equal frequencies of Equus caballus and Equus asinus positivity in HI test against H3N8 subtype (p>0.05; 95% of confidence), as unprecedented in the world. The frequency of positive equine against H3N8 subtype on HI test in SP was statistically higher (p<0.05; 95% of confidence) than in RN.

O herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) é um importante patógeno que causa doença respiratória, abortamento e desordens neurológicas em equinos. O presente estudo foi realizado visando estabelecer um modelo murino de infecção pelo EHV-1 para investigar a resposta do hospedeiro frente à infecção viral e as alterações neurológicas causadas por esse agente. Camundongos das linhagens BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- e C57BL/6 CD8-/- foram inoculados por via intranasal com as estirpes brasileiras A4/72, A9/92 e A3/97 do EHV-1. Neste estudo, associou-se a histopatologia, a imunoistoquímica e o método de transcrição reversa seguida pela PCR quantitativa em tempo real para investigar a relação entre a infecção pelo vírus com o desenvolvimento de lesões e a resposta de citocinas pró-inflamatórias no SNC de camundongos das diferentes linhagens. As estirpes brasileiras A4/72 e A9/92 do EHV-1 causaram infecção aguda e letal nas diferentes linhagens de camundongos isogênicos. Os sinais clínicos e neurológicos, tais como perda de peso, pelos arrepiados, postura arqueada, apatia, descarga nasal e ocular, dispnéia, desidratação e sialorréia apareceram entre o 2º e 3º dpi. Essas manifestações foram acompanhadas pelo aumento da sensibilidade a estímulos externos, convulsões, recumbência e morte. O vírus foi consistentemente isolado do SNC, pulmões, fígado, baço e timo de todos os camundongos com sinais neurológicos. As alterações histopatológicas consistiram de leptomeningite, hemorragia focal, ventriculite, degeneração e necrose neuronal, neuronofagia, inflamação não supurativa, gliose multifocal e infiltração perivascular de células polimorfonucleares e mononucleares. A análise imunoistoquímica demonstrou que as estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 replicaram-se nos neurônicos do bulbo olfatório, cortex cerebral e no hipocampo. Ao contrário, os camundongos inoculados com a estirpe A3/97 do EHV-1 não apresentaram perda de peso ou quaisquer sinais clínicos ou neurológicos; entretanto, o vírus foi isolado dos pulmões no 3º dpi. As estirpes A4/72 e A9/92 do EHV-1 apresentaram tropismo pelo tecido nervoso com capacidade de neuroinvasão e neurovirulência. A estirpe A3/97 do EHV-1 não foi neurovirulenta, apesar de ter sido reisolada do SNC de camundongos BALB/c nude infectados. Detectou-se aumento da expressão de mRNA para TNF-&alpha;, IL-6 e CCL2 no SNC dos camundongos infectados pelo EHV-1 com 2 e 3 dpi; entretanto, não houve expressão de mRNA para IFN-&gamma;. Os camundongos com o fundo genético C57BL/6, que apresentam predominantemente resposta do tipo Th1, mostraram níveis mais altos de expressão de mRNA para TNF-&alpha;, IL-6 e CCL2, quando comparados com os BALB/c. A gravidade dos sinais observados em camundongos infectados pode ser correlacionada com o pico destas citocinas pró-inflamatórias (TNF-&alpha; e IL-6) e da quimiocina CCL2, que são produzidas logo após a infecção viral por células residentes da glia e/ou infiltrativas no SNC. Esses achados indicam que as diferentes linhagens de camundongos isogênicos são susceptíveis a infecção por estirpes neuropatogênicas do EHV-1 e poderiam servir como modelo para o estudo da patogênese e dos mecanismos que contribuem no desenvolvimento da mieloencefalopatia herpética equina. / Equid herpesvirus type 1 (EHV-1) is a major pathogen which causes respiratory disease, abortions and neurological disorders in horses. The present study was carried out to establish a murine model of EHV-1 infection and investigate host response against the virus and neurological disorders caused by this pathogen. BALB/c, BALB/c nude, C3H/HeJ, C57BL/6, C57BL/6 CD4-/- and C57BL/6 CD8-/- mice were intranasally inoculated with EHV-1 A4/72, A9/92 and A3/97 Brazilian strains. In this study, we combined histopathology, immunohistochemistry, and a quantitative real-time RT-PCR method to investigate the relationship between virus infection and the development of lesions and cytokine responses in the CNS of different strains of mice. Intranasal inoculation of EHV-1 A4/72 and A9/92 induced acute and lethal meningoencephalitis in mice. Clinical and neurological signs appeared between the 2nd and 3rd dpi and included weight loss, ruffled fur, a hunched posture, crouching in corners, nasal and ocular discharges, dyspnoea, dehydration and increased salivation. These signs were followed by increased reactivity to external stimulation, seizures, recumbency and death. The virus was consistently recovered from the CNS and visceral organs of all mice with neurological symptoms. Histopathological changes consisted of leptomeningitis, focal hemorrhage, ventriculitis, neuronal degeneration and necrosis, neuronophagia, non-suppurative inflammation, multi-focal gliosis and perivascular infiltration of polymorphonuclear and mononuclear cells. Immunohistochemical examination demonstrated that EHV-1 strains A4/72 and A9/92 replicated in neurons of the olfactory bulb, cortical regions and hippocampus. In contrast, mice inoculated with the EHV-1 strain A3/97 showed neither weight loss nor apparent clinical or neurological signs of the disease; however, the virus was recovered from their lungs at 3 dpi. While EHV-1 strains A4/72 and A9/92 exhibited a high degree of tropism for the CNS with robust neuroinvasiveness and neurovirulence, the EHV-1 strain A3/97 was not neurovirulent despite being detected in the CNS of infected BALB/c nude mice. Increased mRNA levels of TNF-&alpha;, IL-6 and CCL2 were detected in the nervous tissue of EHV-1 infected mice at 2 and 3 dpi; however, IFN-&gamma; mRNA was not consistently expressed. Mice with the background C57BL/6, which exhibit predominantly Th1-type responses, showed the highest levels of TNF-&alpha;, IL-6 and CCL-2 mRNA in the CNS, when compared to BALB/c mice. The severity of signs observed in infected mice could be correlated with the peak of these proinflammatory cytokines (TNF-&alpha; and IL-6) and the chemokine CCL2, which are produced early after viral infection by both cells infiltrating into the CNS from the periphery and/or glial resident cells. These findings indicate that several inbred mouse strains are susceptible to neuopathogenic EHV-1 strains and should be useful models for studying the pathogenesis and mechanisms contributing to equine herpes myeloencephalopathy in horses.

A influenza equina (EI) é uma enfermidade respiratória viral aguda que acomete equídeos de todas as idades. A doença é causada pelo vírus da influenza equina (EIV do inglês Equine Influenza Virus), que podem ser do subtipo viral H3N8 (antigo Equi-2), mundialmente distribuído, e o H7N7 (antigo Equi-1), considerado extinto desde 1980. Os EIVs pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A, possuem genoma RNA fita simples segmentado de senso negativo e são envelopados. A EI tem alta morbidade e baixa mortalidade leva a grandes perdas econômicas no ramo equestre. Os animais acometidos ficam impedidos de serem transportados ou de participarem de eventos equestres no Brasil. A rápida e fácil disseminação do EIV é bastante característico em surtos de EI. Surtos de EI foram descritos em 2012 em diversos países, incluindo o Brasil. Em 2015, um surto de EIV ocorreu em um Hospital Veterinário na cidade de São Paulo-SP. Os objetivos do presente trabalho foram: a) obter isolados do vírus da influenza equina de surtos recentes do estado de São Paulo, Brasil; b) realizar o sequenciamento dos EIVs isolados; c) promover a análise filogenética e evolutiva desses EIVs. Foram isolados 12 EIVs de um surto de EI em um hospital veterinário na cidade de São Paulo em 2015. Promoveu-se o sequenciamento dos oito genes virais dos isolados de 2015 e de uma estirpe de EIV de um surto brasileiro de 2012, e da hemaglutinina de outras duas estirpes do mesmo surto de 2012. Os vírus do surto de 2012 foram cedidos pelo Laboratório de Raiva e Encefalites Virais do Instituto Biológico de São Paulo para as análises. O sequenciamento dos genes HA e NA indicaram que os EIVs de 2012 e 2015 brasileiros são do subtipo H3N8 e pertencem à sublinhagem Flórida 1 e tiveram maiores identidades com os vírus de 2012 da América do Sul, Estados Unidos e Dubai de 2012. Os vírus de 2015 formaram um clado separado dos demais EIV Flórida 1, tanto na análise filogenética quanto na análise de relógio molecular. As análises de mutações de nucleotídeos e aminoácidos, associados à análise de perfil de hidrofobicidade sugerem mudanças em estruturas antigênicas que poderiam acarretar no maior distanciamento em relação à estirpe vacinal A/equine/South Africa/4/03. / The equine influenza (EI) is a viral acute respiratory disease that can affect equines of any age. The disease is caused by the equine influenza virus (EIV) and has two different subtypes H3N8 (formerly Equi-2) that occurs worldwide and H7N7 (formerly Equi-1), considered extinct since 1980. EIVs belong to the Orthomyxoviridae family, Influenza A genus, are enveloped and has negative segmented single strand RNA genome. EI causes high morbidity and low mortality and drives to high economic losses in equestrian industry. In Brazil, the transport and participation in equestrian events are not allowed when horses have EIV. The quickly spread pattern is easily seen in EIV outbreaks. EI outbreaks occurred in 2012 in several countries, including Brazil. In 2015, an outbreak occurred in a Veterinarian Hospital in São Paulo-SP. The objectives of the present study were: a) to obtain isolates of equine influenza virus from recent outbreaks in the State of São Paulo, Brazil; b) to promote the sequencing of these EIVs; c) to perform the phylogenetic and evolutive analysis of these EIVs. Twelve EIVs were isolated from an outbreak in a veterinarian hospital in the State of São Paulo in 2015. The eight viral genes were sequenced from EIVs of 2015 and from one EIV of a Brazilian outbreak, 2012. Also, the HA gene from two other EIVs from the same 2012-outbreak were sequenced. The viruses from the 2012-outbreak were from the Laboratory of Rabies and Viral Encephalitis, Instituto Biológico de São Paulo. Sequencing on HA and NA genes indicates that the Brazilian 2012 and 2015 EIVs are H3N8 subtype, belong to the Florida 1 sublineage and were more identical to the 2012 EIVs from South America, United States and Dubai. In the phylogenetic tree and the molecular clock the EIVs from 2015 grouped in a cluster that was separeted from other Florida 1 EIVs. The nucleotide, amino acid and hydrophobicity analysis suggest changes in antigenic structures that could lead to differences from the vaccine strain A/equine/South Africa/4/03.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-09-28T14:27:47Z No. of bitstreams: 1 2011 - Erica Cristina Rocha Roier.pdf: 982721 bytes, checksum: 24c0654d64de8a5b21a0eea5376f828c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T14:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Erica Cristina Rocha Roier.pdf: 982721 bytes, checksum: 24c0654d64de8a5b21a0eea5376f828c (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / This study aimed to evaluate the prevalence of antibodies against Neorickettsia risticii in horses in the microregion of Itagua? RJ, show possible associated factors and identify the agent by molecular techniques. The study was conducted in the districts of Serop?dica, Itagua? and Mangaratiba, Rio de Janeiro. The 350 blood samples were obtained by convenience from horse properties belonging to the region. Serologic testing was performed by Immunofluorescence Assay (IFAI) for N. risticii, being considered positive samples titer 1:50. To evaluate risk factors associated with the presence of antibodies to N. risticii an epidemiological questionnaire was applied to the owners or guardians of animals, which aimed especially farm characteristics and management of animals. Hematological and clinical evaluation was performed for all animals. Molecular analysis by a Real Time PCR was performed from leukocyte cover. The prevalence of antibodies anti-N.risticii in horses of the region of Itagua? was 26.3% (92/350). The frequencies of IgG anti-N.rristicii were 52.2% (48/92) for titers of 1:50, zero for titers of 1:100, 13% (12/92) for titles of 1:200, 28.3% (26/92) for evidence of 1:400 and 6.5% (6 / 92) for titles of 1:800. The age and quality level of the properties were associated (p <0.05) with horses seropositivity for N. risticii. DNA from N. risticii was not detectable in samples of this study. Also no significant changes in the clinical evaluation of animals was found in relation to seropositivity for the agent. Despite showing association (p <0.05) between the seropositivity of the animals and changes in white blood cell of negative animals, these changes were not outside reference limits for the species evaluated. The existence of horses seropositive for N. risticii indicates the presence of this agent in the microregion of Itagua?. / O presente estudo teve por objetivo avaliar a preval?ncia de anticorpos contra Neorickettsia risticii em equinos na microrregi?o de Itagua?-RJ, demonstrar os poss?veis fatores associados e identificar o agente atrav?s de t?cnicas moleculares. O estudo foi conduzido nos munic?pios de Serop?dica, Itagua? e Mangaratiba, estado do Rio de Janeiro. As 350 amostras de sangue foram obtidas por conveni?ncia, das propriedades de cria??o de equinos pertencentes ? regi?o. O teste sorol?gico foi realizado atrav?s da Rea??o de Imunofluoresc?ncia Indireta (RIFI) para N. risticii, sendo consideradas positivas amostras com t?tulo 1:50. Para avalia??o dos fatores de risco associados ? presen?a de anticorpos de N. risticii, aplicou-se um question?rio epidemiol?gico com os propriet?rios e/ou respons?veis dos animais, destacando caracter?sticas da propriedade e manejo dos animais. Realizou-se hemograma e avalia??o cl?nica de todos os animais. As an?lises moleculares atrav?s da t?cnica de Real Time PCR foram realizadas a partir de capa leucocit?ria. A preval?ncia de anticorpos anti-N. risticii em equinos da microrregi?o de Itagua? foi de 26,3% (92/350) pela RIFI. As frequ?ncias de anticorpos IgG anti-N. risticii foram 52,2% (48/92) para titula??es de 1:50, zero para titula??es de 1:100, 13% (12/92) para t?tulos de 1:200, 28,3% (26/92) para t?tulos de 1:400 e 6,5% (6/92) para t?tulos de 1:800. A idade e o n?vel de qualidade das propriedades apresentaram associa??o (p<0,05) com a soropositividade dos equinos para N. risticii. N?o foi detectado o DNA de N. risticii nas amostras do presente estudo. Tamb?m n?o foram evidenciadas altera??es significativas na avalia??o clinica dos animais, em rela??o ? soropositividade para o agente. Apesar de haver associa??o (p<0,05) entre a soropositividade dos animais e altera??es no leucograma dos animais negativos, estas altera??es n?o estiveram fora dos limites de refer?ncia para a esp?cie animal avaliada. A exist?ncia de equinos soropositivos para N. risticii indica a circula??o desse agente na microrregi?o de Itagua?