En la enfermedad por hígado graso no alcohólico (NAFLD), la alteración en el metabolismo de lípidos, estrés oxidativo y alteración en la producción de citocinas en un hígado graso causan inflamación y fibrosis hepáticas.La obesidad y diabetes se asocian a cambios histológicos desde esteatosis simple hasta necroinflamación y fibrosis (esteatohepatitis no alcohólica o NASH), una de las manifestaciones de NAFLD. La NASH es precursora de cirrosis. La prevalencia de NAFLD y NASH es de 20 y 2-3%, respectivamente. En la actualidad no se ha destacado la efectividad de un tratamiento en particular. Sin embargo, el conocimiento de su fisiopatología (resistencia a la insulina, seguida de una lipoperoxidación hepática con afectación del parénquima) sugiere el uso de hipoglucemiantes y antioxidantes, además de la pérdida de peso. La obesidad y resistencia a la insulina, mediada por TNF-α, aumentan la liberación de ácidos grasos libres (FFA) de los adipocitos, aumentando su concentración en hígado. Los FFA inducen estrés oxidativo y favorecen la lipoperoxidación, estimulando la expresión de TNF- α en hepatocitos y adipocitos e induciendo así la resistencia a la insulina y fibrogénesis. No existen modelos animales que definan los cambios moleculares y fisiológicos en la transición entre esteatosis y esteatohepatitis debido a la falta de un modelo que presente todas las características clave de la NAFLD. Los modelos de animales para NASH han identificado la deficiencia de leptina y estrés oxidativo como los principales factores patogénicos de la esteatosis y esteatohepatitis. Los modelos más ilustrativos de esteatohepatitis se fundamentan en la hipótesis del "hit" múltiple, que sugiere que el hígado graso es especialmente vulnerable a oxidantes y a desarrollar esteatohepatitis cuando factores agresores generan suficientes oxidantes como para causar muerte de hepatocitos e inflamación. Así, la esteatohepatitis incrementa la sensibilidad a otros factores agresores que inducen fibrosis hepática, promoviendo la evolución hacia cirrosis. El modelo inducido por dieta deficiente en colina y metionina (DCM) destaca la importancia del aumento en la actividad del CYP 2E1 en los hepatocitos y stress oxidativo en la patogénesis de la esteatosis y NASH. La sustitución de los ácidos grasos de cadena larga por triglicéridos de cadena media (MCT) mejora la hepatitis alcohólica histológicamente. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) ω-3, por otro lado, mejoran la resistencia a la insulina, aumentan la β-oxidación y disminuyen la lipogénesis. Su combinación facilita la incorporación de PUFA a las membranas celulares de los órganos clave y, con ello, aumentan los beneficios de la administración de PUFA ω-3.El objetivo principal de esta tesis fue observar el efecto de los MCT y PUFA ω-3 en la prevención y tratamiento de la fibrosis hepática en un modelo murino (ratones C57/BL6 de NASH inducido por dieta DCM). Se estudiaron 46 ratones durante 6 semanas (fase de prevención, administrando DCM y MCT, PUFA o su combinación) y 46 ratones durante 10 semanas (fase de tratamiento: 6 semanas de inducción con dieta DCM, y 4 de tratamiento con MCT, PUFA o su combinación).El modelo replicó la mayoría de los hallazgos publicados pero no se constató un incremento en malondialdehído hepático. En cambio, disminuyó la leptina plasmática y aumentó la adiponectina, aún en inflamación. Sin embargo, se corroboró el papel antiinflamatorio de la adiponectina (fase de prevención) y el proinflamatorio de la leptina (fase de tratamiento). Otra aportación de esta investigación fue estudiar la variación en las concentraciones de carnitina y actividad de CPT-2.Los MCT y PUFAω-3, no fueron profilácticos de esteatosis hepática, y los PUFA ω-3 produjeron inflamación (no fibrosis). Los MCT produjeron más inflamación que los PUFA ω-3 en el tratamiento, pero ambos afectaron negativamente el índice histológico hepático. / In non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), lipid metabolism alteration, oxidative stress and alteration on cytokine production lead to liver inflammation and fibrosis.Obesity and diabetes are associated to hystological changes ranging from simple steatosis to necroinflammation and fibrosis (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), one of the manifestations of NAFLD. NASH precedes cirrhosis. The prevalence of NAFLD and NASH is of 20 and 2-3%, respectively. At the present time, there is no single, effective treatment. However, the knowledge of its physiopathology (insulin resistance, followed by hepatic lipid peroxidation affecting the parenchima) suggests the use of hypoglicemiants and antioxidants, along with weight loss. Obesity and insulin resistance mediated by TNF-α increase the liberation of free fatty acids (FFA) from adipocytes, therefore increasing their concentration in the liver. FFA induce oxidative stress, followed by lipoperoxidation, which in turn stimulates TNF- α expression in hepatocytes and adipocytes and induces insulin resistance and fibrogenesis. There are no animal models that define the molecular and physiological changes occurring during the transition of steatosis to steatohepatitis due to the lack of a model that presents every feature key for the development of NAFLD. NASH animal models have identified leptin and oxidative stress as the main pathogenic factors of steatosis and esteatohepatitis. The most illustrative models of steatohepatitis are based on the multiple "hit" hypothesis, which suggests that fatty liver is particularly vulnerable to oxidants and to develop steatohepatitis when aggressive factors generate enough oxidants as to cause hepatocyte death and inflammation. Steatohepatitis increases liver sensibility to other aggresive factors inducing liver fibrosis, therefore favouring the evolution to cirrhosis. The model induced by a choline and methionine-deficient diet (CMD) underscores the importance of the increased hepatocyte CYP 2E1 activity and oxidative stress on the pathogenesis of steatosis and NASH. The substitution of long-chain fatty acid for medium-chain triglycerides (MCT) improves the histology in alcoholic hepatitis. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA ω-3), on the other hand, improve insulin resistance, increase β-oxidation and decrease lipogenesis. Its combination favours PUFA incorporation into the cellular membranes of key organs, therefore increasing the benefits of PUFA ω-3 administration.The main objective of this thesis was to observe the effect of MCT and PUFA ω-3 on the prevention and treatment of liver fibrosis in a murine, NASH model (C57/BL6 mice) induced by CDM diet. Forty-six mice were studied during 6 weeks (prevention phase, administering CDM and MCT, PUFA or their combination) and 46 mice during 10 weeks (treatment phase: 6 weeks of induction with CDM diet, and 4 weeks of treatment with MCT, PUFA or their combination).The model replicates most of the published findings, but no increase on hepatic malondialdehyde was found. Instead, plasmatic leptin decreased and adiponectin increased, even when inflammation was present. However, the anti-inflammatory role of adiponectin (prevention phase) and proinflammatory role of leptin (treatment phase) were demonstrated. Another contribution of this research was the study of the variation on the carnitine concentrations and CPT-2 activity.MCT and PUFA ω-3 did not prevent liver steatosis, and PUFA ω-3 produced inflammation (no fibrosis). MCT caused more inflammation than PUFA ω-3 during the treatment phase, but both had a negative effect on the hepatic histological score.

La tritrichomonosis bovina (TB) es una enfermedad de transmisión sexual causada por el protozoo Tritrichomonas foetus que produce muerte embrionaria, piómetra y abortos esporádicos. El objetivo de esta tesis fue estudiar los mecanismos involucrados en la pérdida del conceptus en un modelo murino de TB. Se infectaron ratonas BALB/c con T. foetus, que fueron apareadas con machos sanos. Se utilizaron técnicas histológicas para estudiar los cambios endometriales en las ratonas infectadas y analizar el número y distribución de las células natural killer uterinas y de los mastocitos. Mediante lectinahistoquímica e inmunohistoquímica se analizaron los carbohidratos y la muerte y proliferación del epitelio uterino, respectivamente. Con real time RT-PCR se estudió la expresión de citoquinas, hemooxigenasa-1 (HO-1) e indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO) y a las células T reguladoras (Treg) y T helper 17 (Th17), en el útero. En el grupo de ratonas infectadas, la muerte embrionaria se produjo en las fases temprana y media de la gestación, asociada a endometritis y cambios en el patrón de carbohidratos y en los índices de proliferación y muerte celular del epitelio uterino. El ARNm de TNF-α, IL-10 e IL-4 aumentó en el grupo infectado. La expresión de Foxp3, un gen relacionado con las células Treg, y RORγt, marcador de células Th17, fue mayor en el útero de las ratonas infectadas. Los niveles de ARNm de HO-1 disminuyeron en las ratonas que sufrieron pérdida embrionaria. Los cambios en el patrón de carbohidratos y en los índices de muerte y proliferación celular, así como las respuestas T de tipo 1 y 17 podrían estar involucradas en la muerte embrionaria producida durante la infección con T. foetus. Estas respuestas alterarían los mecanismos protectores de la preñez como HO-1. El aumento de las células Treg promovería la persistencia de la infección por su acción inmunosupresora. De esta manera, en el modelo de ratonas preñadas, se caracterizaron mecanismos inmunológicos relacionados con la muerte embrionaria temprana en la TB.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T16:54:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Tiana Figueiredo.pdf: 1325713 bytes, checksum: 63568b1c8914bc029fbb0ecf80e03c2a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T16:54:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Tiana Figueiredo.pdf: 1325713 bytes, checksum: 63568b1c8914bc029fbb0ecf80e03c2a (MD5) / FAPESB; RENORBIO / O ácaro de poeira doméstica Blomia tropicalis é encontrado em regiões tropicais e subtropicais da América, Europa e Ásia, sendo um das mais importantes fontes de aeroalérgenos nestas regiões. Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de um modelo experimental de alergia a B. tropicalis e sua utilização em estudos de imunoprofilaxia. Para isto, quatro linhagens de camundongos foram sensibilizadas e desafiadas com extrato de B. tropicalis (Bt) sendo considerados como marcadores de inflamação pulmonar e de resposta Th2 a elevação do número de leucócitos, da atividade de peroxidase de eosinófilos e de IL-4 no lavado bronqueoalveolar (BAL) e da atividade de peroxidase de eosinófilos no pulmão, bem como elevação de IgE sérica específica para Bt. A linhagem A/J foi considerada a mais sensível a inflamação pulmonar induzida pelo sendo utilizada nas análises subseqüentes. O modelo de alergia experimental ao B. tropicalis foi utilizado então para a investigação do efeito da imunização com adjuvantes em desempenhar papel protetor ao desenvolvimento da alergia experimental. Entre os diversos candidatos a adjuvantes testados destacaram-se a saponina e o CpG emulsionados em montanide ISA 720 por proteger os animais da inflamação pulmonar induzida pela sensibilização com Bt, embora a resposta imune estimulada por esses adjuvantes seja aparentemente mista com produção de citocinas Th1 e Th2. Visando a utilização de um antígeno mais purificado partimos para o fracionamento do Bt por cromatografia líquida de troca iônica. As frações obtidas foram inicialmente analisadas quanto ao papel hipersensibilizante para o ser humano, através de dosagem de IgE específica para cada fração obtida no soro de indivíduos com teste cutâneo positivo para B. tropicalis e em indivíduos controle. A fração que apresentou maior reatividade frente aos soros positivos (74,3%) foi utilizada no modelo murino como agente sensibilizante. Observamos então que a fração do Bt utilizada foi efetiva em promover resposta inflamatória pulmonar em alguns dos critérios analisados, no entanto não foi observada produção de IL-4 no BAL nem IgE específica nos animais. A sensibilização com B. tropicalis induziu em camundongos o desenvolvimento de doença inflamatória pulmonar análoga a asma humana. Oligonucleotídeos CpG e a saponina mostraram-se promissores candidatos a adjuvantes em formulações de vacinas. O fracionamento do extrato de B. tropicalis produziu frações reativas a IgE humana e capazes de promover inflamação pulmonar murina, sendo um bom caminho para a obtenção de antígenos mais purificados. / Salvador

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-08-13T04:37:36Z No. of bitstreams: 1 raquel_f_rodrigues_ioc_bp_0056_2011.pdf: 571332 bytes, checksum: b292e41b82ba36c32976100adb623288 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-13T04:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_f_rodrigues_ioc_bp_0056_2011.pdf: 571332 bytes, checksum: b292e41b82ba36c32976100adb623288 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Comunicação e Informação Cientifica e Tecnológica em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leishmaniose é uma das principais doenças parasitárias com prioridades de pesquisa segundo a Organização Mundial da Saúde. Aurgência por drogas mais seletivas e menos tóxicas tenm conduzido a pesquisa por novas terapias químicas. Os compostos mesoiônicos (Mls) da classe 1,3,2 - tiadiazol-2-aminida, apresentam um amplo espectro de atividades biológica, incluindo efeitos antitumoral e leishmanicida. Neste estudo investigamos a atividade in vitro de Ml-HH, Ml-4-NO2, Ml-3OCH3 e Ml-4-OCH3 sobre promastigotas e amastigotas axênicas de L. infantum e amastigotas intracelulares de L. infantum e L. amazonensis. Uma alta atividade leishmanicida foi demonstrada contra L. infantum e constatou-se uma relação de dose-resposta para formas amastigotas intracelulares de L. infantum e L. amazonensis pelo Ml-4-NO2. Em etapa seguinte investigamos in vivo o efeito de Mls nos seguintes modelos camundongo/parasito: CBA/J e L. amazonensis, BALB/c e L. amazonensis e BALB/c e L. infantum. No primeiro modelo, a administração por via subcutânea de Ml-HH e Ml-4-OCH3 levou a uma diminuição da carga parasitária no linfonodo adjacente à lesão e no baço. Nos dois modelos seguintes, altamente sensíveis à infecção, foram estudados Ml-HH, Ml-4-NO2, avaliando além de parâmetros daresposta terapêutica e tóxicos, possíveis efeitos imunomoduladores. Camundongos susceptíveis da linhagem BALB/c foram infectados por via subcutânea na pata com promastigotas de L. amazonensis e viaintraperitonal por L. infantum. Os tratamentos utilizados foram por vias tópica, intralesional para leishmaniose cutâna (LC) e intraperitoneal para leishmaniose visceral (LV). Glucantime, droga anti-Leishmania clássica, foi utilizada como referência. Embora a cura completa não tenha sido observada nos animais com LC, os grupos tratados com Ml-4 - NO2 e Ml-4-OCH3 apresentaram pequenas lesões na pata infectada até 12ª semana após a infecção sem apresentar ulcerações. Ogrupo LV tratado com Ml-4-NO2 apresentou carga parasitária negativa no baçço e no fígado. O tratamento de LV com Glucantime e Ml-4-OCH3 reduziu de forma significativa a carga parasitária. Porém o tratamento com Ml-HH, em todas as vias utilizadas, não apresentou atividade terapêutica para LC ou LV. A avaliação de enzimas hepáticas (AST e ALT) e de creatinina apontam para a ausência de toxidade no tratamento com Mls. Além disso, também foram realizados estudos na tentativa de buscar um alvo de ação destes compostos, investigando-se a tripanotiona redutase, enzima específica no parasito, responsável por desencadear uma cascata dedetoxificação nos parasitos. Estudos de cinética enzimática (enzimas recombinantes de L. infantum e T. cruzi) e modelagem molecular indicaram que Ml-4-NO2 é o único derivado mesoionico, dentre os estudados, capaz de inibir de forma não- competitiva esta enzima. Todos esses resultados demonstraram que Mls podem ser uma nova perspectiva no desenvolvimento de drogas com menor toxidade e capazes de modificar a resposta imunológica no combate a infecção por Leishmania, além de atuar sobre um alvo específico no parasito / Leishmaniasis is a parasitic disease with the main research priorities according to World Health Organization Aurgência drug more selective and less toxic tenm conducting research for new chemical therapies. The mesoionic compound (mls) of the class 1,3,2 - thiadiazol-2-aminida, have a broad spectrum of biological activities, including antitumor effects and antileishmanial. We investigated the in vitro activity of HH-Ml, Ml-4-NO2,-3OCH3 Ml and Ml-4-OCH3 on promastigotes and axenic amastigotes of L. infantum and intracellular amastigotes of L. infantum and L. amazonensis. A high leishmanicidal activity was demonstrated against L. infantum and it was observed a dose-response for intracellular amastigote L. infantum and L. amazonensis by ML-4-NO 2. In next step we investigate in vivo the effect of MLS in the following models mouse / parasite: CBA / J and L. amazonensis, BALB / c and L. amazonensis and BALB / c and L. infantum. In the first model, the subcutaneous administration of ML-HH and ML-4-OCH 3 led to a reduction of parasite load in lymph node adjacent to the lesion and the spleen. In both models the following, highly susceptible to infection have been studied HH-ML, ML-4-NO 2, besides evaluating parameters daresposta therapeutic and toxic potential immunomodulatory effects. Susceptible mice of BALB / c mice were infected subcutaneously in the foot with a promastigote L. by L. amazonensis and viaintraperitonal infantum.   The treatments were used by inland topical, intralesional cutâna for leishmaniasis (CL) and intraperitoneal for visceral leishmaniasis (VL). Glucantime, anti-Leishmania classical drug was used as reference. While the complete healing was not observed in animals with LC, the groups treated with ML-4 - NO2 and ML-4-OCH 3 showed small lesions in the infected foot up to 12 weeks after infection without presenting ulcerations. GROUP Ml treated with LV-4-NO2 showed negative bacco parasite load and liver. Treatment of VL with Glucantime and Ml-4-OCH3 significantly reduced parasite burden. However, treatment with ML-HH in all pathways used, had no therapeutic activity for LV or LC. The evaluation of liver enzymes (ALT and AST) and creatinine indicate the absence of toxicity in the treatment mls. In addition, studies were performed in an attempt to seek a target of action of these compounds by investigating whether the trypanothione reductase, an enzyme specific to the parasite responsible for triggering a cascade dedetoxificação in parasites. Kinetic studies enzyme (enzymes of L. infantum and recombinant T. cruzi) and molecular modeling indicated that ML-4-one derivative is NO2 mesoionico, of those studied, capable of inhibiting a non-competitive this enzyme. All these results showed that MLs may be a new perspective in the development of drugs with lower toxicity and can modify the immune response to fight infection by Leishmania, and act on a specific target in the parasite

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T18:30:11Z No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T18:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, não há vacina eficaz e o controle das leishmanioses depende principalmente da quimioterapia. Recentemente, novos compostos sintéticos os derivados carbohidrazidas pirazolocas apresentaram atividade em Leishmania amazonensis in vitro e quando testadas em modelo experimental murino de infecção de L. amazonensis mostraram eum efeito um efeito terapêutico significativo. Um estudo com compostos intermediários da síntesedas carbohidrazidas poderia ser interessante, pois estes possuem uma potencial atividade leishmanicida e ajudaria a cmpreender os mecanismos de ação dos compostos finais. Por outro lado, é necessário conhcer o comportamento do sistema imune frente a estes compostos na infecção por leishmaniose.Os compostos precursores naão foram ativos em formas promastigotas de L. amazonensis. No entanto, todos os compostos apresentaram atividade sobre formas de amastigotas e sem citotoxicidade em célula de mamíferos. Aqui, foi sugerida a contribuição farmacofórica do anel N-heteroaromático para a atividade leishmanicida e do grupamento hidrazina para o composto intermediário. Além disso, foi mostrado que todos os componentes podem induzir um aumento da produção de óxido nitrico em macrófagos estimulados ou não. Em camundongos CBA infectados com L amazonensis e tratados por via oral com os derivados carbohidrazidas, o estudo histopatológico rervelou que mudanças na derme foram correlacionadas com o tamanho macroscópico da lesão. Camundongos CBA infectados e tratados tinham lesões cutâneas menores, e as estruturas da epiderme e derme tinham níveis mais baixos de infiltrtado inflamatório, comparadas com as de camundongos controles infectados e não tratados. Também foi observado um infiltrado inflamatório misto contendo linfócitos e neutrófilos. Além disso, expressão de IL-4 RNAm foi menor no grupo tratado.. Um aumento dos níveis de anticorpos das subclasses específicas anti-Leishmania IgG2a e IgG3 foi observado nos grupos tratados com as pirozol carbohidrazidas exercem efeitos terapêuticos significativos, podendo agir diretamente sobre o parasito e/ou sobre as células dos sistemas imune do hospedeiro.. / Currently, there is no effective vaccine and control of leishmanioses depends mainly on the chemotherapy. Recently, new synthetic carbohidrazidas derivatives pirazolocas compounds showed activity on Leishmania amazonensis when tested in vitro and in experimental murine model of infection of l. amazonensis showed a significant therapeutic effect effect. A study of intermediate compounds síntesedas carbohidrazidas could be interesting, as these have a potential activity leishmanicida and help cmpreender the mechanisms of action of compounds. On the other hand, it is necessary to know the behavior of the immune system against these compounds in leishmaniasis infection.The precursor compounds are active in ways does promastigotas of l. amazonensis. However, all compounds showed activity on amastigote forms and without cytotoxicity in mammalian cell. Here, it was suggested the contribution farmacofórica of the ring N-heteroaromatic compound for leishmanicida and activity of hydrazine to the intermediate grouping. In addition, it was shown that all components can induce an increase in nitric oxide production in macrophages stimulated or not. In CBA mice infected with l. amazonensis and treated orally with carbohidrazidas derivatives, the histopathologic study rervelou that changes in the DermIS were correlated with the macroscopic size of the lesion. CBA mice infected and treated tin

O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus que ocorre na região amazônica causando surtos de doenças febris agudas e que, ocasionalmente, podem ser associados a meningoencefalite. Aproximadamente 500.000 casos de Oropouche teriam ocorrido no Brasil. Entretanto, não existe vacina contra o OROV. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de infecção por OROV para estudar a patogênese da doença e um modelo para testar candidatas vacinais. Protótipo vacinal utilizando a proteína recombinante do nucleocapsídeo (N) de OROV (NrOROV), que é o principal antígeno viral, foi usado como potencial candidato para vacina. Neste estudo utilizou-se um modelo animal em camundongos Balb/c de 12 semanas de idade, inoculados intracerebralmente com 8x105 PFU de OROV, capaz de induzir 100% de letalidade após o terceiro dia da infecção. Altos títulos virais foram encontrados no cérebro e na medula espinhal dos animais. Surpreendentemente, 12 e 24 horas pós-infecção foi possível detectar vírus no fígado e baço (3 Log10 PFU/g) dos camundongos. Com este modelo foram testados os candidatos vacinais. Grupos de camundongos foram imunizados 3 vezes com OROV, OROV e FCA, NrOROV, NrOROV e FCA, NrOROV, Poli I:C e Montanide ISA 720. Após 3 imunizações, os animais foram desafiados com 10 LD50 de OROV e observados por 20 dias. Os animais imunizados com NrOROV e adjuvantes, não foram capazes de produzir anticorpos neutralizantes e adquirir imunidade protetora contra OROV enquanto que os imunizados com OROV apresentaram altos níveis de anticorpos neutralizantes e completa proteção in vivo. Ainda, os anticorpos produzidos pelos animais imunizados permitiram estudar o ciclo de replicação celular do OROV utilizando imunofluorescência. / Oropouche (OROV) is an arbovirus that occurs in the South American, Amazon region, producing outbreaks of acute febrile illness occasionally associated to meningoencephalitis. Approximately 500,000 cases of Oropouche have been reported in Brazil in the last 60 years. However, there is no available vaccine for OROV. We show here the development of an animal model of OROV suitable for studies on pathogenesis and vaccine testing. A vaccine prototype based on recombinant OROV nucleocapsid protein (NrOROV), an important viral antigen, was evaluated in the animal model. Initialy, we observed that all 12-week-old Balb/c mice inoculated intracerebrally with 8x105 PFU died after the third day of infection. Surprisingly, OROV genome was detectable in the liver as early as 12 hours post infection (pi) and in the spleen at 24 hours pi at 3 log10 PFU/g. Besides, high viral titers were found in brain and spinal cord. To test the NrOROV as a vaccine candidate, animals divided in 5 groups were immunized subcutaneously 3 times, two weeks apart with either OROV, OROV and Freud complete Adjuvant (FCA), NrOROV, NrOROV and FCA, NrOROV and Poly I:C and Montanide ISA 720. The experiment also included a group of naïve animals. After the third immunization, the animals were challenged with 10LD50 by intracerebral route and followed for 20 days. The animals immunized with NrOROV and adjuvants developed specific antibodies that were not able to neutralize the virus or confer protective immunity against OROV. Nevertheless, mice immunized with OROV showed high levels of neutralizing and protective antibodies. Despite the discouraging results with NrOROV as a vaccine, the mouse model is suitable to study pathogenesis, and to test other vaccines for OROV.

O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus que ocorre na região amazônica causando surtos de doenças febris agudas e que, ocasionalmente, podem ser associados a meningoencefalite. Aproximadamente 500.000 casos de Oropouche teriam ocorrido no Brasil. Entretanto, não existe vacina contra o OROV. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de infecção por OROV para estudar a patogênese da doença e um modelo para testar candidatas vacinais. Protótipo vacinal utilizando a proteína recombinante do nucleocapsídeo (N) de OROV (NrOROV), que é o principal antígeno viral, foi usado como potencial candidato para vacina. Neste estudo utilizou-se um modelo animal em camundongos Balb/c de 12 semanas de idade, inoculados intracerebralmente com 8x105 PFU de OROV, capaz de induzir 100% de letalidade após o terceiro dia da infecção. Altos títulos virais foram encontrados no cérebro e na medula espinhal dos animais. Surpreendentemente, 12 e 24 horas pós-infecção foi possível detectar vírus no fígado e baço (3 Log10 PFU/g) dos camundongos. Com este modelo foram testados os candidatos vacinais. Grupos de camundongos foram imunizados 3 vezes com OROV, OROV e FCA, NrOROV, NrOROV e FCA, NrOROV, Poli I:C e Montanide ISA 720. Após 3 imunizações, os animais foram desafiados com 10 LD50 de OROV e observados por 20 dias. Os animais imunizados com NrOROV e adjuvantes, não foram capazes de produzir anticorpos neutralizantes e adquirir imunidade protetora contra OROV enquanto que os imunizados com OROV apresentaram altos níveis de anticorpos neutralizantes e completa proteção in vivo. Ainda, os anticorpos produzidos pelos animais imunizados permitiram estudar o ciclo de replicação celular do OROV utilizando imunofluorescência. / Oropouche (OROV) is an arbovirus that occurs in the South American, Amazon region, producing outbreaks of acute febrile illness occasionally associated to meningoencephalitis. Approximately 500,000 cases of Oropouche have been reported in Brazil in the last 60 years. However, there is no available vaccine for OROV. We show here the development of an animal model of OROV suitable for studies on pathogenesis and vaccine testing. A vaccine prototype based on recombinant OROV nucleocapsid protein (NrOROV), an important viral antigen, was evaluated in the animal model. Initialy, we observed that all 12-week-old Balb/c mice inoculated intracerebrally with 8x105 PFU died after the third day of infection. Surprisingly, OROV genome was detectable in the liver as early as 12 hours post infection (pi) and in the spleen at 24 hours pi at 3 log10 PFU/g. Besides, high viral titers were found in brain and spinal cord. To test the NrOROV as a vaccine candidate, animals divided in 5 groups were immunized subcutaneously 3 times, two weeks apart with either OROV, OROV and Freud complete Adjuvant (FCA), NrOROV, NrOROV and FCA, NrOROV and Poly I:C and Montanide ISA 720. The experiment also included a group of naïve animals. After the third immunization, the animals were challenged with 10LD50 by intracerebral route and followed for 20 days. The animals immunized with NrOROV and adjuvants developed specific antibodies that were not able to neutralize the virus or confer protective immunity against OROV. Nevertheless, mice immunized with OROV showed high levels of neutralizing and protective antibodies. Despite the discouraging results with NrOROV as a vaccine, the mouse model is suitable to study pathogenesis, and to test other vaccines for OROV.

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Resumo: Introdução. A correlação entre gravidade da paracoccidioidomicose e patogenicidade e imunogenicidade dos fungos causadores tem sido pouco investigada e foi o objetivo deste estudo. Metodologia. As cincos cepas Pb192, Pb234, Pb326, Pb417 e Pb531 foram identificadas pelo seqüenciamento da região Exon 2 da gp43. A patogenicidade foi determinada pelo cálculo da dose letal 50% (DL50%) e pela contagem do número de unidades formadoras de colônias, realizada na sexta semana pós-infecção de camundongos BALB/c. A imunogenicidade foi determinada pela avaliação da resposta imune humoral específica, utilizando-se a reação de imunodifusão dupla em gel de ágar e da imunidade celular, determinada pela concentração das citocinas interleucina -2, interleucina-10, interferon-γ, fator de necrose tumoral – α e do fator de crescimento do endotélio vascular, em tecido pulmonar. Quatro amostras clínicas foram recém-isoladas de pacientes com paracoccidioidomicose, provenientes da Região de Botucatu - os isolados Pb234 e Pb417, de pacientes com a forma crônica moderada; o Pb326 de um caso com a forma aguda grave; e o Pb531, de um caso com a forma crônica grave. As demais cepas Pb192, Pb01 e 8334 foram cedidas pelo laboratório de Moléstias infecciosas. Resultados. As cepas Pb417 e Pb326 agruparam-se às cepas identificadas como P. brasiliensis S1a, a Pb531 às P. brasiliensis S1b e as cepas Pb234 e Pb192 às cepas depositadas como P. restrepiensis (PS3). Os resultados demonstraram correlação direta entre ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction. The investigation of paracoccidioidomycosis and pathogenicity and immunogenicity of the provoking fungi has been little investigated and was the objective of this study. Methodology. As strains, Pb192, Pb234, Pb326, Pb417 and Pb531 were included by sequencing the Exon 2 region of gp43. The pathogenicity was determined by calculating the 50% lethal dose (LD50%) and by counting the number of colony forming units performed in the sixth week post-infection of BALB / c mice. Immunogenicity was determined by the humoral immune response, using the agar gel immunodiffusion reaction and the cellular immunity, determined the concentration of cytokines interleukin-2, interleukin-10, interferonγ, tumor necrosis factor - and factor of vascular endothelial growth in lung tissue. Surgical has been associated with patients with paracoccidioidomycosis, derived from the Botucatu - the Pb234 and Pb417; the Pb326 of a case with a severe severe form; and Pb531, of a case with severe chronic form. The other strains Pb192, Pb01 and 8334 were transferred by the laboratory of Infectious Diseases. Results. Pb417 and Pb326 strains were grouped into the associated strains P. brasiliensis S1a, Pb531 to P. brasiliensis S1b and strains Pb234 and Pb192 to strains deposited as P. restrepiensis (PS3). The results demonstrate the pathogenicity of disease error and severity. The small LD 50 values were measured in the following cases: severe disease, Pb531 and Pb326. Pb531 strain was considered to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.

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A morfog?nese de C. albicans, bem como sua capacidade de combater o estresse oxidativo no interor de c?lulas fagoc?ticas, ? um fator essencial para a invas?o tecidual e estabelecimento da infec??o. Devido ao baixo arsenal antif?ngico dispon?vel no mercado e o constante surgimento de cepas resistentes, faz-se necess?ria a pesquisa de novas fontes terap?uticas, principalmente oriundas de produtos naturais. No presente estudo foram selecionados 48 isolados cl?nicos de C. albicans oriundos da cavidade bucal de pacientes transplantados renais. A fra??o acetato de etila de Eugenia uniflora foi utilizada na concentra??o de 1000 ?g/mL para avaliar a a??o comparativa (tratada e n?o tratada com extrato) sobre a fagocitose e morfog?nese de C. albicans. Foi realizado o ensaio de resist?ncia ao ataque de neutr?filos polimorfonucleares. O isolado 111R, de alta capacidade filamenta??o foi utilizado para avalia??o do perfil prot?ico por meio de an?lise prote?mica, bem como da intera??o com prote?nas diretamente associadas ? morfog?nese. A resposta ? infec??o foi observada em modelo murino de candid?ase oral e a a??o t?xica do extrato de E. uniflora foi observada em ensaio de MTT. O extrato de E. uniflora reduziu significativamente a capacidade de fagocitose de C. albicans (m?dia total de 120.36 ? 36.71 vs. 44.68 ? 19.84). Trinta e nove prote?nas foram identificadas na an?lise prote?mica, relacionadas ? gera??o de energia, metabolismo de prote?nas e glicose, divis?o celular, transporte citoplasm?tico, metabolismo de ?cidos nucl?icos, estrutura celular e resposta ao estresse. Importantes prote?nas relacionadas com a forma??o do citoesqueleto foram reguladas negativamente nas c?lulas tratadas. Houve instala??o de infec??o na cavidade oral dos camundongos e a infec??o foi atenuada quando C. albicans foi pr?-incubada na presen?a do extrato de E. uniflora e quando o extrato foi aplicado na cavidade oral ap?s a instala??o da infec??o. Este resultado foi condizente com a redu??o na contagem de UFC (2.36 vs. 1.85 Log10 CFU/ml) e a atenua??o dos danos teciduais observados na an?lise histopatol?gica. O extrato de E. uniflora n?o foi t?xico para c?lulas humanas mesmo em concentra??es 8x acima da utilizada nos experimentos. A fra??o acetato de etila de E. uniflora poder? causar danos ? parede celular e prote?nas essenciais ao metabolismo de C. albicans, afetando prote?nas relacionadas ? estrutura celular, reduzindo a capacidade pl?stica de filamenta??o, atenuando a a??o invasiva em modelo animal, sem causar efeito t?xico em c?lulas humanas, podendo ser uma futura alternativa terap?utica para o tratamento de infec??es por Candida. / Under certain circumstances, Candida albicans may switch a colonizing to a infecting yeast, such as in oral candidiasis. Morphogenesis in C. albicans, besides its ability to combat the oxidative stress inside phagocytic cells is an essential step for tissue invasion and establishment of infection. Due to the reduced drug arsenal used for treatment of fungal infections and the constant emergence of resistant strains, it is mandatory to search for new therapeutic sources, mainly from natural products. In the present study, 48 clinical isolates of C. albicans from the oral cavity of renal transplant recipients were selected. In order to evaluate the comparative action (treated and untreated cellst) on phagocytosis and morphogenesis of C. albicans, the ethyl acetate fraction of Eugenia uniflora extract was used at a concentration of 1000 ?g/mL. Resistance of C. albicans to polymorphonuclear neutrophils was carried out. The isolate 111R, a highly filamentous strain was used to evaluate protein profiling through proteomic analysis, as well as the interaction with proteins directly associated with morphogenesis. The in vivo response to infection was observed in murine model of oral candidiasis and the toxic action of E. uniflora extract was observed in the MTT assay. E. uniflora extract significantly reduced the phagocytosis of C. albicans (Mean 120.36 ? 36.71 vs. 44.68 ? 19.84). Thirty-nine proteins, related to energy generation, protein and glucose metabolism, cell division, cytoplasmic transport, nucleic acid metabolism, cell structure and stress response were identified with proteomics analysis. Important proteins directly related with cytoesqueleton formation were down regulated on treated cells. The infection in the oral cavity of the mice was established and it was attenuated when both C. albicans cells were either preincubated in the presence of E. uniflora extract or when the extract was applied to the surface of the oral cavity after infection. These results were consistent with the reduction in CFU countings (2.36 vs. 1.85 Log10 CFU/ml) and attenuation of tissue damages observed in the histopathologycal analysis. E. uniflora extract was non-toxic to human cells even at concentrations 8 fold hugher than the one used in the experiments. The ethyl acetate fraction of E. uniflora may act act damaging and metabolism essential proteinsmainly related to cellular structure, reducing the plastic capacity of filamentation and attenuating infection in a murine modell model, without causing any toxic effect on human cells, suggesting that it may be a future therapeutic alternative for the treatment of Candida infections.