O objetivo do presente estudo foi determinar a cinética e a integridade e funcionalidade da membrana plasmática após a seleção espermática com um filtro de membrana sintética em câmaras de PVC com dois diâmetros diferentes e dois tempos de filtração. Foram utilizados 12 ejaculados de três garanhões. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi diluído com leite desnatado (T0) e analisado. Duas câmaras diferentes em PVC foram produzidas com dois joelhos conectados com um tubo dividido ao meio por um filtro de membrana sintética com poros de 5 μm. Uma câmara de 26 mm e a outra de 36 mm de diâmetro interno. Foi colocado leite desnatado a 37° C em um lado da câmara (A). No outro lado da câmara (B) depositou-se uma amostra do sêmen diluído, com um número conhecido de espermatozoides. Após 7 e 15 min, obteve-se uma amostra do lado "A" de cada câmara e calculou-se a concentração espermática e analisou-se o sêmen. A motilidade total, a motilidade progressiva e a integridade da membrana plasmática melhoraram (P <0,05) após a filtração em ambos os dispositivos e tempos de filtração. A concentração espermática foi menor (P <0,05) em ambas as câmaras nos dois tempos em relação ao T0. O dispositivo de filtração demonstra ser uma alternativa prática e fácil para a seleção espermática. A seleção usando as câmaras permite um aumento da cinética e da integridade da membrana e funcionalidade independente do tempo e do diâmetro do dispositivo. / The aim of the present study was to determine the kinetics and plasma membrane integrity and functionality after sperm selection with a synthetic membrane filter in PVC chambers with two different diameters and two filtrations times. A total of 12 ejaculates from three stallions was used. Immediately after collection semen was diluted with skim milk (T0) and analyzed. Two different chambers in PVC were made with two elbows connected with a pipe divided in half by a 5 μm pore synthetic membrane filter. One chamber had an inner diameter of 26 mm and the other 36 mm. Skim milk at 37° C was placed in a side of the chamber (A). In the other side of the chamber (B) a sample of the extended semen, with known number of spermatozoa was deposited. After 7 and 15 min a sample was obtained from the ‘A’ side of each chamber and sperm concentration was calculated and semen analyzed. Total motility, progressive motility and plasma membrane integrity were improved (P<0.05) after filtration in both devices and filtration times. Concentration was lower (P<0.05) in both chambers at all times in relation to T0 semen. The filtration device demonstrates to be a practical and easy alternative for sperm selection. Selection using the chambers allows an increase in kinetics and membrane integrity and functionality independent of time and device diameter.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-02-03T21:20:39Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_PrevalenciaPatologiasTrato.pdf: 2329009 bytes, checksum: ad085bdfcf7745945990be1aa186dcf9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-04T17:23:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_PrevalenciaPatologiasTrato.pdf: 2329009 bytes, checksum: ad085bdfcf7745945990be1aa186dcf9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-04T17:23:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_PrevalenciaPatologiasTrato.pdf: 2329009 bytes, checksum: ad085bdfcf7745945990be1aa186dcf9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Distúrbios reprodutivos estão associados a problemas adquiridos (estresse, manejo inadequado e de origem infecciosa), e genéticos (alta consangüinidade existente em alguns rebanhos do Brasil). Embora mostre o grau do potencial de fertilidade do macho, o exame andrológico e, em particular, o teste de funcionalidade, tem sido pouco utilizado, principalmente na seleção dos touros, embora, estes mesmos estudos, mencionem a importância do sêmen para avaliar a eficiência reprodutiva do macho. O objetivo do estudo foi determinar a prevalência de patologias clinicamente notáveis, através de palpação e inspeção e caracterizar o perfil espermático de búfalos criados em sistemas de produção, intensivo e extensivo. O estudo foi realizado em propriedades do Estado do Pará, nos Municípios de Belém, Ipixuna, Mojú, Nova Timbotéua, Paragominas, Santarém Novo e São Caetano de Odivelas, Muaná, Soure, Chaves e Ponta de Pedras. No estado do Amapá, nos Municípios de Cutias, Itaubal, Tartarugalzinho e no Arquipélago do Bailique. Os animais eram criados no sistema intensivo e extensivo, respectivamente. O período do estudo foi de março de 2008 a março de 2009. Foram utilizados 305 touros da raça Murrah, Mediterrânea e mestiços, com idade variando entre 2 a 15 anos, sendo que 160 no Estado do Pará, e 145 no Estado do Amapá. Os dados dos exames clínicos - andrológicos, assim como o espermiograma foram documentados em fichas especiais. A obtenção de sêmen foi realizada pela massagem das ampolas a avaliação física do sêmen contou da cor, aspecto, volume, motilidade, vigor, concentração e a avaliação morfológica e pH. A concentração foi aferida por espectrofotômetro da Central de Biotecnologia Animal (CEBRAN). Para a morfologia espermática foi utilizado o método de Cerovsky. Foram analisadas 200 espermatozóides em microscópio óptico em objetiva de imersão. Para análise estatística, foi empregado o programa estatístico BIOESTAT 5.0, estatísticas descritivas para todas as variáveis estudadas, biometrias testiculares, patologias do sistema reprodutor e características físicas e morfológicas do sêmen, registrando-se as médias, os desvios padrões e a distribuição de freqüências para as características de classes andrológicas. Os dados quantitativos referentes às idades dos touros, biometrias testiculares, avaliações físicas e morfológicas do sêmen foram submetidos à ANOVA, e quando houve efeito significativo pelo teste F, às médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro. Dos 305 búfalos, nos animais do Estado do Amapá a media e o desvio padrão da circunferência escrotal foi superior ao do Estado do Pará independente do tipo de manejo. Indiferente de idade e sistemas de criação não foi encontrado nenhuma alteração no pênis. A bolsa escrotal bífida (fenda escrotal) foi a alteração mais prevalente. A maior freqüência de alterações no epidídimo foi epididimite granulomatosa tipo tuberculóide, observada nos animais de criação extensiva no estado do Amapá, com uma tendência aos touros de mais de quatro anos. Entre as alterações do testículo a mais prevalente foi à torção testicular e de causas infecciosa destacamos a ocorrência de casos de orquite interticial crônico ativa, orquite granulomatosa tipo tuberculóide, hipoplasia testicular grau I, hipoplasia testicular grau III associada à orquite tuberculóide e hipoplasia grau II (parcial). Outra observação bem evidente é com relação às percentagens de espermatozóide com defeitos maiores e menores que se apresentam muito altas as recomendadas pelo CBRA. Deste estudo pode-se concluir que os reprodutores criados de forma extensiva apresentam patologias de origem genética e infecciosa muito prevalente. / Reproductive disorders are associated with problems acquired (stress, inadequate management and infectious origin), and genetic (high consanguinity exists in some herds in Brazil). While showing the degree of the male potential fertility, the breeding soundness examination and, in particular, the functionality test has been little used, particularly in bull selection, though; these same studies mention the semen importance to evaluate the male reproductive efficiency. The aim of this study was to determine the prevalence of diseases clinically notable, by palpation and inspection, and to characterize the profile of buffalo sperm created in systems production, intensive and extensive. The study was conducted on properties in the Pará State, in the Municipalities of Belém, Ipixuna, Mojú, Nova Timboteua, Paragominas, Santarém Novo and São Caetano de Odivelas, Muaná, Soure, Chaves and Ponta de Pedras. In Amapá State in the Municipalities of Cutias, Itaubal, Tartarugalzinho and Bailique Archipelago's. The animals were reared in an intensive and extensive, respectively. The period of study was from March 2008 to March 2009. 305 bulls were used Murrah, Mediterranean and mixed with ages ranging from 2 to 15 years, and 160 in the Pará State, and 145 in the Amapá State. Data from andrological clinical examinations, as well as semen analysis were recorded on special forms. Obtaining semen was performed by ampoules massage and the semen physical analysis was by the color, appearance, volume, motility, vigor, concentration, morphologic and pH. The concentration was measured by spectrophotometer on the Center of Animal Biotechnology (CEBRAN). For sperm morphology was used the Cerovsky method. 200 sperm were examined under a light microscope in immersion objective. For statistical analysis, we used the statistical program BioEstat 5.0, descriptive statistics for all variables studied: testicular biometry, disease of the reproductive system and the physical characteristics and morphology of semen, recording the means, standard deviations and frequency distribution for characteristics of andrology classes. Quantitative data concerning the age of bulls, testicular biometry, physical assessments and morphological characteristics of semen were submitted to ANOVA and when significant effects by F test, means were compared by Tukey test at 5% probability. Of the 305 buffalo, the beasts of the Amapá State and the average standard deviation of the scrotal circumference was higher than the Pará State independent of the type of management. Regardless of age and breeding systems found no change in the penis. The bifid scrotum (cleft scrotum), was the most prevalent. The highest frequency of change in epididymis. Tuberculous granulomatous epididymitis was observed in the extensive livestock in the Amapá State, with a tendency for bulls over four years. Among the changes in the testis was the most prevalent testicular torsion and infectious causes highlight the occurrence of chronic active interstitial orchitis, tuberculous granulomatous orchitis, testicular hypoplasia grade I, testicular hypoplasia grade III associated with tuberculous orchitis hypoplasia and grade II (partial). Another observation is quite clear regarding the percentage of spermatozoa with major and minor defects which have very high standards recommended by the CBRA. In this study we can conclude that breeders bred extensively present genetic diseases and infectious diseases are very prevalent.

O objetivo do presente estudo foi determinar a cinética e a integridade e funcionalidade da membrana plasmática após a seleção espermática com um filtro de membrana sintética em câmaras de PVC com dois diâmetros diferentes e dois tempos de filtração. Foram utilizados 12 ejaculados de três garanhões. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi diluído com leite desnatado (T0) e analisado. Duas câmaras diferentes em PVC foram produzidas com dois joelhos conectados com um tubo dividido ao meio por um filtro de membrana sintética com poros de 5 μm. Uma câmara de 26 mm e a outra de 36 mm de diâmetro interno. Foi colocado leite desnatado a 37° C em um lado da câmara (A). No outro lado da câmara (B) depositou-se uma amostra do sêmen diluído, com um número conhecido de espermatozoides. Após 7 e 15 min, obteve-se uma amostra do lado "A" de cada câmara e calculou-se a concentração espermática e analisou-se o sêmen. A motilidade total, a motilidade progressiva e a integridade da membrana plasmática melhoraram (P <0,05) após a filtração em ambos os dispositivos e tempos de filtração. A concentração espermática foi menor (P <0,05) em ambas as câmaras nos dois tempos em relação ao T0. O dispositivo de filtração demonstra ser uma alternativa prática e fácil para a seleção espermática. A seleção usando as câmaras permite um aumento da cinética e da integridade da membrana e funcionalidade independente do tempo e do diâmetro do dispositivo. / The aim of the present study was to determine the kinetics and plasma membrane integrity and functionality after sperm selection with a synthetic membrane filter in PVC chambers with two different diameters and two filtrations times. A total of 12 ejaculates from three stallions was used. Immediately after collection semen was diluted with skim milk (T0) and analyzed. Two different chambers in PVC were made with two elbows connected with a pipe divided in half by a 5 μm pore synthetic membrane filter. One chamber had an inner diameter of 26 mm and the other 36 mm. Skim milk at 37° C was placed in a side of the chamber (A). In the other side of the chamber (B) a sample of the extended semen, with known number of spermatozoa was deposited. After 7 and 15 min a sample was obtained from the ‘A’ side of each chamber and sperm concentration was calculated and semen analyzed. Total motility, progressive motility and plasma membrane integrity were improved (P<0.05) after filtration in both devices and filtration times. Concentration was lower (P<0.05) in both chambers at all times in relation to T0 semen. The filtration device demonstrates to be a practical and easy alternative for sperm selection. Selection using the chambers allows an increase in kinetics and membrane integrity and functionality independent of time and device diameter.

TEIXEIRA, Erivânia Gomes. Caracterização, resfriamento e criopreservação de sêmen de tilápia-do-nilo cultivada no estado do Ceará. 2013. 92 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 20113 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T12:26:41Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T12:26:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T12:26:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_egteixeira.pdf: 1255411 bytes, checksum: 260b5caf7b5bf38819e087108c82096e (MD5) Previous issue date: 2013 / The present study deals with anesthetic induction, characterization of sperm fluid, cooling and freezing of sperm of the Nile tilapia Oreochromis niloticus. In the first chapter the natural anesthetics menthol and eugenol were tested in adult specimens aiming to determine the ideal concentration for handling the Nile tilapia. In the second chapter the sperm fluid of the Nile tilapia was characterized according to the following parameters: collected volume, which showed the feasibility of collect in sufficient volume without the need of sacrificing the fish; sperm concentration, which showed significant variation between specimens; pH and osmolarity, which confirm the information of the literature; sperm motility time, which proved that the spermatozoa of tilapia are differentiated concerning accumulated energy when compared to other freshwater species; and sperm head morphometry, characterized by size (length, width, perimeter and area) and head shape (ellipticity, rugosity, elongation and regularity). In the third chapter we evaluated the feasibility of preservation of tilapia sperm using different extenders and cooled at 4°C. The sperm motility rate was evaluated with the aid of the Computer-assisted Sperm Analyzer (CASA) System. In this, the ACP-104, media based on powdered coconut water, showed best sperm motility rate for up to 72 hours after storage. In the fourth chapter was evaluated the effects of different cryoprotectants on the post-thaw Nile tilapia sperm, using the software Sperm Class Analyzer (SCA). The results of the sperm motility rate and sperm velocity parameters revealed that ACP-104 in combination with dimethylsulfoxide is a promising cryodiluent for Nile tilapia sperm in long-term conservation. / O estudo trata da indução anestésica, caracterização do líquido seminal, refrigeração e congelação do sêmen de tilápia-do-Nilo, Oreochromis niloticus. No primeiro capítulo foram testados os anestésicos naturais mentol e eugenol em espécimes adultos objetivando determinar a concentração ideal para manejo de tilápia-do-Nilo. No segundo capítulo, o líquido seminal da tilápia-do-Nilo foi caracterizado de acordo com os seguintes parâmetros: volume coletado, que revelou a viabilidade de coleta em volumes suficientes, sem a necessidade de sacrificar o peixe; concentração espermática, que mostrou relevante variação entre espécimes; pH e osmolaridade, que ratificam as informações presentes na literatura; tempo de motilidade, que comprovou ser o espermatozoide de tilápia diferenciado quanto à energia acumulada quando comparado a outras espécies de água doce; e morfometria da cabeça do espermatozoide por meio das seguintes medidas: comprimento, largura, perímetro e área. Também foram registrados quatro parâmetros derivados do formato da cabeça: elipticidade, rugosidade, elongação e regularidade. No terceiro capítulo foi avaliada a viabilidade do sêmen de tilápia-do-Nilo submetido a diferentes diluentes e refrigerado a 4°C. A avaliação foi realizada por meio da taxa de motilidade espermática determinada pelo sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analysis). Neste, o ACP-104, diluente à base de água de coco em pó, ofereceu melhor taxa de motilidade dos espermatozoides por até 72 horas de estocagem. Esta resposta mostrou que o ACP-104 é um diluente promissor para o sêmen da referida espécie. No quarto capítulo foi avaliado o efeito de diferentes criodiluentes sobre do sêmen de tilápia-do-Nilo pós-descongelação, utilizando o software (Sperm Class Analyser, SCA). Os resultados de motilidade espermática e de parâmetros de velocidade do espermatozoide revelaram que o ACP-104 combinado ao dimetilsulfóxido apresenta-se como um criodiluente promissor para a criopreservação do sêmen de tilápia-do-Nilo em longo prazo.

38 PIVs carried through in two laboratories of the Uberaba MGBRASIL had been used in this work with the objective to evaluate the relationship between condensation chromatin and head morphometry of spermatozoa and cleavages and blastocyst formation rates using semen of zebu bulls with normal routine tests of fertility. Smears of semen stained with of Toluidine Blue and computer image analysis had been used to evaluate the morphometry and chromatin condensation. Area (A), perimeter (P), width (L), length (C), width:length ratio (L/C), ellipticity (E), shape factor (FF), side symmetry (SL), anterior-posterior symmetry (SAP) and the three first Fourier values (F0, F1, F2) had been evaluated in the morphometric analysis. The chromatin was evaluated in relation to intensity of condensation and homogeneity. The results allowed concluding that the influence of light variations in the sperm head morphometry and the chromatin condensation on the cleavage and number of normal morfologic blastocyst in the PIV is small. / Foram utilizados os dados de 38 programações de produção in vitro de embriões (PIV), realizadas em dois laboratórios da cidade de Uberaba-MG-Brasil, com o objetivo de se avaliar a correlação entre compactação da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozóides com a taxa de clivagem e formação de blastocisto utilizando sêmen de touros zebuínos com testes de rotina normais para fertilidade. Foram utilizados esfregaços de sêmen corados com Azul de Toluidina e análise de imagem por computador para avaliar a morfometria e a compactação de cromatina. Na análise morfométrica foram avaliados: área (A), perímetro (P), largura (L), comprimento (C), razão largura:comprimento (L/C), elipsidade (E), fator forma (FF), simetria lateral (SL), simetria ântero-posterior (SAP) e descritores Fourier com amplitude de 0 a 2 (F0, F1, F2). A cromatina foi avaliada quanto à intensidade de compactação e homogeneidade. Os resultados permitiram concluir que é discreta a influência de pequenas variações observadas na morfometria da cabeça e na compactação da cromatina espermática sobre a clivagem e número de blastocistos morfologicamente normais na PIV. / Mestre em Ciências Veterinárias

O objetivo do presente estudo foi determinar a cinética e a integridade e funcionalidade da membrana plasmática após a seleção espermática com um filtro de membrana sintética em câmaras de PVC com dois diâmetros diferentes e dois tempos de filtração. Foram utilizados 12 ejaculados de três garanhões. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi diluído com leite desnatado (T0) e analisado. Duas câmaras diferentes em PVC foram produzidas com dois joelhos conectados com um tubo dividido ao meio por um filtro de membrana sintética com poros de 5 μm. Uma câmara de 26 mm e a outra de 36 mm de diâmetro interno. Foi colocado leite desnatado a 37° C em um lado da câmara (A). No outro lado da câmara (B) depositou-se uma amostra do sêmen diluído, com um número conhecido de espermatozoides. Após 7 e 15 min, obteve-se uma amostra do lado "A" de cada câmara e calculou-se a concentração espermática e analisou-se o sêmen. A motilidade total, a motilidade progressiva e a integridade da membrana plasmática melhoraram (P <0,05) após a filtração em ambos os dispositivos e tempos de filtração. A concentração espermática foi menor (P <0,05) em ambas as câmaras nos dois tempos em relação ao T0. O dispositivo de filtração demonstra ser uma alternativa prática e fácil para a seleção espermática. A seleção usando as câmaras permite um aumento da cinética e da integridade da membrana e funcionalidade independente do tempo e do diâmetro do dispositivo. / The aim of the present study was to determine the kinetics and plasma membrane integrity and functionality after sperm selection with a synthetic membrane filter in PVC chambers with two different diameters and two filtrations times. A total of 12 ejaculates from three stallions was used. Immediately after collection semen was diluted with skim milk (T0) and analyzed. Two different chambers in PVC were made with two elbows connected with a pipe divided in half by a 5 μm pore synthetic membrane filter. One chamber had an inner diameter of 26 mm and the other 36 mm. Skim milk at 37° C was placed in a side of the chamber (A). In the other side of the chamber (B) a sample of the extended semen, with known number of spermatozoa was deposited. After 7 and 15 min a sample was obtained from the ‘A’ side of each chamber and sperm concentration was calculated and semen analyzed. Total motility, progressive motility and plasma membrane integrity were improved (P<0.05) after filtration in both devices and filtration times. Concentration was lower (P<0.05) in both chambers at all times in relation to T0 semen. The filtration device demonstrates to be a practical and easy alternative for sperm selection. Selection using the chambers allows an increase in kinetics and membrane integrity and functionality independent of time and device diameter.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Catia Ciencia Animal 2011.pdf: 762064 bytes, checksum: bf88768cc40c5c8bee991ff416b2a29d (MD5) Previous issue date: 2011-08-03 / The function of antioxidants is control the free radicals to improve the quality of fresh and cryopreserved semen. The objective this work was to study the effect of antioxidants catalase, &#945;-tocopherol and sodium pyruvate added in bull semen in order to control the reactive oxygen species and improve sperm quality after cryopreservation. Were used six adult Nelore bulls previously selected from other animals by evaluation of body condition and andrological examination. Semen was collected and immediately evaluated for motility and vigor at the laboratory. After, the semen were diluted with Tris-egg yolk-glycerol medium with the antioxidants molecules in different concentrations. The work was divided into four experimental groups: Group 1 (control without addition of antioxidants), Group 2 (with catalase antioxidant in three concentrations 20 IU, 80 IU and 200 IU), Group 3 (with &#945;-tocopherol antioxidant in the concentrations of 50 mM, 100 mM and 150 mM) and Group 4 (with sodium pyruvate antioxidant in the concentrations of 1.5 mM, 3.5 mM and 5 mM). After semen thawing the computerized analysis (CASA) of motility, plasm membrane, and acrosome integrity, mitochondrial activity and measurement of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). It was observed that the antioxidants had no significant effect on most parameters measured, but the lower antioxidants concentrations were more efficient than the control group for the total motility, progressive motility, average path velocity, and plasm membrane integrity parameters. In the TBARS evaluation was observed lower lipid peroxidation when higher antioxidants concentrations were used. Thus more research is needed to determine the functionality of sperm, as well as indentify the optimal concentration of the antioxidants that benefits all sperm parameters after thawing. / Os antioxidantes têm como função neutralizar os efeitos dos radicais livres proporcionando uma melhor qualidade do sêmen fresco e criopreservado. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da adição dos antioxidantes catalase, &#945;-tocoferol e piruvato de sódio no sêmen bovino visando um controle das espécies reativas de oxigênio para melhorar a qualidade espermática pós-criopreservação. Foram utilizados seis touros adultos da raça Nelore selecionados previamente entre outros animais por meio da avaliação de condição corporal e exame andrológico. O sêmen foi coletado e imediatamente avaliado quanto a motilidade e vigor no laboratório. Em seguida, o sêmen foi diluído com o meio Tris-gema-glicerol com as moléculas antioxidantes nas diferentes concentrações. O trabalho foi estruturado em quatro grupos experimentais: Grupo1 (controle sem adição de antioxidantes); grupo 2 (com antioxidante catalase em três concentrações 20 UI, 80 UI e 200 UI); grupo 3 (com antioxidante &#945;-tocoferol nas concentrações de 50 &#956;M, 100 &#956;M e 150 &#956;M) e o grupo 4 (com antioxidante piruvato de sódio nas concentrações de 1.5 &#956;M, 3.5 &#956;M e 5 &#956;M). Após a descongelação foram realizadas as análises computadorizada (CASA) da motilidade, da integridade de membrana plasmática, de integridade acrossomal, da atividade mitocondrial e mensuração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Observou-se que os antioxidantes não tiveram efeito significativo na maioria dos parâmetros avaliados, porém nas menores concentrações tiveram melhor resultado comparando-se com o grupo controle para os parâmetros de motilidade total, motilidade progressiva, velocidade de trajeto e integridade de membrana. Em relação a avaliação de TBARS observou-se que as maiores concentrações dos antioxidantes têm menor peroxidação lipídica. Desta forma, tornam-se necessárias mais pesquisas em relação a avaliação funcional dos espermatozóides, bem como a identificação da concentração ideal que beneficie todos os parâmetros espermáticos pós-descongelação.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_marta_amaral.pdf: 872749 bytes, checksum: 441aef851eaec2633ad2f7530bf3c07c (MD5) Previous issue date: 2009-12-28 / Transgenic animals have been used as biological models in studies of the genes functions and their mechanisms of action, as well as to improve animal production. Researchers are trying to produce transgenic animals that will be organs donors in xenotransplants. Another use of the transgenic animal is in the production of recombinant proteins for pharmaceutical interest, starting from several tissues and corporal fluids of different animal species. Using TMGT (Testis Mediated Gene Transfer), the efficiency of pEGFP transgene transmission in mice using non surgical TMGT was evaluated, without epididymis electroporation; using transfectants as DMSO, liposomes, and for the first time the DMA. To evaluate the efficiency of non surgical TMGT in F0 the EGFP expression was evaluated in vivo and detection in genome was conducted by PCR analysis. Moreover, we evaluated which transfectants were more efficient in transgene transmission and if it induce histological damage in testis, by histological analysis. EGFP expression was not detected in F0 through the ultraviolet light.The result of the PCR analysis shows that liposomes and DMSO were the best transfectants for pEGFP in F0. The histological analysis shows that injections of DMSO with exogenous DNA could affect the development of the germ cell of seminal tubules. The purpose about SMGT was to evaluate the interaction of the spermatozoa of silver catfish with pEGFP vector. It was observed that the semen after three washes in isosmotic solution and at 1000 x g centrifugation could eliminate seminal plasma proteins and preserve cellular motility. The time of action of DNase in the seminal plasma was 30 minutes, the temperature of action of DNase ranged between 33-53°C and its inhibition was detected at 70°C. In the presence of EDTA 30mM the activity of DNase was inhibited. Through PCR it was detected that in the DNA of the silver catfish s spermatozoids, the amplicon of EGFP at different concentrations of pEGFP vector (5-100 ng/106 spermatozoa). We demonstrate that spermatozoa of the silver catfish need to be washed to remove seminal plasma before contact with exogenous DNA, after several washes exogenous DNA was internalized in spermatozoa. / Os animais transgênicos vêm sendo empregados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, bem como para melhorar a produção animal. Pesquisadores vêm tentando produzir animais transgênicos que serão doadores de órgãos em xenotransplantes. Outra utilização da transgênese animal é a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico a partir de diversos tecidos e fluidos corporais de diferentes espécies de animais. Em relação à TMGT (Testis Mediated Gene Transfer) foi avaliada a eficiência da transmissão do transgene EGFP em camundongos, utilizando a TMGT não cirúrgica, sem o uso de eletroporação no epidídimo; utilizando transfectantes como o DMSO, lipossomos, e pela primeira vez o DMA. A detecção da expressão do EGFP foi avaliada in vivo na F0 e por PCR, para comprovar a eficiência da TMGT não cirúrgica. Também foi analisado qual dos transfectantes propiciou a maior taxa de transmissão e se eles causaram danos histológicos aos testículos, através de análise histológica. Não foi detectada a expressão de EGFP, através da luz ultravioeta na F0. Os resultados da análise de PCR demonstraram que o lipossomo e o DMSO foram os melhores transfectantes do pEGFP na F0. A análise histológica demonstrou que a injeção de DMSO com o DNA exógeno, pode comprometer o desenvolvimento das células germinativas do túbulo seminal. O objetivo em relação à SMGT (Sperm-mediated gene transfer) foi avaliar a interação dos espermatozóides de silver catfish (Rhandia quelen) com o vetor pEGFP. Foi observado que o sêmen após três lavagens em solução isosmótica e centrifugadas à 1000 x g, eliminaram as proteínas do plasma seminal e preservaram a motilidade celular. O tempo de atividade da DNase no plasma seminal foi de 30 minutos, a temperatura de atividade da DNase variou entre 33-53°C e sua inativação ocorreu aos 70°C. Na presença de EDTA 30mM a atividade da DNase foi inibida. Através da PCR foi detectada a presença do pEGFP no DNA dos espermatozoides do silver catfish, que incorporaram o vetor em diferentes concentrações (5-100 ng/106 espermatozoides). Concluímos que os espermatozoides do silver catfish precisam ser lavados para retirada do da DNase do plasma seminal antes de entrar em contato com o DNA exógeno, e que após as lavagens ocorreu a internalização do DNA exógeno no espermatozoide.