A Leishmaniose é uma infecção causada pelo protozoário do gênero Leishmania e transmitida pela picada de insetos. Os tratamentos atuais são caros e demorados, envolvendo compostos baseados em Sb(V), anfotericina B lipídica e miltefosina. Estudos recentes sugerem que a enzima tripanotiona redutase (TR) poderia ser um alvo específico no desenvolvimento de novos fármacos, pois ela é essencial e exclusiva dos tripanossomatídeos. Desta forma, este trabalho apresenta a síntese de novos compostos derivados da iminodibenzila com estrutura similar à clomipramina, um conhecido inibidor da TR. Tais compostos são conjugados de iminodibenzila com etilenodiamina, etanolamina e dietilenotriamina através de epicloridrina (dado-en, dado-ea e dado-dien , respectivamente). Foram obtidos com rendimentos superiores a 94% e caracterizados através de LC_MS e espectroscopia no infravermelho. Também se fez a avaliação da afinidade relativa dos novos ligantes por cobre através do teste de recuperação da fluorescência da calceína, concluindo-se que o ligante dado-dien possui uma afinidade maior com Cu (II) quando comparado com os outros ligantes sintetizados. Foram formados complexos metálicos através da adição de sulfato de cobre (II), acompanhando-se através de espectroscopia ultravioleta-visível para se obter uma estimativa da relação metal: ligante, concluindo-se que os complexos formados eram [Cu(dado-ea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ e [Cu(dado-dien)2]2+. A lipofolicidade foi estimada através de simulação computacional, constatando-se que os complexos formados são todos muito lipofílicos, sendo que o logP descreve na seguinte: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Ensaios de atividade pró-oxidante através da oxidação da sonda fluorimétrica DHR revelaram que o complexo [Cu(dado-ea)]2+ apresentou a maior taxa de atividade pró-oxidante, sendo independente da concentração de peróxido de hidrogênio no meio reacional e alcançando seu limiar quando presente em concentração aproximada de 10 µM. Por fim, os compostos sintetizados foram testados quando à suas citotoxidades frente a promastigotas L. amazonenses e com macrófagos RAW 264,7. Quando o protozoário foi exposto a concentrações variadas dos compostos deste estudo, observou-se que os ligantes ea, en e dien tiveram os menores valores de IC50 (todos < 3µM), porém eles são muito tóxicos para serem utilizados como fármacos, Dentre os ligantes sintetizados, somente o dado-en apresentou um resultado numa faixa viável (IC50 19,9 ± 2,2 µM). Contra macrófagos RAW 264,7, dado-en apresentou IC50 > 50µM, ou seja, ele é mais tóxico para o protozoário do que para os macrófagos. A complexação com cobre não representou um aumento interessante na citotoxicidade dos compostos. O conjunto de resultados apresentados neste indica um potencial uso do composto dado-en no combate à leishmaniose. / Leishmaniasis is an infection caused by protozoa of the genus Leishmania. and transmitted by insects. Current treatments are expensive and time-consuming, involving Sb(V)-based compounds, lipossomal amphotericin B and miltefosine. Recent studies suggest that inhibition of trypanothione reductase (TR) could be a specific target in the development of new drugs, because it is essential and exclusive to trypanosomes. Thus, this work presents the synthesis of new compounds derived from iminodibenzyl with structures related to clomipramine, a known inhibitor of TR. These compounds were conjugates of iminodibenzyl with ethylenediamine, ethanolamine and diethylenetriamine, linked by epichlorohydrin. They were obtained with yields higher than 94% and their structures were confirmed by LC-MS and infrared spectroscopy. The relative affinity for copper of the new chelators was assessed by the recovery of calcein fluorescence, which showed that dado-dien has the highest affinity for Cu(II) among the new ligands. Metal complexes were synthesized by addition of copper(II) sulphate and studied by ultraviolet-visible spectroscopy, showing that the stoichiometries were [Cu(dadoea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ and [Cu(dado-dien)2]2+. Lipophilicity was assessed by computational methods, indicating that the complexes were all very lipophilic, with logP decreasing in the following order: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Pro-oxidant activity assays by oxidation of DHR fluorimetric probe showed that [Cu(dado-ea)]2+ has the highest rate of oxidation, independent of hydrogen peroxide concentration, reaching its highest value when at ~ 10 &#181;M. Finally, the compounds were tested for citotoxicity to L. amazonensis promastigotes and RAW 264,7 macrophages. When the protozoa was exposed to varying concentrations of the compounds, it was observed that chelators ea, en and dien had the lowest values of IC50 (< 3 &#181;M). but they are too citotoxic to be used as drugs. Among the synthesized chelators, only dado-en presented a result in a pharmaceutically interesting range (IC50 19.9 ± 2.2 &#181;M). Against RAW 264,7 macrophages dado-en IC50 > 50 &#181;M. Complexation to copper did not enhance the citotoxicity of the compounds. Overall, the results in this study indicate a potential use of dado-en in combating leishmaniasis.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-08-13T04:37:36Z No. of bitstreams: 1 raquel_f_rodrigues_ioc_bp_0056_2011.pdf: 571332 bytes, checksum: b292e41b82ba36c32976100adb623288 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-13T04:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_f_rodrigues_ioc_bp_0056_2011.pdf: 571332 bytes, checksum: b292e41b82ba36c32976100adb623288 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Comunicação e Informação Cientifica e Tecnológica em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A leishmaniose é uma das principais doenças parasitárias com prioridades de pesquisa segundo a Organização Mundial da Saúde. Aurgência por drogas mais seletivas e menos tóxicas tenm conduzido a pesquisa por novas terapias químicas. Os compostos mesoiônicos (Mls) da classe 1,3,2 - tiadiazol-2-aminida, apresentam um amplo espectro de atividades biológica, incluindo efeitos antitumoral e leishmanicida. Neste estudo investigamos a atividade in vitro de Ml-HH, Ml-4-NO2, Ml-3OCH3 e Ml-4-OCH3 sobre promastigotas e amastigotas axênicas de L. infantum e amastigotas intracelulares de L. infantum e L. amazonensis. Uma alta atividade leishmanicida foi demonstrada contra L. infantum e constatou-se uma relação de dose-resposta para formas amastigotas intracelulares de L. infantum e L. amazonensis pelo Ml-4-NO2. Em etapa seguinte investigamos in vivo o efeito de Mls nos seguintes modelos camundongo/parasito: CBA/J e L. amazonensis, BALB/c e L. amazonensis e BALB/c e L. infantum. No primeiro modelo, a administração por via subcutânea de Ml-HH e Ml-4-OCH3 levou a uma diminuição da carga parasitária no linfonodo adjacente à lesão e no baço. Nos dois modelos seguintes, altamente sensíveis à infecção, foram estudados Ml-HH, Ml-4-NO2, avaliando além de parâmetros daresposta terapêutica e tóxicos, possíveis efeitos imunomoduladores. Camundongos susceptíveis da linhagem BALB/c foram infectados por via subcutânea na pata com promastigotas de L. amazonensis e viaintraperitonal por L. infantum. Os tratamentos utilizados foram por vias tópica, intralesional para leishmaniose cutâna (LC) e intraperitoneal para leishmaniose visceral (LV). Glucantime, droga anti-Leishmania clássica, foi utilizada como referência. Embora a cura completa não tenha sido observada nos animais com LC, os grupos tratados com Ml-4 - NO2 e Ml-4-OCH3 apresentaram pequenas lesões na pata infectada até 12ª semana após a infecção sem apresentar ulcerações. Ogrupo LV tratado com Ml-4-NO2 apresentou carga parasitária negativa no baçço e no fígado. O tratamento de LV com Glucantime e Ml-4-OCH3 reduziu de forma significativa a carga parasitária. Porém o tratamento com Ml-HH, em todas as vias utilizadas, não apresentou atividade terapêutica para LC ou LV. A avaliação de enzimas hepáticas (AST e ALT) e de creatinina apontam para a ausência de toxidade no tratamento com Mls. Além disso, também foram realizados estudos na tentativa de buscar um alvo de ação destes compostos, investigando-se a tripanotiona redutase, enzima específica no parasito, responsável por desencadear uma cascata dedetoxificação nos parasitos. Estudos de cinética enzimática (enzimas recombinantes de L. infantum e T. cruzi) e modelagem molecular indicaram que Ml-4-NO2 é o único derivado mesoionico, dentre os estudados, capaz de inibir de forma não- competitiva esta enzima. Todos esses resultados demonstraram que Mls podem ser uma nova perspectiva no desenvolvimento de drogas com menor toxidade e capazes de modificar a resposta imunológica no combate a infecção por Leishmania, além de atuar sobre um alvo específico no parasito / Leishmaniasis is a parasitic disease with the main research priorities according to World Health Organization Aurgência drug more selective and less toxic tenm conducting research for new chemical therapies. The mesoionic compound (mls) of the class 1,3,2 - thiadiazol-2-aminida, have a broad spectrum of biological activities, including antitumor effects and antileishmanial. We investigated the in vitro activity of HH-Ml, Ml-4-NO2,-3OCH3 Ml and Ml-4-OCH3 on promastigotes and axenic amastigotes of L. infantum and intracellular amastigotes of L. infantum and L. amazonensis. A high leishmanicidal activity was demonstrated against L. infantum and it was observed a dose-response for intracellular amastigote L. infantum and L. amazonensis by ML-4-NO 2. In next step we investigate in vivo the effect of MLS in the following models mouse / parasite: CBA / J and L. amazonensis, BALB / c and L. amazonensis and BALB / c and L. infantum. In the first model, the subcutaneous administration of ML-HH and ML-4-OCH 3 led to a reduction of parasite load in lymph node adjacent to the lesion and the spleen. In both models the following, highly susceptible to infection have been studied HH-ML, ML-4-NO 2, besides evaluating parameters daresposta therapeutic and toxic potential immunomodulatory effects. Susceptible mice of BALB / c mice were infected subcutaneously in the foot with a promastigote L. by L. amazonensis and viaintraperitonal infantum.   The treatments were used by inland topical, intralesional cutâna for leishmaniasis (CL) and intraperitoneal for visceral leishmaniasis (VL). Glucantime, anti-Leishmania classical drug was used as reference. While the complete healing was not observed in animals with LC, the groups treated with ML-4 - NO2 and ML-4-OCH 3 showed small lesions in the infected foot up to 12 weeks after infection without presenting ulcerations. GROUP Ml treated with LV-4-NO2 showed negative bacco parasite load and liver. Treatment of VL with Glucantime and Ml-4-OCH3 significantly reduced parasite burden. However, treatment with ML-HH in all pathways used, had no therapeutic activity for LV or LC. The evaluation of liver enzymes (ALT and AST) and creatinine indicate the absence of toxicity in the treatment mls. In addition, studies were performed in an attempt to seek a target of action of these compounds by investigating whether the trypanothione reductase, an enzyme specific to the parasite responsible for triggering a cascade dedetoxificação in parasites. Kinetic studies enzyme (enzymes of L. infantum and recombinant T. cruzi) and molecular modeling indicated that ML-4-one derivative is NO2 mesoionico, of those studied, capable of inhibiting a non-competitive this enzyme. All these results showed that MLs may be a new perspective in the development of drugs with lower toxicity and can modify the immune response to fight infection by Leishmania, and act on a specific target in the parasite

A Leishmaniose é uma infecção causada pelo protozoário do gênero Leishmania e transmitida pela picada de insetos. Os tratamentos atuais são caros e demorados, envolvendo compostos baseados em Sb(V), anfotericina B lipídica e miltefosina. Estudos recentes sugerem que a enzima tripanotiona redutase (TR) poderia ser um alvo específico no desenvolvimento de novos fármacos, pois ela é essencial e exclusiva dos tripanossomatídeos. Desta forma, este trabalho apresenta a síntese de novos compostos derivados da iminodibenzila com estrutura similar à clomipramina, um conhecido inibidor da TR. Tais compostos são conjugados de iminodibenzila com etilenodiamina, etanolamina e dietilenotriamina através de epicloridrina (dado-en, dado-ea e dado-dien , respectivamente). Foram obtidos com rendimentos superiores a 94% e caracterizados através de LC_MS e espectroscopia no infravermelho. Também se fez a avaliação da afinidade relativa dos novos ligantes por cobre através do teste de recuperação da fluorescência da calceína, concluindo-se que o ligante dado-dien possui uma afinidade maior com Cu (II) quando comparado com os outros ligantes sintetizados. Foram formados complexos metálicos através da adição de sulfato de cobre (II), acompanhando-se através de espectroscopia ultravioleta-visível para se obter uma estimativa da relação metal: ligante, concluindo-se que os complexos formados eram [Cu(dado-ea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ e [Cu(dado-dien)2]2+. A lipofolicidade foi estimada através de simulação computacional, constatando-se que os complexos formados são todos muito lipofílicos, sendo que o logP descreve na seguinte: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Ensaios de atividade pró-oxidante através da oxidação da sonda fluorimétrica DHR revelaram que o complexo [Cu(dado-ea)]2+ apresentou a maior taxa de atividade pró-oxidante, sendo independente da concentração de peróxido de hidrogênio no meio reacional e alcançando seu limiar quando presente em concentração aproximada de 10 µM. Por fim, os compostos sintetizados foram testados quando à suas citotoxidades frente a promastigotas L. amazonenses e com macrófagos RAW 264,7. Quando o protozoário foi exposto a concentrações variadas dos compostos deste estudo, observou-se que os ligantes ea, en e dien tiveram os menores valores de IC50 (todos < 3µM), porém eles são muito tóxicos para serem utilizados como fármacos, Dentre os ligantes sintetizados, somente o dado-en apresentou um resultado numa faixa viável (IC50 19,9 ± 2,2 µM). Contra macrófagos RAW 264,7, dado-en apresentou IC50 > 50µM, ou seja, ele é mais tóxico para o protozoário do que para os macrófagos. A complexação com cobre não representou um aumento interessante na citotoxicidade dos compostos. O conjunto de resultados apresentados neste indica um potencial uso do composto dado-en no combate à leishmaniose. / Leishmaniasis is an infection caused by protozoa of the genus Leishmania. and transmitted by insects. Current treatments are expensive and time-consuming, involving Sb(V)-based compounds, lipossomal amphotericin B and miltefosine. Recent studies suggest that inhibition of trypanothione reductase (TR) could be a specific target in the development of new drugs, because it is essential and exclusive to trypanosomes. Thus, this work presents the synthesis of new compounds derived from iminodibenzyl with structures related to clomipramine, a known inhibitor of TR. These compounds were conjugates of iminodibenzyl with ethylenediamine, ethanolamine and diethylenetriamine, linked by epichlorohydrin. They were obtained with yields higher than 94% and their structures were confirmed by LC-MS and infrared spectroscopy. The relative affinity for copper of the new chelators was assessed by the recovery of calcein fluorescence, which showed that dado-dien has the highest affinity for Cu(II) among the new ligands. Metal complexes were synthesized by addition of copper(II) sulphate and studied by ultraviolet-visible spectroscopy, showing that the stoichiometries were [Cu(dadoea)]2+, [Cu(dado-en)2]2+ and [Cu(dado-dien)2]2+. Lipophilicity was assessed by computational methods, indicating that the complexes were all very lipophilic, with logP decreasing in the following order: [Cu(dado-en)2]2+ > [Cu(dado-dien)2]2+ > [Cu(dado-ea)]2+. Pro-oxidant activity assays by oxidation of DHR fluorimetric probe showed that [Cu(dado-ea)]2+ has the highest rate of oxidation, independent of hydrogen peroxide concentration, reaching its highest value when at ~ 10 &#181;M. Finally, the compounds were tested for citotoxicity to L. amazonensis promastigotes and RAW 264,7 macrophages. When the protozoa was exposed to varying concentrations of the compounds, it was observed that chelators ea, en and dien had the lowest values of IC50 (< 3 &#181;M). but they are too citotoxic to be used as drugs. Among the synthesized chelators, only dado-en presented a result in a pharmaceutically interesting range (IC50 19.9 ± 2.2 &#181;M). Against RAW 264,7 macrophages dado-en IC50 > 50 &#181;M. Complexation to copper did not enhance the citotoxicity of the compounds. Overall, the results in this study indicate a potential use of dado-en in combating leishmaniasis.

A cristalografia de raios-X e um método de singular importância para a determinação da estrutura de macromoléculas. A importância em resolver estruturas de proteínas continua a crescer em campos variando desde a bioquímica e biofísica básicas ate o desenvolvimento farmacêutico e biotecnologia. o presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalográficos de três diferentes moléculas biológicas. Calgranulina C de granulócitos porcinos, uma proteína que liga cálcio, supostamente envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parâmetros de rede a=b=54.35 e c=141.32&#197, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Várias tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituição molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos \"EF-hands\" quando da ligação ao íon cálcio podem ser responsáveis pelo insucesso dos resultados. Tripanotiona redutase de T. cruzi e um excelente alvo para modelagem de inibidores e potenciais drogas contra a doença de Chagas. O complexo mutante TR + GSPD foi cristalizado com parâmetros de rede a=b=92.7 e c=156.2&#197, grupo espacial P43. Um conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rígido contra as coordenadas da TR nativa. O modelo foi refinado a 2.4&#197 de resolução, Rfactor=19.8%. Fosfolipase A2 extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni foi cristalizada com parâmetros de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2&#197 e &#946=125.1&#176, grupo espacial C2. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o dímero da fosfolipase A2 de Crotalus atrox como modelo. A analise de sua seqüência de aminoácidos e necessária para posteriores ciclos de refinamento. / X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of macromolecules. The importance of solving protein structures continues to grow in fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development and biotechnology. The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological molecules. Calgranulin C from pig granulocytes, a calcium binding protein though to be involved in regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and c=141.32&#197, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results. Trypanothione reductase (TR) from T. cruzi is a target enzyme for modeling an inhibitor for Chagas´ disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with a=b=92.7 and c=156.2&#197, space group P43. A preliminary set of phases was obtained by rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined to 2.4&#197 resolution, Rfactor=19.8%. Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake Bothrops moojen; was crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2&#197 and &#946=125.1&#176, space group C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of phospholipase A2 from Crotalus atrox as a model. The aminoacid sequence analysis is needed for further refinement cycles.

A cristalografia de raios-X e um método de singular importância para a determinação da estrutura de macromoléculas. A importância em resolver estruturas de proteínas continua a crescer em campos variando desde a bioquímica e biofísica básicas ate o desenvolvimento farmacêutico e biotecnologia. o presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalográficos de três diferentes moléculas biológicas. Calgranulina C de granulócitos porcinos, uma proteína que liga cálcio, supostamente envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parâmetros de rede a=b=54.35 e c=141.32&#197, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Várias tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituição molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos \"EF-hands\" quando da ligação ao íon cálcio podem ser responsáveis pelo insucesso dos resultados. Tripanotiona redutase de T. cruzi e um excelente alvo para modelagem de inibidores e potenciais drogas contra a doença de Chagas. O complexo mutante TR + GSPD foi cristalizado com parâmetros de rede a=b=92.7 e c=156.2&#197, grupo espacial P43. Um conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rígido contra as coordenadas da TR nativa. O modelo foi refinado a 2.4&#197 de resolução, Rfactor=19.8%. Fosfolipase A2 extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni foi cristalizada com parâmetros de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2&#197 e &#946=125.1&#176, grupo espacial C2. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o dímero da fosfolipase A2 de Crotalus atrox como modelo. A analise de sua seqüência de aminoácidos e necessária para posteriores ciclos de refinamento. / X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of macromolecules. The importance of solving protein structures continues to grow in fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development and biotechnology. The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological molecules. Calgranulin C from pig granulocytes, a calcium binding protein though to be involved in regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and c=141.32&#197, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results. Trypanothione reductase (TR) from T. cruzi is a target enzyme for modeling an inhibitor for Chagas´ disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with a=b=92.7 and c=156.2&#197, space group P43. A preliminary set of phases was obtained by rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined to 2.4&#197 resolution, Rfactor=19.8%. Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake Bothrops moojen; was crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2&#197 and &#946=125.1&#176, space group C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of phospholipase A2 from Crotalus atrox as a model. The aminoacid sequence analysis is needed for further refinement cycles.

A doença de Chagas afeta cerca de 6 a 7 millhões de pessoas no mundo, principalmente América Latina. A busca de alternativas terapêuticas para esta enfermidade tem grande relevância para a sociedade, já que as opções atuais são limitadas, sendo disponível apenas o benznidazol (BZD) e nifurtimox. Os derivados nitroheterocíclicos são considerados compostos bioativos com número crescente de estudos na comunidade científica contra seu agente etiológico, o Trypanosoma cruzi. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo a identificação de derivados do 5-nitrofurano com atividade frente a diferentes cepas do T. cruzi, assim como estudar possíveis modo de ação desta classe de compostos. Esta investigação envolve estudos computacionais com o propósito de construir modelos quantitativos de relações estrutura-atividade (QSAR multivariado) que possam auxiliar na previsão de novas estruturas com perfil farmacológico otimizado. No presente trabalho foram realizadas as etapas de planejamento, síntese e identificação de 36 compostos com resultados satisfatórios quanto à identificação estrutural, pureza e rendimento, que foi da ordem de 70%. A determinação da atividade anti-T. cruzi in vitro dos compostos obtidos foi realizada frente às cepas Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 cl10 e Colombiana na forma epimastigota do parasito. A maioria dos compostos analisados apresentou maior capacidade de inibição de crescimento do parasito, comparado ao BZD: Silvio X10 cl1 - IC50 = 29,16 ±2,90 &#181;M, Y - IC50 = 40,40 ±3,37&#181;M, Bug 2149 cl10 - IC50 = 30,63 ±3,21 &#181;M, Colombiana - IC50 = 47,91 ±4,96 &#181;M. O composto mais ativo (BSF-35) apresentou os seguintes valores: Silvio X10 cl1 - IC50 = 3,17 ±0,32 &#181;M, Y - IC50 = 1,17 ±0,12 &#181;M, Bug 2149 cl10 - IC50 = 1,81 ±0,18 &#181;M e Colombiana - IC50 = 3,06 ±0,23 &#181;M. Foram realizados cálculos de propriedades moleculares das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (HCA) e análise de componentes principais (PCA), possibilitando o reconhecimento de padrões do conjunto. Considerando esta análise prévia, foram obtidos modelos QSAR com abordagem multivariada, aplicando algorítmo OPS e método de regressão por quadrados mínimos parciais, PLS. Os melhores modelos gerados foram obtidos considerando os compostos benzenos substituídos para as quatro cepas estudadas. Os descritores que mais influenciaram na análise foram o ClogP (coeficiente de partição) e cargas CHELPG. Considerando as informações obtidas, foram planejados e sintetizados quatro novos compostos com objetivo de obter compostos mais ativos e validar os modelos QSAR. Estes compostos apresentaram alta atividade frente a forma epimastigota das quatro cepas estudadas. Os compostos mais ativos foram avaliados quanto a citotoxicidade frente células LLC-MK2 e apresentaram seletividade até 25 vezes superior ao BZD. Estudos in vitro frente a forma amastigota da cepa Y em células U2OS foram realizados com metodologia fenotípica de análise de alto conteúdo (HCA\') e os compostos apresentaram atividade até 64 vezes superior ao BZD e com seletividade de até 50 vezes superior a este fármaco. Quanto à determinação da atividade dos compostos frente às enzimas tripanotiona redutase (TcTR) e glutationa redutase (GR), os compostos analisados não apresentaram atividade relevante, indicando não ser este o mecanismo desta classe de compostos. Com finalidade de explorar outro possível mecanismo de ação dos compostos 5-nitrofurânicos, foi realizada a análise de potencial de redução da membrana mitocondrial, porém a morte parasitária não foi atribuída à despolarização da membrana em estudos simultâneos com iodeto de propídio. / Chagas disease affects approximately 6-7 millions people worldwide, especially Latin America. The search for therapeutic alternatives for this disease is of great relevance to society, as current options are limited and there are only two available drugs: benznidazole (BZD) and nifurtimox. The nitroheterocyclic derivatives are considered bioactive compounds with increasing number of studies in the scientific community against its etiologic agent, Trypanosoma cruzi. In this sense, this work aims to identify derivatives of 5-nitrofuran with activity against different strains of T. cruzi, and to study possible mode of action of this compounds. This research involves computational studies to obtain models of quantitative structure-activity relationships (QSAR multivariate) that can help predict new structures with optimized pharmacological profile. In this work were carried out the design, synthesis and identification of 36 compounds with satisfactory results regarding the structural identification, purity and yield (approximately 70%). The determination of anti-T. cruzi activity in vitro of the compounds obtained was carried out with Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 CL10 and Colombiana strains of epimastigote form of the parasite. Most of the compounds examined showed greater capacity of growth inhibition of the parasite compared to the BZD (Silvio X10 CL1 - IC 50 = 29.16 ± 2.90 &#181;M, Y - IC50 = 40.40 ± 3,37&#181;M, 2149 CL10 Bug - IC 50 = 30.63 ± 3.21 &#181;M, Colombiana - IC 50 = 47.91 ± 4.96 &#181;M). The most active compound (BSF-35) showed the following values: Silvio X10 cl1 - IC 50 = 3.17 ± 0.32 uM, Y - IC 50 = 1.17 ± 0.12 &#181;M, Bug 2149 CL10 - IC50 = 1, 81 ± 0.18 &#181;M and Colombiana - IC 50 = 3.06 ± 0.23 &#181;M. Calculations were performed for the molecular properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis by hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), allowing the recognition of the set. Considering this preliminary analysis were obtained QSAR models with multivariate approach, using OPS algorithm and regression method of partial least squares, PLS. The best generated models were obtained considering the benzyl substituted compounds for the four strains. The descriptors that most influenced the analysis were ClogP (partition coefficient) and CHELPG charges. Considering the information obtained, four new compounds were designed and synthesized to obtain more active compounds and validate QSAR models. These compounds showed high activity against epimastigote form of the four strains studied. The most active compounds were evaluated for cytotoxicity against LLC-MK2 cells and the compounds selectivity values were up to 25 times higher than BZD. In vitro studies against amastigote form of the Y strain in U2OS cells were performed with phenotypic method of high content analysis (HCA\') and the compounds showed activity to 64 times higher than BZD and selectivity of up to 50 times. The activity of the compounds against trypanothione reductase enzymes (TcTR) and glutathione reductase (GR) showed no significant activity, indicating that this is not the mechanism of this class of compounds. In order to exploit another possible mechanism of action of 5-nitrofuran derivatives, analysis reduction of mitochondrial membrane potential was held, however the cell death was not attributed to membrane depolarization in simultaneous studies with propidium iodide.

A doença de Chagas afeta cerca de 6 a 7 millhões de pessoas no mundo, principalmente América Latina. A busca de alternativas terapêuticas para esta enfermidade tem grande relevância para a sociedade, já que as opções atuais são limitadas, sendo disponível apenas o benznidazol (BZD) e nifurtimox. Os derivados nitroheterocíclicos são considerados compostos bioativos com número crescente de estudos na comunidade científica contra seu agente etiológico, o Trypanosoma cruzi. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo a identificação de derivados do 5-nitrofurano com atividade frente a diferentes cepas do T. cruzi, assim como estudar possíveis modo de ação desta classe de compostos. Esta investigação envolve estudos computacionais com o propósito de construir modelos quantitativos de relações estrutura-atividade (QSAR multivariado) que possam auxiliar na previsão de novas estruturas com perfil farmacológico otimizado. No presente trabalho foram realizadas as etapas de planejamento, síntese e identificação de 36 compostos com resultados satisfatórios quanto à identificação estrutural, pureza e rendimento, que foi da ordem de 70%. A determinação da atividade anti-T. cruzi in vitro dos compostos obtidos foi realizada frente às cepas Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 cl10 e Colombiana na forma epimastigota do parasito. A maioria dos compostos analisados apresentou maior capacidade de inibição de crescimento do parasito, comparado ao BZD: Silvio X10 cl1 - IC50 = 29,16 ±2,90 &#181;M, Y - IC50 = 40,40 ±3,37&#181;M, Bug 2149 cl10 - IC50 = 30,63 ±3,21 &#181;M, Colombiana - IC50 = 47,91 ±4,96 &#181;M. O composto mais ativo (BSF-35) apresentou os seguintes valores: Silvio X10 cl1 - IC50 = 3,17 ±0,32 &#181;M, Y - IC50 = 1,17 ±0,12 &#181;M, Bug 2149 cl10 - IC50 = 1,81 ±0,18 &#181;M e Colombiana - IC50 = 3,06 ±0,23 &#181;M. Foram realizados cálculos de propriedades moleculares das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (HCA) e análise de componentes principais (PCA), possibilitando o reconhecimento de padrões do conjunto. Considerando esta análise prévia, foram obtidos modelos QSAR com abordagem multivariada, aplicando algorítmo OPS e método de regressão por quadrados mínimos parciais, PLS. Os melhores modelos gerados foram obtidos considerando os compostos benzenos substituídos para as quatro cepas estudadas. Os descritores que mais influenciaram na análise foram o ClogP (coeficiente de partição) e cargas CHELPG. Considerando as informações obtidas, foram planejados e sintetizados quatro novos compostos com objetivo de obter compostos mais ativos e validar os modelos QSAR. Estes compostos apresentaram alta atividade frente a forma epimastigota das quatro cepas estudadas. Os compostos mais ativos foram avaliados quanto a citotoxicidade frente células LLC-MK2 e apresentaram seletividade até 25 vezes superior ao BZD. Estudos in vitro frente a forma amastigota da cepa Y em células U2OS foram realizados com metodologia fenotípica de análise de alto conteúdo (HCA\') e os compostos apresentaram atividade até 64 vezes superior ao BZD e com seletividade de até 50 vezes superior a este fármaco. Quanto à determinação da atividade dos compostos frente às enzimas tripanotiona redutase (TcTR) e glutationa redutase (GR), os compostos analisados não apresentaram atividade relevante, indicando não ser este o mecanismo desta classe de compostos. Com finalidade de explorar outro possível mecanismo de ação dos compostos 5-nitrofurânicos, foi realizada a análise de potencial de redução da membrana mitocondrial, porém a morte parasitária não foi atribuída à despolarização da membrana em estudos simultâneos com iodeto de propídio. / Chagas disease affects approximately 6-7 millions people worldwide, especially Latin America. The search for therapeutic alternatives for this disease is of great relevance to society, as current options are limited and there are only two available drugs: benznidazole (BZD) and nifurtimox. The nitroheterocyclic derivatives are considered bioactive compounds with increasing number of studies in the scientific community against its etiologic agent, Trypanosoma cruzi. In this sense, this work aims to identify derivatives of 5-nitrofuran with activity against different strains of T. cruzi, and to study possible mode of action of this compounds. This research involves computational studies to obtain models of quantitative structure-activity relationships (QSAR multivariate) that can help predict new structures with optimized pharmacological profile. In this work were carried out the design, synthesis and identification of 36 compounds with satisfactory results regarding the structural identification, purity and yield (approximately 70%). The determination of anti-T. cruzi activity in vitro of the compounds obtained was carried out with Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 CL10 and Colombiana strains of epimastigote form of the parasite. Most of the compounds examined showed greater capacity of growth inhibition of the parasite compared to the BZD (Silvio X10 CL1 - IC 50 = 29.16 ± 2.90 &#181;M, Y - IC50 = 40.40 ± 3,37&#181;M, 2149 CL10 Bug - IC 50 = 30.63 ± 3.21 &#181;M, Colombiana - IC 50 = 47.91 ± 4.96 &#181;M). The most active compound (BSF-35) showed the following values: Silvio X10 cl1 - IC 50 = 3.17 ± 0.32 uM, Y - IC 50 = 1.17 ± 0.12 &#181;M, Bug 2149 CL10 - IC50 = 1, 81 ± 0.18 &#181;M and Colombiana - IC 50 = 3.06 ± 0.23 &#181;M. Calculations were performed for the molecular properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis by hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), allowing the recognition of the set. Considering this preliminary analysis were obtained QSAR models with multivariate approach, using OPS algorithm and regression method of partial least squares, PLS. The best generated models were obtained considering the benzyl substituted compounds for the four strains. The descriptors that most influenced the analysis were ClogP (partition coefficient) and CHELPG charges. Considering the information obtained, four new compounds were designed and synthesized to obtain more active compounds and validate QSAR models. These compounds showed high activity against epimastigote form of the four strains studied. The most active compounds were evaluated for cytotoxicity against LLC-MK2 cells and the compounds selectivity values were up to 25 times higher than BZD. In vitro studies against amastigote form of the Y strain in U2OS cells were performed with phenotypic method of high content analysis (HCA\') and the compounds showed activity to 64 times higher than BZD and selectivity of up to 50 times. The activity of the compounds against trypanothione reductase enzymes (TcTR) and glutathione reductase (GR) showed no significant activity, indicating that this is not the mechanism of this class of compounds. In order to exploit another possible mechanism of action of 5-nitrofuran derivatives, analysis reduction of mitochondrial membrane potential was held, however the cell death was not attributed to membrane depolarization in simultaneous studies with propidium iodide.

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Trypanosoma cruzi, causador da tripanossomíase americana, é um microrganismo exposto a uma variedade de espécies reativas de oxigênio, geradas como conseqüência do metabolismo de drogas tripanocidas, ou pelo hospedeiro como resposta fisiológica à invasão, além daqueles produzidos internamente em conseqüência dos processos oxidativos do parasita. Em qualquer circunstância, as células precisam proteger-se contra os produtos da redução parcial do oxigênio. Os tripanossomatídeos são aparentemente deficientes na defesa antioxidante. Embora possuindo uma superóxido dismutase, carecem de glutationa peroxidase e catalase, que são necessárias para a remoção do peróxido de hidrogênio. Além disso, glutationa, o maior composto sulfidrílico antioxidante em células de mamíferos, está presente em baixas concentrações nos tripanossomatídeos. No seu lugar, têm um composto sui generis, um conjugado de glutationa e de espermidina, conhecido como tripanotiona (N1, N8-bis(glutationil)espermidina), o qual junto com a tripanotiona redutase e o sistema peroxidase tripanotiona-dependente, parece estar envolvido no mecanismo de defesa antioxidante em Crithidia fasciculata. Este sistema parece existir em outros tripanossomatídeos, representando um importante alvo quimioterápico. A existência deste sistema metabólico em T. cruzi foi demonstrada inicialmente por uma baixa atividade peroxidásica tripanotiona-dependente, detectada em extratos celulares de formas epimastigotas e tripomastigotas. Imunoquimicamente, a existência deste sistema foi evidenciada ao se usar anticorpos heterólogos contra triparredoxina (Cf16) e triparredoxina peroxidase (Cf21) de C. fasciculata. Enquanto a reatividade em epimastigotas de T. cruzi é homogeneamente distribuída no citoplasma, as formas tripomastigotas apresentam uma reatividade descontínua localizada próxima à membrana plasmática. Os mesmos anticorpos policlonais foram utilizados para identificar por Western blot, as proteínas correspondentes em T. cruzi, sendo reconhecidas duas proteínas com massas moleculares aparente de 16 e 21 kDa, Tc16 e Tc21, respectivamente. Oligonucleotídeos foram então sintetizados baseados em regiões conservadas de seqüências codantes de DNA de peroxirredoxinas de tripanossomatídeos e de outros organismos e utilizados em ensaios de PCR com cDNA, amplificando-se um produto de 525 pb. Esta seqüência parcial apresentou uma homologia de 75% com o gene da triparredoxina peroxidase de C. fasciculata. No mesmo período foi depositada no GenBank (acc. n°. AJ012101) uma seqüência codante para uma proteína do tipo peroxirredoxina em T. cruzi e que apresentou uma homologia de 100% em relação à seqüência (correspondente às posições 1 a 525 de Acc. Nr. AJ012101). Utilizando a seqüência publicada, novos oligonucleotídeos correspondentes às regiões 5\' e 3\' foram desenhados, o gene putativo da triparredoxina peroxidase em T. cruzi (Tc21) foi amplificado a partir de DNA de T. cruzi por PCR, o produto clonado no vetor pET21b(+) e expresso em E.coli BL21(DE3). A proteína obtida apresentou atividade de tripanotiona peroxidase. Esta enzima, a triparredoxina peroxidase é membro de uma família de proteínas antioxidantes, denominadas de peroxirredoxinas, que são caracterizadas pela presença de dois domínios conservados - VCP, contendo as cisteínas envolvidas na catálise. Em relação à triparredoxina, apesar das várias tentativas empreendidas, o isolamento do respectivo gene foi infrutífero. No entanto, sua existência foi demonstrada por Western blot e imunofluorescência usando-se o anticorpo contra a triparredoxina de C. fasciculata. A triparredoxina de C. fasciculata é um membro da super-família das tiorredoxinas, com uma massa molecular de 16 kDa, maior que a tiorredoxina em vertebrados. Embora possuindo o motivo WCPPCR próximo à extremidade N-terminal, o qual é similar ao motivo WCGPCK(R), típico do sítio ativo das tiorredoxinas, a triparredoxina mostra uma baixa identidade em relação a estas últimas. A demonstração da existência de triparredoxina, triparredoxina peroxidase e tripanotiona redutase em T. cruzi sugere similaridade com o sistema de peroxidase descrito em C. fasciculata e que a defesa antioxidante em T. cruzi envolve um sistema enzimático mediado por tripanotiona e dependente de NADPH. As evidências disponíveis confirmam a existência do sistema peroxidase tripanotiona-dependente em T. cruzi, contrariando a afirmativa prévia da literatura que considerava a redução de peróxidos como uma reação não-enzimática. Esses resultados abrem a perspectiva de utilização do sistema como um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos. / The American trypanosome Trypanosoma cruzi is exposed to a variety of toxic oxygen metabolites normally produced by endogenous processes as well as by responses to drugs or the action of the immune system. In either case, the cells need to be protected against the products of the partial reduction of oxygen. Trypanosomes are particularly weak in antioxidant defenses. Although possessing superoxide dismutase activity, they lack glutathione peroxidase and catalase which are necessary for the removal of hydrogen peroxide. Moreover, glutathione, the major antioxidant sulphydryl compound in mammalian cells, is present in low concentration in trypanosomes. Instead they contain a unique cofactor, a glutathione-spermidine conjugate, known as trypanothione (N1, N8-bis(glutathionyl)spermidine) which together with its ancillary enzymes, trypanothione reductase and trypanothione-dependent peroxidase system, appears to play a central role in the antioxidant defense mechanism in C. fasciculate. This system seems to be widespread among trypanosomatids, being an important target for a direct chemotherapeutic attack. The existence of this metabolic system in the human pathogen T. cruzi is supported by a low trypanothione-dependent peroxidase activity. It was found in crude extracts of epimastigote and trypomastigote forms using t-butyl hydroperoxide as oxidant. The existence of this metabolic pathway in T. cruzi is demonstrated by immunohistochemistry using antibodies raised against tryparedoxin (Cf16) and tryparedoxin peroxidase (Cf21) from C. fasciculate. Epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi display strong immunoreactivity by indirect immunofluorescence with these antibodies. White in epimastigotes immunofluorescence is homogeneously distributed in the cytoplasm, in trypamastigostes - the infective form for vertebrates - it appears in a discontinuous manner closer to the cytoplasmic side of the plasmic membrane. These polyclonal antibodies were employed to identify, by Western blot, the correspondening T. cruzi proteins. Two proteins with apparent molecular masses of 16 and 21 kDa, Tc16 and Tc21, were, respectively, recognized. In addition, oligonucleotides were synthesized using sequences based on the conserved regions of DNA coding sequence of peroxiredoxin from trypanosomatids and other organisms. Using these primers in PCR assays with cDNA, a product with 525 bp was amplified. This partial gene sequence shared identity with the homologous enzyme of C. fasciculate. The partial tryparedoxin peroxidase gene sequence of T. cruzi (Tc21) obtained up to this point (corresponding to positions 1 to 525) matched 100% with a published sequence presumed to encode a peroxiredoxintype protein in T. cruzi (acc. nr. AJ012101). Taking advantage of this full-length open reading frame, the putative Tc21 gene from T. cruzi was amplified from genomic DNA by PCR, cloned the PCR product into the vector pET21b(+) and expressed in E.colli BL21(DE3). Activity of tryparedoxin peroxidase was mesured by an heterologous coupled system monitoring the NADPH consumption upon hydroperoxide addition. This enzyme is a member of the peroxiredoxin family of antioxidant proteins and is characterized by the presence of two conserved domains - VCP - containing redox active cysteines. Although attempted, the isolation of the tryparedoxin gene was not successfull. Notwithstanding, the existence of the protein was apparent as seen by Western blot and immunofluorescence using the C. fasciculate heterologous antibody. Tryparedoxin is a new member of the thioredoxin superfamily of proteins isolated from C. fasciculate. With a molecular weight of 16 kDa, it is larger than thioredoxin from vertebrates. Moreover, apart from the sequence motif WCPPC near its N-terminus, which is similar to the thioredoxin-type active site motif WCGPCK(R), tryparedoxin display low similarity to the classical thioredoxin. The active motif WCPPCR is common to all known tryparedoxins. The demonstration of the existence of tryparedoxin, tryparedoxin peroxidase and trypanothione reductase in T. cruzi suggests that the antioxidant defense of this pathogenic protozoan also depends on the NADPH-fuelled, trypanothione-mediated enzymatic hydroperoxide metabolism, similarly to the C. fasciculate metabolic pathway. As oppsed to previous claims, the available evidence confirms the existence of trypanothione peroxidase activity in T. cruzi, making the enzymes system as molecular targets for the design of trypanocidal compounds.