Le facteur de transcription BP1 humain est exprimé dans les cellules érythroïdes pendant le développement fœtal mais son niveau d’expression est réduit au stade adulte. Les études antérieures in vitro ont montré que BP1 est un répresseur du gène adulte de β-globine mais sa fonction dans la régulation des gènes ε et γ n’a pas été abordée à ce jour. Dans notre étude, nos analyses de BP1 humain ont été menées in vivo au stade embryonnaire en utilisant une lignée de souris transgénique surexprimant BP1 dans les cellules érythroïdes définitives murines. Au niveau protéique, BP1 humain est exprimé aux âges E12.5 et E13.5 dans les cellules érythroïdes fœtales des embryons transgéniques. Toutefois, les niveaux de BP1 humain ne perturbent pas l’érythropoïèse définitive fœtale: les embryons transgéniques ne sont pas anémiques et ne meurent pas in utero. La surexpression de BP1 humain altère tout de même le niveau endogène des facteurs de transcription Ikaros et SOX6 impliqués dans la régulation des gènes de β-globine durant l’érythropoïèse définitive fœtale murine. Chez les embryons doubles transgéniques exprimant BP1 et les gènes humains de β-globine à E12.5, l’expression du gène adulte β est réduite alors que celle des gènes ε et γ est non réprimée. Les mesures d’expression des gènes humains de β-globine effectuées en absence d’Ikaros à E12.5 précisent le rôle de BP1 humain dans l’activation du gène embryonnaire ε. Dans les cellules érythroïdes fœtales murines dépourvues d’Ikaros à E12.5, BP1 humain augmente grandement l’expression des facteurs de transcription EKLF et BCL11A et semble déréprimer l’expression de SOX6, ce qui conduit à une répression des gènes fœtaux et une activation du gène adulte β au jour embryonnaire murin suivant. Puisque BP1 atténue l’altération de l’expression des gènes fœtaux et adultes causée par l’absence d’Ikaros, nous proposons que BP1 et Ikaros soient liés dans les mécanismes de transcription des gènes humains de β-globine. / The transcription factor BP1 is expressed in erythroid cells during fetal development but is downregulated at adult stage. In vitro previous studies revealed that BP1 acts as a repressor of adult β-globin gene expression but its function in ε and γ globin gene regulation has not been investigated so far. In our studies, BP1 functions analyses were proceeded in vivo at embryonic stage by using a transgenic mouse line overexpressing human BP1 in murine definitive erythroid cells. At protein level, human BP1 is expressed in E12.5 and E13.5 fetal erythroid cells of transgenic embryos. However, levels of human BP1 do not impair murine fetal definitive erythropoiesis : transgenic embryos are not anemic and survive during gestation. Overexpression of human BP1 impairs, nonetheless, endogenous level of the transcription factors Ikaros and SOX6 involved in β-globin gene regulation during murine fetal definitive erythropoiesis. In double transgenic mice expressing BP1 and human β-globin genes at embryonic day E12.5, β gene expression is reduced whereas ε- and γ-globin genes are not repressed. Measurements of β-globin gene expression in absence of Ikaros pinpoint the role of human BP1 in embryonic ε-globin gene activation. In E12.5 Ik-/- murine fetal erythroid cells, human BP1 highly increases EKLF and BCL11A transcription level and seems to derepress SOX6 expression which lead to γ silencing and β activation at E13.5. Since BP1 attenuates globin gene alterations caused by absence of Ikaros, we propose that BP1 and Ikaros are linked in transcriptional mechanisms of human β-globin genes.

An understanding of the human fetal to adult hemoglobin switch offers the potential to ameliorate β-type globin gene disorders such as sickle cell anemia and β-thalassemia through activation of the fetal γ-globin gene. Chromatin modifying complexes, including MBD2-NuRD and GATA-1/FOG-1/NuRD play a role in γ-globin gene silencing, and Mi2β (CHD4) is a critical component of NuRD complexes. In the studies presented in Chapter 2, we observed that the absence of MBD2 in a sickle cell mouse model leads to a decrease in the number of sickled cells observed in the peripheral blood, and significantly increases survival in these mice. Although further studies will be necessary to fully understand the effect of MBD2 knockout in sickle cell disease mice, absence of MBD2 appears to partially ameliorate the sickle cell anemia phenotype in vivo. In the studies presented in Chapter 3, we observed that knockdown of Mi2β relieves γ-globin gene silencing in β-YAC transgenic murine CID hematopoietic cells and in CD34+ progenitor derived human primary adult erythroid cells. We show that independent of MBD2-NuRD and GATA-1/FOG-1/NuRD, Mi2β binds directly to and positively regulates both the KLF1 and BCL11A genes, which encode transcription factors critical for γ-globin gene silencing during β-type globin gene switching. Remarkably, less than 50% knockdown of Mi2β is sufficient to significantly induce γ-globin gene expression without disrupting erythroid differentiation of primary human CD34+ progenitors. These results indicate that Mi2β is a potential target for therapeutic induction of fetal hemoglobin.

Le processus conduisant à la prolifération et différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en cellules de toutes les lignées sanguines s’appelle l’hématopoïèse. Bien que l'engagement des CSH soit régi par les cytokines, les facteurs de transcription, les modificateurs épigénétiques et la niche des CSH, notre groupe a constaté que leur engagement vers la lignée érythroïde dépendait aussi du métabolisme de la glutamine. La glutaminolyse contribue à la biosynthèse des nucléotides de novo ainsi qu’à la production de l'alpha-kétoglutarate (αKG), intermédiaire métabolique du cycle TCA (Oburoglu et al. 2014). Il est cependant important de noter que la différenciation érythroïde est un processus unique, où chaque cellule fille est structurellement et fonctionnellement différente de sa cellule mère. Chaque division définit un stade de différenciation précis avec un dernier cycle de division produisant un réticulocyte énucléé. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que les réseaux métaboliques mobilisés dans les progéniteurs érythroïdes changent en fonction du stade de différenciation et que ces réseaux régulent la transition des progéniteurs d'un stade à l'autre.Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les états métaboliques associés aux différents stades de différenciation des progéniteurs érythroïdes. Nous avons ainsi montré qu'aux stades précoces de différenciation érythroïde, avant la différenciation terminale, les progéniteurs hématopoïétiques présentent une activité métabolique accrue avec un niveau de phosphorylation oxydative (OXPHOS) plus élevé. Ces données sont en corrélation avec l'augmentation de la génération de l’αKG à ces stades de différenciation. De plus, nous avons constaté une augmentation de l’OXPHOS de ces progéniteurs en présence d’αKG exogène. Cependant, la différenciation terminale des précurseurs érythroïdes, caractérisée par la perte de la masse mitochondriale et de leur potentiel membranaire, est associée à une diminution du niveau d'OXPHOS. Ainsi, l'administration exogène d’αKG, a fortement atténué la différenciation érythroïde terminale et l'énucléation, sans affecter la différenciation des pro-érythroblastes. Inversement, un antagoniste de l’αKG (diméthyloxalylglycine, DMOG) n'a pas altéré la différenciation terminale ou l'énucléation, malgré l'abrogation de l'OXPHOS dans les érythroblastes.Ces données suggèrent que la production d’αKG et sa contribution à l’OXPHOS perturbent l'énucléation des globules rouges. C'est pourquoi, dans le but de réduire les niveaux intracellulaires d’αKG, nous avons inhibé l’expression de l'isocitrate déshydrogénase I (IDH1), enzyme cytosolique catalysant la conversion de l'isocitrate en αKG. Cependant, comme IDH1 peut catalyser les réactions dans les deux sens, la diminution de son expression pourrait également augmenter les niveaux d’αKG. En effet, nous avons constaté que le knockdown d'IDH1 entraînait une forte atténuation de la différenciation terminale et de l'énucléation des précurseurs érythroïdes. Cet effet est probablement dû à un déséquilibre de la disponibilité des substrats ; ainsi l’administration ectopique de l’αKG ainsi que du citrate renforce l’altération de la différenciation terminale des précurseurs érythroïdes IDH1-/- ainsi que leur énucléation. Cette étude identifie donc un rôle crucial pour le métabolite αKG dans la régulation de la fonction mitochondriale et de l’OXPHOS, processus qui sont une condition sine qua non pour la différenciation des précurseurs érythroïdes au stade proérythroblaste. Nous montrons en outre que la suppression d’OXPHOS et la catalyse d’intermédiaires du TCA, substrats d’IDH1, sont requis pour les phases terminales de la différenciation érythroïde et l'énucléation.En conclusion, les résultats obtenus au cours de ma thèse mettent en évidence la nature dynamique des réseaux métaboliques qui régulent la progression des précurseurs érythroïdes tout au long des différents stades de la différenciation érythroïde. / Hematopoiesis is the process whereby hematopoietic stem cells (HSCs) proliferate and differentiate to all blood cell lineages. While HSC commitment is known to be regulated by cytokines, transcription factors, epigenetic modifiers and the HSC niche, our group found that specification of HSCs to the red cell lineage is dependent on glutamine metabolism. Glutaminolysis contributes to de novo nucleotide biosynthesis and to the generation of the alpha-ketoglutarate (αKG) TCA cycle metabolite (Oburoglu et al. 2014). Importantly though, erythroid differentiation is a unique process as each daughter cell is structurally and functionally different from its parent cell. Each division defines a stage of differentiation with the final division cycle resulting in the production of an enucleated reticulocyte which further matures to a biconcave erythrocyte. Thus, we hypothesized that progenitor metabolic networks change as a function of the erythroid differentiation stage and moreover, that they regulate the transition of progenitors from one stage of differentiation to the next.During my PhD, I assessed the metabolic alterations that occur as a function of the erythroid differentiation stage. We showed that at early stages of human red cell development, prior to terminal differentiation, hematopoietic progenitors exhibited an increased metabolic activity with a significantly higher level of oxidative phosphorylation (OXPHOS). This correlated with the increased generation of αKG and indeed, we found that ectopic αKG directly augmented OXPHOS in these progenitors. However, the terminal differentiation of erythroid precursors, characterized by the loss of mitochondrial mass and membrane potential, was associated with a decreased level of OXPHOS. Notably, ectopic αKG, which did not alter pro-erythroblast erythroid differentiation, severely attenuated terminal differentiation and enucleation. Conversely, an αKG antagonist (dimethyloxalyl glycine, DMOG) did not negatively impact on terminal differentiation or enucleation despite abrogating OXPHOS in erythroblasts.These data suggested that the production of αKG and its subsequent contribution to oxidative phosphorylation perturb red cell enucleation. We therefore downregulated isocitrate dehydrogenase I (IDH1), the cytosolic enzyme that catalyzes the conversion of isocitrate to αKG, by an shRNA approach in an attempt to decrease αKG levels. However, because IDH1 can catalyze both the forward and reverse reactions, its downregulation could also increase αKG levels. Indeed, we found that IDH1 knockdown resulted in a severe attenuation of terminal erythroid differentiation and enucleation. This effect was likely due to an imbalance in substrate availability––both ectopic αKG as well as citrate further decreased polychromatic to orthochromatic erythroblast differentiation and the subsequent enucleation of IDH1-knockdown erythroid precursors. Thus, the present study identifies a crucial role for the αKG metabolite in regulating mitochondrial function and oxidative phosphorylation, processes that are a sine qua non for erythroid precursors at the pro-erythroblast stage. We further show that terminal erythroid differentiation and enucleation requires OXPHOS suppression and the IDH1-mediated enzymatic catalysis of its TCA substrates.To conclude, the results generated during my PhD highlight the dynamic nature of the metabolic networks that regulate the progression of erythroid precursors through the distinct stages of erythroid differentiation.

Avec plus de 100 milliards de globules rouges produits chaque jour, le lignage érythroïde présente la plus grande capacité de production cellulaire chez le mammifère adulte. Cette production requiert une balance fine entre la prolifération cellulaire, régulée principalement par la voie de signalisation érythropoïétine (Epo)/PI3K/Akt, et la différenciation érythroïde induite par le couple de facteurs de transcription GATA-1/FOG-1. Des interconnexions entre ces deux grands systèmes ont été décrites dans le laboratoire : 1) le facteur de transcription GATA-1 est phosphorylé par Akt en réponse à l’Epo et cette phosphorylation semble avoir un rôle dans la différenciation érythroïde ; 2) GATA-1 est capable d’interagir avec la protéine du rétinoblastome pRb, impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, et le complexe formé est nécessaire à l’érythropoïèse terminale.L'objectif de ma thèse était d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la balance prolifération/différenciation cellulaire au cours de l’érythropoïèse, et en particulier de déterminer le rôle moléculaire et physiologique de la phosphorylation de GATA-1 par Akt en réponse à l’Epo. Nos travaux ont montré que cette phosphorylation est une des clefs de la dynamique de l’érythropoïèse. Dans sa forme non phosphorylée, GATA-1 ralentit le cycle cellulaire via le complexe GATA-1/pRb/E2F. Cette étape préliminaire est nécessaire à la mise en place de la différenciation érythroïde terminale. La phosphorylation de GATA-1 induit d’une part la dissociation de GATA-1/pRb/E2F favorisant l’expansion cellulaire, et d’autre part la formation du complexe GATA-1/FOG-1 nécessaire à l’activation des gènes érythroïdes. Ce modèle apporte une explication moléculaire au blocage de la différenciation érythroïde terminale induite par le mutant GATA-1V205G qui n’interagit pas avec FOG-1. Ainsi, la phosphorylation constitutive de GATA-1V205G et l’augmentation de la quantité relative de FOG-1 permettent de restaurer la différenciation érythroïde induite par ce mutant in vitro. Enfin, l’étude d’un modèle murin exprimant une protéine GATA-1 non phosphorylable par Akt montre l’apparition d’une anémie létale lorsque la voie IGF-1 est inhibée. Cela démontre l’importance de la dynamique moléculaire induite par la phosphorylation de GATA-1, et met en évidence le rôle majeur de l’IGF-1 dans l’érythropoïèse in vivo.En conclusion, nous proposons un nouveau modèle moléculaire de la régulation de la balance prolifération/différenciation érythroïde dans lequel la phosphorylation de GATA-1 par Akt coordonne la distribution de GATA-1 dans deux complexes protéiques fonctionnels différents : GATA-1/pRb/E2F versus GATA-1/FOG-1. Nous mettons également en évidence l’IGF-1 comme acteur central de la compensation mise en place in vivo pour pallier à l’absence de phosphorylation de GATA-1. / With more than 100 billion red blood cells generated every day, the erythroid lineage has the largest output of cell production in adult mammals. This production requires a tight balance between cell proliferation, mainly controlled by erythropoietin (Epo)/PI3K/Akt signaling pathway, and erythroid differentiation induced by GATA-1 and FOG-1 transcription factors. Various links between these two processes have been previously demonstrated in the laboratory: 1) Epo-activated Akt directly phosphorylates GATA-1 transcription factors, and this phosphorylation seems to be involved in erythroid differentiation; 2) GATA-1 binds to the cell cycle regulator retinoblastoma protein (pRb), and the resulting complex is essential for terminal erythropoiesis.We investigated the molecular mechanisms involved in the cell proliferation/differentiation balance during terminal erythropoiesis; in particular, we studied the molecular and physiological role of Epo-induced GATA-1 phosphorylation. Our findings suggest that this phosphorylation is one of the key processes in erythropoiesis dynamics. In its unphosphorylated form, GATA-1 can break cell cycle progression via GATA-1/pRb/E2F complex. This preliminary step is necessary for terminal erythroid differentiation. GATA-1 phosphorylation promotes GATA-1/pRb/E2F dissociation, allowing cell cycle progression, and GATA-1/FOG-1 binding, necessary to activate erythroid genes. Our model provides a molecular explanation for the arrest of terminal erythroid differentiation observed in the non-FOG-1-binding mutant GATA-1V205G. We show that the constitutive phosphorylation of GATA-1V205G and the increase of FOG-1 protein amount rescue erythroid differentiation in vitro. Finally, knock-in expression of unphosphorylatable GATA-1 in mice leads to lethal anemia when the IGF-1 signaling pathway is inhibited. This shows the importance of the molecular dynamics of GATA-1 phosphorylation, and highlights the major role of IGF-1 in erythropoiesis, in vivo.In conclusion, we propose a new molecular model for the control of the balance between proliferation and erythroid differentiation. GATA-1 phosphorylation by Akt coordinates the involvement of GATA-1 in two different functional protein complexes: GATA-1/pRb/E2F and GATA-1/FOG-1. We also highlight the major role of IGF-1 in compensating for the lack of GATA-1 phosphorylation in vivo.

The aim of this thesis is to investigate the effect of genetic mutations on the pathophysiology of two human disorders: Diamond-Blackfan Anemia (DBA) and isolated congenital nail dysplasia. The first part of this thesis (Paper I-III) investigates the mechanism associated with DBA. DBA is a rare bone marrow failure syndrome characterized by the absence or decrease of erythroid precursor cells. The disease is further associated with growth retardation, malformations, predisposition to malignant disease and heterozygous mutations in ribosomal protein (RP) genes. The second part of this thesis (Paper IV) investigates the genetic basis of isolated autosomal recessive nail dysplasia characterized by pachyonychia and onycholysis of both finger- and toenails. It further dissects the molecular mechanisms regulating nail development. In the first study, we investigated the previously reported RPS19/PIM-1 interaction by generating a combined Rps19/Pim-1 knockout mouse model. We found that allelic Rps19 insufficiency and Pim-1 deficiency have a cooperative effect on murine hematopoiesis resulting in increased myeloid cellularity associated with cell cycle alterations and reduced apoptosis. In the second study, we analyzed primary fibroblasts from DBA patients with truncating mutations in RPS19 or RPS24 and observed a marked delay in cellular growth associated with specific cell cycle defects. In the third study, we discovered that recombinant RPS19 binds its own mRNA and that the binding is altered when two DBA-associated RPS19 mutations are introduced. In the fourth study, we identified mutations in the WNT signaling receptor Frizzled 6 (FZD6). We observed that the nonsense mutant fails to interact with the first downstream effector Dishevelled. Fzd6 mutant mice displayed claw malformations and we detected a transient Fzd6 expression in the distal digits at the embryonic time point for nail development. In summary, this thesis elucidates several mechanisms in the etiology of DBA and congenital nail dysplasia and mechanisms regulating nail development.

Se realizó el estudio histológico del timo de lubina, con el fin de conocer la arquitectura del microambiente tímico y las relaciones estructurales de sus diferentes componentes. Las células linfoides sufren procesos de muerte celular programada por apoptosis, no descrita previamente en timo de peces; indicando la existencia de procesos de selección negativa durante su diferenciación intratímica. Existen células interdigitadas, no descritas previamente en peces. Hay áreas mielopoyéticas, con actividad eritropoyética y granulopoyética heterófila. La fragilidad de la barrera epitelial, que separa la cavidad branquial del parénquima tímico, puede verse incrementada por la presencia de macrófagos intraepiteliales y macrófagos con inmunoglobulinas de superficie. El transito de células sanguíneas a través de la capa de células epitelio-reticulares limitantes y de capilares sanguíneos indican la carencia de barrera hematotímica. Estos datos sugieren la existencia de procesos antígen o dependiente y la persistencia de funciones propias de órgano linfoide secundario en timo de lubina. / The histological study of the sea bass thymus was performed to know the architecture of the thymic microenvironment and the structural relationships of its different components. The lymphoid cells suffer processes of programmed cell death by apoptosis, not described previously in fish thymus, indicating the existence of negative selection processes during its intrathymic differentiation. There are interdigitating cells, which has not described before in fish. Exist myelopoiesis areas, with erythropoietic and heterophilic granulopoietic activity. The fragility of the epithelial barrier, that separates the branchial cavity from the thymic parenchyma, is increased by the presence of intraepithelial macrophages and macrophages with surface immunoglobulins. The traffic of blood cells across the layer of limiting reticular epithelial cells and blood capillaries indicate the lack of hemato-thymic barrier. This information suggests the existence of antigen dependent process and the p ersistence of own functions of secondary lymphoid organ in thymus of sea bass.

Le facteur de transcription BP1 humain est exprimé dans les cellules érythroïdes pendant le développement fœtal mais son niveau d’expression est réduit au stade adulte. Les études antérieures in vitro ont montré que BP1 est un répresseur du gène adulte de β-globine mais sa fonction dans la régulation des gènes ε et γ n’a pas été abordée à ce jour. Dans notre étude, nos analyses de BP1 humain ont été menées in vivo au stade embryonnaire en utilisant une lignée de souris transgénique surexprimant BP1 dans les cellules érythroïdes définitives murines. Au niveau protéique, BP1 humain est exprimé aux âges E12.5 et E13.5 dans les cellules érythroïdes fœtales des embryons transgéniques. Toutefois, les niveaux de BP1 humain ne perturbent pas l’érythropoïèse définitive fœtale: les embryons transgéniques ne sont pas anémiques et ne meurent pas in utero. La surexpression de BP1 humain altère tout de même le niveau endogène des facteurs de transcription Ikaros et SOX6 impliqués dans la régulation des gènes de β-globine durant l’érythropoïèse définitive fœtale murine. Chez les embryons doubles transgéniques exprimant BP1 et les gènes humains de β-globine à E12.5, l’expression du gène adulte β est réduite alors que celle des gènes ε et γ est non réprimée. Les mesures d’expression des gènes humains de β-globine effectuées en absence d’Ikaros à E12.5 précisent le rôle de BP1 humain dans l’activation du gène embryonnaire ε. Dans les cellules érythroïdes fœtales murines dépourvues d’Ikaros à E12.5, BP1 humain augmente grandement l’expression des facteurs de transcription EKLF et BCL11A et semble déréprimer l’expression de SOX6, ce qui conduit à une répression des gènes fœtaux et une activation du gène adulte β au jour embryonnaire murin suivant. Puisque BP1 atténue l’altération de l’expression des gènes fœtaux et adultes causée par l’absence d’Ikaros, nous proposons que BP1 et Ikaros soient liés dans les mécanismes de transcription des gènes humains de β-globine. / The transcription factor BP1 is expressed in erythroid cells during fetal development but is downregulated at adult stage. In vitro previous studies revealed that BP1 acts as a repressor of adult β-globin gene expression but its function in ε and γ globin gene regulation has not been investigated so far. In our studies, BP1 functions analyses were proceeded in vivo at embryonic stage by using a transgenic mouse line overexpressing human BP1 in murine definitive erythroid cells. At protein level, human BP1 is expressed in E12.5 and E13.5 fetal erythroid cells of transgenic embryos. However, levels of human BP1 do not impair murine fetal definitive erythropoiesis : transgenic embryos are not anemic and survive during gestation. Overexpression of human BP1 impairs, nonetheless, endogenous level of the transcription factors Ikaros and SOX6 involved in β-globin gene regulation during murine fetal definitive erythropoiesis. In double transgenic mice expressing BP1 and human β-globin genes at embryonic day E12.5, β gene expression is reduced whereas ε- and γ-globin genes are not repressed. Measurements of β-globin gene expression in absence of Ikaros pinpoint the role of human BP1 in embryonic ε-globin gene activation. In E12.5 Ik-/- murine fetal erythroid cells, human BP1 highly increases EKLF and BCL11A transcription level and seems to derepress SOX6 expression which lead to γ silencing and β activation at E13.5. Since BP1 attenuates globin gene alterations caused by absence of Ikaros, we propose that BP1 and Ikaros are linked in transcriptional mechanisms of human β-globin genes.

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2009. / Title from PDF title page (viewed on July 13, 2010). Includes bibliographical references.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:13:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fertrin_KleberYotsumoto_D.pdf: 1904934 bytes, checksum: a74beda8b565fcdc3f59ad37d66ca23e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As hemoglobinopatias são distúrbios hereditários em que uma mutação genética leva a alteração da produção normal de hemoglobina, tal como na anemia falciforme e nas talassemias ß. Na maioria dessas doenças, ocorre anemia com necessidade transfusional variável, o que pode acarretar sobrecarga corporal de ferro. Na talassemia ß intermediária, ocorre aumento espontâneo e desproporcional da absorção do ferro, com consequente excesso desse metal mesmo na ausência de transfusões. Com a evolução da terapia transfusional e o aumento da expectativa de vida desses pacientes, o conhecimento sobre a regulação do metabolismo do ferro tornou-se fundamental para melhor controle da sobrecarga de ferro. O principal regulador desse metabolismo é a hepcidina, um polipeptídeo produzido majoritariamente pelo fígado, porém também sintetizado por células do sistema fagocítico-mononuclear, em que seu papel é pouco conhecido. Uma citocina capaz de suprimir a produção de hepcidina é o GDF-15 (fator de crescimento e diferenciação 15). Neste estudo, com a avaliação de amostras de sangue de 103 pacientes com anemia falciforme, talassemia ß intermediária, anemia por deficiência de cobalamina ou outros tipos de anemia, constatou-se que o aumento dos níveis desse fator ocorre tanto em quadros de hemólise crônica quanto na presença de eritropoese ineficaz, constituindo um sinal da medula óssea modulador da absorção de ferro nos estados de aumento da eritropoese. Entretanto, evidenciou-se que a associação de supressão da hepcidina com altos níveis de GDF-15 ocorre nas hemoglobinopatias, mas não nas demais causas de anemia. Na anemia megaloblástica, a ausência de sobrecarga de ferro com níveis normais de hepcidina ao diagnóstico e sua queda durante o tratamento sugerem regulação da hepcidina independente de GDF-15 neste tipo de anemia. A análise da razão hepcidina/ferritina mostrou-se mais fidedigna que os níveis de hepcidina circulante na identificação dos estados em que há propensão a absorção aumentada de ferro por alta atividade eritropoética, e sugerem que o estado inflamatório crônico da anemia falciforme poderia exercer um fator protetor contra sobrecarga de ferro, quando comparados a talassemia intermediária, pela elevação relativa da produção de hepcidina. Além disso, observou-se uma correlação negativa entre a expressão gênica de hepcidina (gene HAMP) em monócitos humanos e os níveis de GDF-15, denotando um provável efeito regulatório semelhante ao descrito em hepatócitos. Não se identificou correlação entre essa expressão nos monócitos e marcadores de sobrecarga de ferro, corroborando a hipótese de a hepcidina ter outra função nessas células, não relacionada diretamente à absorção de ferro. Pacientes com anemia falciforme em uso de hidroxiureia apresentaram maiores níveis de expressão de hepcidina monocítica e obteve-se evidência in vitro de uma ação estimuladora dessa expressão por esse fármaco, caracterizando a hidroxiureia com potencial atividade agonista de hepcidina, de futuro interesse em estudos de sua aplicação clínica nos estados em que exista deficiência monocítica dessa proteína. Trata-se do primeiro estudo avaliando comparativamente hemoglobinopatias e outros tipos de anemia com e sem componente eritropoético ineficaz do ponto de vista dos reguladores da absorção de ferro, além de caracterizar, pela primeira vez, a expressão de hepcidina extra-hepática nos distúrbios da síntese de hemoglobina / Abstract: Hemoglobinopathies are inherited diseases in which a genetic mutation leads to abnormal production of hemoglobin, such as in sickle cell anemia or in the ß-thalassemias. In the majority of these disorders, anemia causes variable degrees of transfusion dependency, which may lead to iron overload. In ß-thalassemia intermedia, an increase in iron absorption occurs spontaneously and regardless from the total body iron stores, generating iron overload even in the absence of repeated transfusions. Owing to advances in transfusion medicine and to the improvement in the overall life expectancy of patients with hemoglobin disorders, further knowledge on the regulation of iron metabolism has become increasingly important for appropriate management of iron overload. The main regulator of iron metabolism is hepcidin, a polypeptide mainly produced by the liver, although its synthesis also occurs in phagocytic-mononuclear cells, in which its role is less known. Growth differentiation factor 15 (GDF-15) is a cytokine capable of downregulating hepcidin production. This study analyzed 103 blood samples from patients with sickle cell anemia, ß-thalassemia intermedia, cobalamin deficiency anemia and other types of anemia, showing elevation of GDF-15 plasmatic levels both in chronic hemolytic states and ineffective erythropoiesis, thus characterizing it as a signalling molecule produced by the bone marrow to stimulate iron absorption in the presence of increased erythropoietic activity. Nevertheless, hepcidin suppression was only associated with high levels of GDF- 15 in the hemoglobinopathies. In megaloblastic anemia, absence of iron overload with normal hepcidin levels, associated with their reduction during treatment, suggest that hepcidin regulation occurs independently from GDF-15 in thie type of anemia. Analysis of hepcidin/ferritin ratio proved to be more reliable to identify patients prone to increased iron absorption due to erythropoietic hyperactivity than hepcidin levels themselves and suggests that the chronic inflammatory state in sickle cell anemia may protect from iron overload by relatively increasing hepcidin levels in comparison to levels found in thalassemia intermedia. Moreover, we found a negative correlation between GDF-15 levels and HAMP monocytic expression, a regulatory mechanism similar to what has been observed in hepatic cell lines. In further analyses of the present study, no correlation between hepcidin expression and iron overload markers was observed in monocytes from patients with hemoglobinopathies, corroborating the hypothesis that the monocytic counterpart of hepcidin could have a different function, unrelated to iron regulation. Patients with sickle cell anemia under hydroxyurea treatment have been shown to present with higher levels of hepcidin expression in monocytes, and a cell culture model managed to demonstrate the upregulating effect of hydroxyurea in vitro, thus highlighting the possibility of exploring this drug in the future as a potential hepcidin agonist and, therefore, as a therapeutic intervention in diseases with impaired monocytic hepcidin production. This is the first study of molecules involved in iron metabolism regulation comparing hemoglobinopathies and other anemia types with and without ineffective erythropoiesis. Furthermore, this is the first characterization of extra-hepatic hepcidin expression in hemoglobin disorders / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) possèdent deux propriétés fondamentales : l'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en lignées hématopoïétiques de tout type. Les CSH se maintiennent dans la moelle osseuse et se renouvellent par division asymétrique. En revanche, les divisions symétriques caractérisent les cellules qui s'engagent dans la différenciation. L'environnement pauvre en oxygène de la moelle osseuse favorise la glycolyse anaérobique et l'oxydation des acides gras, préservant, respectivement, la quiescence et les divisions asymétriques. Que l'engagement des CSH vers la différenciation lymphoïde, myéloïde ou érythroïde dépende ou entraîne une reprogrammation métabolique n'est toujours pas connu. En effet, de nombreuses études ont montré que cytokines et contacts cellulaires sont indispensables pour l'engagement des CSH vers une lignée donnée, alors que l'impact potentiel des nutriments et du métabolisme sur ce processus reste très peu étudié. La différenciation est associée à une prolifération qui nécessite des besoins métaboliques accrus pouvant être supportés par diverses sources d'énergie, telles que le glucose, les acides gras, le lactate ou la glutamine. Le glucose et la glutamine sont des précurseurs de l'ATP, des lipides et des nucléotides. Toutefois, leurs contributions relatives aux voies métaboliques contrôlant l'engagement des CSH n'ont pas été évaluées. Pour autant, nos études ainsi que celles menées par d'autres laboratoires ont montré que l'expression du transporteur de glucose Glut1 n'augmente qu'au cours des dernières étapes de la différenciation érythroïde, suggérant l'implication potentiel d'autres nutriments dans la régulation des étapes précoces de l'engagement vers la voie érythroïde. Ainsi, mon travail de thèse a consisté à déterminer si la disponibilité et l'utilisation des nutriments régulent la différenciation des CSH vers la lignée érythroïde. De fait, j'ai montré que le transporteur de glutamine ASCT2 est hautement exprimé dans les CSH et que la répression d'ASCT2 ou le blocage du métabolisme de la glutamine empêche la différenciation érythroïde des CSH, les détournant vers la voie myéloïde, même en présence d'érythropoïétine. Dans ces conditions, nous avons montré que la différenciation érythroïde ne pouvait pas être restaurée par l'ajout d'intermédiaires du cycle de Krebs, alors que qu'elle était dépendante de la biosynthèse de novo de nucléotides. Étonnamment, le 2-désoxyglucose (2-DG), un analogue du glucose inhibant la glycolyse, accélérait l'érythropoïèse. Nous avons aussi mis en évidence in vivo, en condition de stress érythropoïétique, des influences différentes du catabolisme de la glutamine et celui du glucose dans la modulation de l'érythropoïèse. Afin de mieux élucider les mécanismes par lesquels la glutamine module la différenciation érythroïde des CSH, nous avons étudié les voies métaboliques qu'elle emprunte. Des expériences de suivi de la glutamine marquée ont montré que l'entrée de la glutamine dans le cycle de Krebs est requise pour une érythropoïèse efficace. Par contre, nous avons montré que la synthèse de novo des nucléotides était l'étape limitante de la différenciation érythroïde. De plus, nous avons observé que la différenciation érythroïde accélérée en présence du 2-DG était associée à une augmentation importante du niveau des pentoses phosphates, précurseurs des nucléotides. Ainsi, l'utilisation de la voie des pentoses phosphates par le glucose, plutôt que la glycolyse, était essentielle pour l'érythropoïèse. En conclusion, mon travail de thèse a montré que la production de nucléotides via le métabolisme coordonné du glucose et de la glutamine est la condition sine qua non pour l'engagement des CSH vers la lignée érythroïde. / Hematopoietic stem cells (HSCs) possess two fundamental characteristics; self-renewal capacity and the ability to give rise to all blood cell lineages. Before their commitment to a specific lineage, these cells are maintained in a quiescent state in the bone marrow. Asymmetric division is essential for the maintenance of the stem cell compartment while symmetric division results in HSC differentiation. The hypoxic environment of the bone marrow is conducive to anaerobic glycolysis and fatty acid oxidation, preserving stem cell quiescence and asymmetric division, respectively. However, it is not known whether the commitment of an HSC to a lymphoid, myeloid or erythroid lineage fate, is regulated by a metabolic switch. Indeed, while much research has shown a critical role for cytokines and cell-cell contacts in the commitment of HSCs to distinct hematopoietic lineages, the possibility that nutrient entry and metabolism may contribute to this process was not considered until very recently. Cell differentiation is associated with proliferation resulting in increased metabolic requirements that can be met by energy sources such as glucose, fatty acids, lactate, or glutamine, amongst others. While glucose and glutamine are both precursors for the production of ATP, lipids and nucleotides, their relative contributions to metabolic pathways driving HSC lineage commitment have not been evaluated. Interestingly, we and others previously found that the Glut1 glucose transporter is highly upregulated only during the final mitoses of HSC-driven erythroid differentiation, suggesting that other nutrients may regulate early stages of erythroid lineage commitment. During my PhD, I was interested in determining whether nutrient availability and utilization regulate HSC differentiation to the erythroid lineage. Interestingly, I found that the ASCT2 glutamine transporter is expressed at high levels on HSCs. Downregulation of ASCT2 or blocking glutamine metabolism abrogated erythroid differentiation of HSCs and diverted erythropoietin-signaled HSCs towards a myeloid fate. Under conditions where glutamine utilization was blocked, erythroid differentiation was not restored by directly replenishing the tricarboxylic acid cycle but rather, was dependent on de novo nucleotide biosynthesis. Surprisingly, 2-deoxyglucose, a glucose analogue that inhibits glycolysis, enhanced erythropoiesis. Glutamine and glucose catabolism also differentially modulated erythropoiesis in vivo, under stress conditions. To better elucidate the mechanism(s) via which glutamine supports the erythroid lineage specification of HSCs, we evaluated the metabolic pathways fueled by glutamine. Carbon/nitrogen-labeled glutamine tracing experiments showed that the rate-limiting step in EPO-induced erythroid differentiation is glutamine-dependent de novo nucleotide biosynthesis while glutamine entry into the TCA cycle (anaplerosis) is not required. Furthermore, the accelerated erythroid differentiation in the presence of 2-DG was associated with a striking increase in pentose phosphates, precursors of nucleotides. Notably, the shunting of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP), rather than glycolysis, was essential for erythropoiesis. In conclusion, my research shows that the coordinated redirection of glucose and glutamine into the production of nucleotides is the sine qua non condition for the erythroid differentiation of HSCs.