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Aplicación del proceso de análisis Jerárquico (AHP) en la priorización de peligros en productos importados al Ecuador como vehiculizadores de encefalopatía espongiforme bovinaPazmiño Galarza, Fernando Andrés January 2014 (has links)
Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / La importación de animales, productos y subproductos de origen animal siempre involucran riesgo de ingreso de enfermedades para el país importador. Cuando el peligro es identificado, su impacto negativo y su probabilidad de ocurrencia puede ser evaluada
Por ende se planteó un Proceso de Análisis Jerárquico, donde se priorizó los peligros de ingreso de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) al Ecuador mediante la importación de mercancías pecuarias. Para lo cual se utilizó la información proporcionada por la Agencia de Aseguramiento de la Calidad del Agro – AGROCALIDAD, a través de la base de datos de mercaderías pecuarias importadas al Ecuador en el período comprendido entre 2007 y 2013.
La metodología se edificó en tres etapas: Estructuración del problema, evaluación y análisis de sensibilidad. Para esto un panel de expertos analizó, en una primera fase, la información emitida e identificaron criterios, subcriterios y alternativas que se consideran relevantes, su grado de peligrosidad y se sintetizó en un árbol jerárquico.
En la segunda fase se evaluaron criterios a través del Programa informático Expert choice ® donde se obtuvo los siguientes resultados: Producto con un 67,19%,y País de origen con un 32,81 %. Producto subcriterio Tipo de mercadería pecuaria se consideró como de mayor importancia para el ingreso del prion de EEB con un 60,22 %, le sigue subcriterio Volumen de importación con 6,97%; en el caso del criterio País de origen el subcriterio Prevalencia de la enfermedad en el país exportador fue el de mayor ponderación con un 16,53%, le sigue Confiabilidad del país exportador con 8,95% y por último Infraestructura del Servicio Oficial del país exportador con 7,34%. En lo que respecta a las alternativas la mercadería pecuaria considerada más riesgosa fue Ovinos y caprinos reproductores - México con un 18,51% seguido de Vísceras ovinas (tripas de borrego) – Australia con un 11,84% y Vísceras bovinas congeladas (entrañas) - EE.UU. con un 7,15%.
En la tercera fase se realizó el Análisis de sensibilidad al producir simulaciones en las ponderaciones de los criterios de la siguiente manera: PRODUCTO 25% - PAÍS DE ORIGEN 75%, PRODUCTO 50% - PAÍS DE ORIGEN 50%, PRODUCTO 90% - PAÍS DE ORIGEN 10%, se concluyó que la jerarquía era robusta ya que las alternativas son bastante insensibles a los cambios simulados.
Los resultados de este estudio demuestran que la importación de las diferentes mercaderías pecuarias al Ecuador, presentan un riesgo de ingreso de Encefalopatía Espongiforme Bovina / The importation of live animals and animal origin merchandise are always threats for the sanitary status of the importing country. When danger is identified, its negative impact and probability of occurrence can be evaluated. . Thus, a Process of Hierarchical Analysis, where the risk of introduction of Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) into Ecuador by importing livestock goods was performed. For this matter, the information used is the one provided by the Official Animal and Plant Inspection Service of Ecuador – AGROCALIDAD, from the database of livestock goods imported by Ecuador in the period between 2007 and 2013.
The methodology was built in three stages: structuring the problem, evaluation and sensitivity analysis. For this, in a first phase a panel of experts analyzed the information and identified criteria, sub-criteria and alternatives considered as relevant, the risk level and summarized in a hierarchical tree.
. . In the second phase, the criteria was evaluated by the decision making software Expert Choice®, and the following results were obtained: Product with 67.19% and Country of Origin with 32.81%. Product type sub-criteria Livestock merchandise was considered as most important to the BSE prion income with 60.22%, followed by the sub-criteria Import volume with 6.97%; in the case of criteria Country of origin sub-criteria Prevalence of the disease in exporting country was the most heavily weighted with 16.53%, followed by Reliability of exporting country with 8.95% and finally Official service infrastructure of the exporting country with 7.34%. Referring to alternatives, the livestock merchandise considered riskier were breeding sheep and goats from Mexico with 18.51%, followed by sheep viscera (sheep guts) from Australia with 11.84% and frozen bovine viscera (guts) from U.S. with 7.15%. . .
In the third phase, the sensitivity analysis was performed by simulation on the criteria weighing as follows: Product 25% - Country of origin 75 % - 50 % Product 50% - Country of origin 50% , Product 90% - Country of origin 10%; it was concluded that the hierarchy was robust because the alternatives are quite insensitive to the simulated changes.
The results of this study demonstrate that the import of different livestock goods to Ecuador, represent a risk of entry of BSE
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Estudi de la patogènia de l'Encefalopatia Espongiforme Bovina i de la Tremolor Ovina en casos de campVidal Barba, Enric 27 June 2006 (has links)
En el marc del programa de vigilància i control de les EET a Catalunya es van obtenir encèfals de casos de EEB. En primer lloc aquestes mostres van ser caracteritzades. Amb l'estudi de la distribució encefàlica de la proteïna prió resistent (PrPres) mitjançant western blotting (WB) i un assaig d'immunoabsorció amb quimioluminiscència en microplaca (LIA) es va obtenir la corba de distribució encefàlica de la PrPres (BPDC) juntament amb els perfils lesional i immunohistoquímic dels encèfals. Aquesta ens va proporcionar informació sobre l'estadi de la malaltia en cada cas. Els casos els varem classificar com a casos precoços donada l'absència de detecció de signes clínics i el poc abast de les lesions observades. L'estudi en profunditat dels dipòsits de PrPres va aportar-nos informació interessant sobre la implicació de la població glial en la propagació de la PrPres.Continuant amb la caracterització dels casos es va elaborar el perfil molecular de la PrPres de cada cas que s'havia diagnosticat a Catalunya. Això es va fer mitjançant la determinació densitomètrica de la proporció de les tres glicoformes, del pes molecular de la proteïna, un cop deglicosilada, i, finalment valorant la afinitat diferencial a dos anticossos monoclonals, el P4 i el 6H4. Tots els casos avaluats corresponien a casos d'EET clàssics la qual cosa en va permetre descartar la presència de casos d'EET atípics en el pool de casos detectats, fins al moment, a Catalunya. Altres mecanismes de la patogènia que es van estudiar en alguns del casos d'EEB mitjançant tècniques d'immunohistoquimica (IHQ) i histoquímica d'afinitat (HQ) van ser: la resposta glial (IHQ per detectar la proteïna acídica fibril·lar glial dels astròcits i HQ amb la lectina de Griffonia simplicifolia per detectar micròglia), alteracions de les proteïnes sinàptiques (IHQ per detectar sinaptofisina i SNAP 25), alteració de la matriu extracel·lular (HQ amb aglutinina de Wysteria floribunda), presència de fenòmens d'estrès oxidatiu (IHQ per detectar Metal·lotioneines I+II i Nitrotirosina) i mort cel·lular programada (IHQ per detectar Caspasa 3 activada). L'estudi d'aquests casos era d'especial interès ja que es tractava de casos en fases inicials de la neurodegeneració.Es va estudiar finalment un grup d'ovelles afectades de tremolor ovina, en estadis terminals de la malaltia. També es tractava de casos de camp dels que varem realitzar un perfil lesional i immunohistoquímic (de distribució de la PrPres). Un cop caracteritzats varem estudiar les poblacions GABAèrgiques mitjançant IHQ per detectar les proteïnes lligadores de calci, Parvalbúmina i Calbindina, marcadors d'aquesta subpoblació neuronal. Es va observar una important reducció del marcatge de parvalbúmina, afectant sobretot a les prolongacions neuronals. Tot i Aixa no varem detectar cap alteracó de la matriu extracel·lular (HQ amb aglutinina de Wysteria floribunda). Aquesta alteració era concomitant amb un nivell lleu d'espongiosi i un dipòsit evident de PrPres. Aquesta troballa permetia explicar, de forma parcial, alguns dels signes associats a la malaltia com ara els tremolors o la hiperexcitabilitat. / The brains of BSE field cases in cattle were collected after diagnosis within the active surveillance programme in Catalonia. First of all a characterisation of the samples was carried out. By studying the brain distribution of the resistant prion protein (PrPres) deposition with western blotting and a luminescence immunosorvent assay a brain PrPres distribution curve (BPDC) was obtained along with lesion and immunohistochemical brain profiles. These yielded information regarding the stage of the disease of the cases which were classified as early cases due to the lack of reported clinical signs and the small extent of the lesion. The in-depth study of PrPres deposition patterns disclosed interesting information on the involvement of glial population in the spread of PrPres.To further characterise the cases a molecular profile of the deposited PrPres in all TSE cases diagnosed in Catalonia was also obtained. A densitometric determination of the glycosilation pattern and of the molecular weight of the deglycosilated PrPres and the differential affinity to 6H4 and P4 monoclonal antibodies were the tools employed. All cases studied fitted into the classical TSE descriptions, thus allowing us to discard the presence of atypical TSE strains among the pool of cases detected through the active surveillance programme. Other pathogenetic mechanisms were then investigated in some of the BSE brains by means of immunohistochemical and histochemical approaches. Glial cell reaction (immunohistochemistry to detect astrocytes against glial fibrillary acidic protein and vimentin and histochemistry for microglia with Griffonia simplicifolia lectin), synaptic protein alterations (IHC against synaptophisin and SNAP25 synaptic proteins), perineuronal nets disruption (HC with Wysteria floribunda agglutinin), presence of oxidative stress phenomena (IHC against Methallotioneins I+II and Nitrotyrosine) and cell death (IHC against cleaved Caspase 3) were the parameters evaluated. Of special interest was the study of these cases since they were in early stages of the neurodegeneration.A group of scrapie, clinically terminal, field cases was also studied. After profiling the lesions and PrPsc distribution, a study of the GABAergic populations was carried out by evaluating the immunolabelling of the calcium binding proteins: parvalbumin and calbindin D28k. An important reduction of the parvalbumin signalling was observed, mainly affecting neuronal prolongations. Despite of that no alteration of the perineuronal nets (studies with HC with Wysteria floribunda agglutinin) was detected. This alteration was concomitant to a mild level of spongyform lesion and an evident deposit of PrPres and could partially be an explanation for the clinical signs observed in the animals such as tremors or hyperexcitability.
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Determinación de encefalopatía espongiforme ovina (Scrapie) mediante histopatología de encéfalos provenientes de mataderos de la XI Región de ChileAyala Villegas, Fabiola de Lourdes January 2001 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El scrapie ovino pertenece al grupo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), las que corresponden a enfermedades degenerativas y progresivas del sistema nervioso central (SNC), que se caracterizan por presentar un largo período de incubación y que culminan con la muerte del animal afectado.
Datos históricos indican que el scrapie es la enfermedad más antigua del grupo de las EET, siendo descrita hace más de 250 años en Europa.
El agente etiológico de la enfermedad corresponde a un prion (proteinaceus infectious particle), que es la isoforma anormal de una proteína celular, que aunque carece de ADN tiene la capacidad de replicarse sin la presencia de genes. Se caracteriza por una gran resistencia a la acción de agentes químicos y físicos y por lo mismo es muy difícil de erradicar de los lugares infectados.
Se sabe que el scrapie es una enfermedad del ganado ovino, que se reconoce por su signología clínica, sin embargo para un diagnóstico específico se requiere del examen histopatológico del encéfalo de los animales sospechosos, los que en el caso de ser positivos a la enfermedad, se caracterizan por presentar cambios espongiformes bilaterales y simétricos, tanto en el pericarion como en el neuropilo. La detección de formas anormales de una proteína de membrana del tejido nervioso del huésped llamada “proteína prion”, es útil como criterio adicional para confirmar el diagnóstico de la enfermedad, sin embargo en nuestro país el principal método de confirmación de la enfermedad es hasta ahora el estudio histopatológico del encéfalo.
La importancia a nivel mundial de esta enfermedad, es la de haber participado en la diseminación masiva de la enfermedad a otras especies animales, como lo es el ganado bovino Europeo en la denominada Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB). Este proceso se cree que se produce por medio del consumo de harinas de carne y hueso de origen ovino. Además existe la potencialidad de constituir una zoonosis, por el consumo de carne o subproductos de ovinos que cursan con la enfermedad. Este hecho concuerda con la aparición de una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt - Jakob (nv CJD) en los humanos.
El presente trabajo constituye una parte de un estudio poblacional a nivel nacional que realiza el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), para detectar la eventual presencia del scrapie en Chile y de este modo, ayudar a conocer la situación epidemiológica de esta enfermedad en nuestro país.
Esta investigación se realizó en base al estudio histológico de 135 cerebros de ovinos mayores de 5 años, provenientes de mataderos de la XI región de Chile, en los que se utilizaron métodos, procedimientos y criterios histoanatomopatológicos reconocidos internacionalmente.
De esta forma el análisis de los resultados del presente estudio nos permite indicar que las principales alteraciones encontradas se agruparon en : lesiones vacuolares tanto en el pericarion neuronal como en el neuropilo (de presentación unilateral y en ningún caso bilaterales) y alteraciones que involucran cambios de tipo inflamatorio (manguitos perivasculares), depósitos pigmentarios, hallazgos parasitarios y lesiones traumático hemorrágicas.
Sin embargo, se puede concluir que los cambios observados en las muestras de los encéfalos examinados al microscopio, de acuerdo a sus características histopatológicas, no corresponden a lesiones atribuibles a scrapie ovino, sino que simplemente constituyen hallazgos histopatológicos, por ser lesiones aisladas y no presentar un patrón específico de ubicación en el SNC.
La importancia de este estudio radica en contribuir al conocimiento de la situación epidemiológica del scrapie ovino en nuestro país, así como también el de servir de base para futuras investigaciones relacionadas con el tema. / Proyecto financiado por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG)
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Detección de proteínas priónicas en cerebros de bovino mediante inmunoensayo enzimáticoPadilla de Beer, Danielle A. January 2004 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) pertenece a un grupo de enfermedades neurodegenerativas denominadas Espongiformes Transmisibles (EET), dentro de las cuales se destacan además la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (CJD) con su nueva variante (NV-CJD) en los humanos y el Scrapie en animales. Estas patologías se caracterizan por ser mortales, tener un largo período de incubación y presentar signos neurológicos progresivos. En el análisis histopatológico del sistema nervioso central (SNC) de los afectados predomina una vacuolización de la sustancia gris.
El agente etiológico de estas patologías se denomina "prión" (partícula infecciosa de naturaleza proteica) y consiste en una isoforma infectiva (PrPsc) de una proteína celular normal (PrPc) que, además de poseer una gran resistencia a la proteinasa K, adquiere la capacidad de transformar la isoforma normal en patológica.
La BSE ha adquirido gran importancia en el último tiempo debido a sus graves consecuencias económicas y por su posible transmisión al hombre, dando origen a la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld Jakob (nv-CJD) a través del consumo de productos cárneos infectados.
A pesar de que nuestro país es considerado libre de BSE y con bajo riesgo de introducción de esta enfermedad, es muy importante contar con métodos de diagnóstico específicos, rápidos, reconocidos y utilizados internacionalmente.
En este estudio se logró purificar la proteína priónica celular (PrPc), a partir de cerebros de bovino y se caractrizó mediante electroinmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal específico 6H4. Además se caracterizó una proteína priónica recombinante (PrPrec).
Por otra parte, se realizó una inmunodetección de proteínas priónicas mediante la utilización de un "kit" de inmunoensay enzimático (ELISA), aprobado por la Comisión Europea en 1999 como método de diagnóstico para BSE. Mediante este ensayo se analizaron 45 muestras de óbex de bovinos, mayores de 30 meses de edad, provenientes de mataderos de la Región Metropolitana. En un estudio inicial se obtuvieron 2 muestras sospechosas, lo cual se pudo deber a errores de operación. Posteriormente estas muestras fueron analizadas nuevamente, resultando finalmente el 100% de las muestras en estudio negativas.
A través de este estudio se logró implementar en forma pionera en nuestro país este método diagnóstico para BSE, utilizado y reconocido ampliamente a nivel internacional, aportando así un nuevo método a las medidas epidemiológicas nacionales destinadas a mantener a nuestro país libre de BSE / FINANCIAMIENTO: CENTRO DE BIOLOGIA Y BIOTECNOLOGIA (CBB) DEL INSTITUTO
MILENIO DE ESTUDIOS AVANZADOS DE LA UNIVERSIDAD DE CHILE
SERVICIO AGRICOLA Y GANADERO (SAG
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Detección y caracterización de proteínas priónicas en óbex de bovino mediante inmunotransferenciaNúñez Rodríguez, Paula January 2004 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico / Existe un grupo de patologías neurodegenerativas letales que afectan a los humanos y a los animales denominadas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). En los humanos, destaca la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (CJD), y la aparición en los últimos años de una nueva variante (nvCJD) que es causada por el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Dentro de las EET animales, destaca el scrapie de ovinos y caprinos, y la BSE, que además de afectar al ganado bovino, es transmisible a los humanos.
La teoría más aceptada sobre el agente etiológico de estas enfermedades es la teoría del prión, que corresponde a una proteína priónica patológica (PrPsc) resistente a proteasas, que se origina por un cambio conformacional de una proteína priónica celular del huésped (PrPc).
La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) ha causado impacto mundial por el daño que ha provocado en la salud animal y en la economía, y por su relevancia en la salud pública al ser una enfermedad zoonótica. Durante años, el método de diagnóstico de rutina para la BSE fue el examen histopatológico del SNC de los bovinos sospechosos. Sin embargo, la epidemia desencadenada en Europa, principalmente en el Reino Unido, aumentó la necesidad de implementar métodos diagnósticos más rápidos y certeros. Esto originó el desarrollo de pruebas rápidas de diagnóstico, basadas en técnicas de inmunodetección del agente patológico (PrPsc) como es la inmunotransferencia o western blot.
El presente trabajo se orientó por una parte, a la purificación, caracterización y detección inmunológica de proteínas priónicas en óbex de bovinos, mediante la utilización de la inmunotransferencia. Para obtener la PrPc, se utilizó un método de purificación de proteínas priónicas, y en el caso de la PrPsc se utilizó una proteína priónica recombinante (PrPrec); además, se evaluó la respuesta de ambas proteínas frente a la actividad enzimática de la proteinasa K. Para la posterior caracterización y detección inmunológica de estas proteínas, se realizó una electroinmunotransferencia. Por otra parte, para evaluar un método rápido de diagnóstico que detecte el agente de la BSE, se utilizaron 84 muestras de óbex de bovinos provenientes de mataderos de la Región Metropolitana, las que se analizaron individualmente por Western Blot mediante un kit comercial (Prionics Check-Western), aceptado y utilizado internacionalmente para el monitoreo y diagnóstico de esta enfermedad.
Los resultados del presente estudio muestran la caracterización y detección inmunológica de la PrPc y la PrPrec mediante la inmunotransferencia. Además, se demuestra la sensibilidad a la digestión de ambas proteínas con la proteinasa K, lo que las diferencia de la PrPsc, que es una proteína proteasa resistente. En cuanto a los resultados obtenidos con el kit (Prionics Check-Western), de las 84 muestras analizadas 60 arrojaron un resultado negativo a BSE, ya que no se detectó inmunológicamente la PrPsc. El resto de las muestras (24) fueron analizadas nuevamente por dar resultados inconclusos, al aparecer bandas en el rango de peso molecular de la PrPsc. Sin embargo, finalmente el total de las muestras (84) arrojaron resultados negativos a BSE, lo que indica que las muestras inconclusas eran falsas positivas originadas por una deficiente digestión enzimática de la PrPc.
La importancia de esta memoria de título radica en el hecho de ser pionera en la caracterización e inmunodetección de las proteínas priónicas de bovinos utilizando la inmunotransferencia, y en lograr la utilización e implementación en nuestro país de un método de diagnóstico rápido para BSE basado en un kit comercial, que es utilizado y aceptado internacionalmente para la detección del agente etiológico de esta patología
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Detección del gen PrP de Scrapie en ovinos de raza JunínRivera Jayrulina, Kamilo Luisovich January 2013 (has links)
Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Manifiesta que en los ovinos se ha establecido la influencia del gen Prion (PRNP) en la capacidad de resistir o padecer la enfermedad de scrapie. Desde hace varios años los Estados Unidos y la Unión Europea, entre otros países del mundo, promueven programas de erradicación de la enfermedad siendo un requisito realizar el genotipado de los animales para su posterior selección. En el Perú se tiene 9’523,200 (INEI) de ovinos entre carneros y corderos, y menos del 4.1% incluye a la raza Junín (INEI). Hasta la fecha se desconocía los diferentes genotipos del gen Prion en el ovino Junín, el estudio permitió validar la técnica y determinar los genotipos del gen Prión en una muestra de 56 ovinos de raza Junín provenientes de una Unidad de Producción Privada ubicada en la región central del departamento de Junín. Se obtuvieron 4 de los 5 genotipos reportados: el ARR (48,21%), ARQ (35,71%), AHQ (10,71%) y VRQ (5,36%). En relación a los genotipos, se encontraron 7 de los 15 reportados para el gen Prion: ARR/ARR (17.86%); ARR/AHQ (10.71%); ARR/ARQ (42.86%); ARQ/AHQ (10.71%); ARQ/ARQ (7.14%); ARR/VRQ (7.14%) y ARQ/VRQ (3.57%). De acuerdo al resultado obtenido se tiene un porcentaje de 82.14 % de animales con genotipos resistente y un 17.85 % de genotipos susceptibles. Aunque estos valores solo corresponde a un grupo de muestras (N=56), puede servir de punto de partida para futuras investigaciones. El conocer el genotipo de los animales permitiría establecer un programa de prevención seleccionando animales resistentes a la enfermedad. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú) / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Medicina Veterinaria / Tesis
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Os Cervídeos Brasileiros e a Doença da Debilidade Crônica: Verificação de Polimorfismos Genéticos Associados à SusceptibilidadeFALCÃO, Caio Bruno Ribeirão 31 January 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012 / FACEPE , CNPQ. / As doenças priônicas são um grupo de doenças neurodegenerativas e irremediavelmente fatais que afetam humanos e algumas outras espécies de mamíferos. Entre estas, as mais conhecidas são a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) que acomete humanos, o scrapie em ovinos e a encefalopatia espongiforme bovina (BSE). A Chronic Wasting Disease (CWD) é a forma priônica que acomete os cervídeos e tem sido considerada como problema de saúde pública nos EUA e Canadá. Pesquisas recentes têm mostrado que alguns animais apresentam maior resistência à infecção da doença. Esta resistência tem sido comumente associada com alterações na sequência de nucleotídeos do gene que codifica a proteína priônica (PRNP). Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em códons específicos alteram a susceptibilidade ao desenvolvimento da CWD na família Cervidae. Objetivando identificar a presença/ausência dos polimorfismos, e consequentemente a potencial susceptibilidade ao desenvolvimento da doença em cervídeos neotropicais, no presente trabalho foram analisadas 60 amostras de três espécies: Veado catingueiro (Mazama gouazoubira, n:11), Veado campeiro (Ozotoceros bezoarticus, n:18) e Cervo do Pantanal (Blastocerus dichotomus, n:31). Um fragmento de aproximadamente 800pb do exon 3 do gene PRNP foi amplificado por PCR e posteriormente sequenciado. As sequências foram alinhadas e os resultados mostraram que a sequência nucleotídica dos animais neotropicais é altamente conservada. Todos os animais apresentaram os polimorfismos associados à susceptibilidade nos códons de interesse (Q95, G96, M132 e S225). Apesar disto, a CWD nunca foi notificada em espécies neotropicais.
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Vías de señalización en enfermedades priónicasRodríguez Fernández, Agustí 04 October 2007 (has links)
Las enfermedades priónicas, también conocidas como EETs (Encefalopatías Espongiformes Transmisibles), son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales que, debido a su transmisibilidad potencial han tenido un gran impacto social, político y económico en las últimas décadas. Las EETs afectan a los humanos y a algunos grupos de animales, presentan largos períodos de incubación y producen la muerte pocos meses después de la aparición de la sintomatología clínica. Su origen se atribuye a la presencia, multiplicación y deposición de una proteína anormal llamada prión. El prión (o PrPSc) es una forma mal conformada de la proteína priónica celular (PrPc), presente en condiciones fisiológicas en las membranas de las células. El prión es parcialmente resistente a las proteasas, resistente a desinfectantes físico-químicos convencionales, y capaz de convertir de forma auto-catalítica a la PrPc dando lugar a la propagación en cadena de la forma patogénica. El prión es transmisible, no sólo entre individuos de una misma especie sino también entre individuos de especies diferentes. Las EETs animales más importantes son el scrapie, que afecta a las ovejas y las cabras, y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), que afecta a las vacas (vulgarmente conocida como "mal de las vacas locas").En el caso de las EETs humanas, las más relevantes son la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), el insomnio familiar fatal (FFI) y el Kuru. La ECJ tiene una incidencia de 1 o 2 casos por millón de habitantes y año en todo el mundo, afecta por igual a hombres y mujeres, y cursa con demencia, mioclonías y ataxia cerebelar. Neuropatológicamente, provoca pérdida neuronal, astrocitosis, microgliosis y cambio espongiforme. La presencia de la proteína 14-3-3 en el LCR y de un EEG típico, son factores diagnóstico, aunque el diagnóstico definitivo se hace a nivel post-mortem con la detección de la PrPSc por inmunohistoquímica y/o western blot.El impacto social y sobre la salud pública y animal que han tenido las enfermedades priónicas en las últimas décadas fue originado, en gran medida, por la epidemia de EEB que afectó en los años 90 al Reino Unido, principalmente. Esta epidemia se atribuyó a la alimentación de las vacas con piensos enriquecidos con proteínas procedentes de ovejas infectadas con scrapie. Debido a la transmisibilidad ínter-específica de los priones, éstos infectaron a las vacas y éstas, al pasar a la cadena alimenticia, a los humanos, dando lugar a la nueva variante de la ECJ. La ECJ tiene un origen esporádico en un 85% de los casos, es decir, el inicio de la enfermedad se produce de manera espontánea, a pesar de que éste se asocia a la presencia de priones residuales en el SNC, a la generación de mutaciones puntuales en el gen de la PrP (PRNP) o bien a la conversión espontánea de la PrP debido a alteraciones físico-químicas de la proteína. En el 10% de los casos, la ECJ es genética y hereditaria, es decir, se atribuye a mutaciones en el PRNP que pasan a las células germinales y a la nueva generación. En este escenario, se habla de ECJ familiar. El 5% de los casos de ECJ restantes se asocian a una transmisión iatrogénica, es decir, por contaminación durante transplantes, tratamientos hormonales, manipulación quirúrgica, etc., aunque este tipo de transmisión está prácticamente erradicada. El propósito general de esta tesis es el estudio de las EETs dirigido a incrementar el conocimiento acerca de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la neuropatología de estas enfermedades. Si bien la multiplicación y deposición del prión se consideran los detonantes de la neuropatología y sintomatología clínica asociadas a las EETs, es asumible que los mecanismos involucrados en estas alteraciones sean complejos y tengan un origen multifactorial. En este escenario, las alteraciones en la neurotransmisión y la disfunción de algunos grupos de proteínas relacionados con la supervivencia celular se consideran cruciales en el desarrollo de las enfermedades priónicas y de sus fenómenos neuropatológicos asociados. Atendiendo a las observaciones anteriores, esta tesis se ha enfocado a estudiar el papel que juegan ciertos grupos de proteínas en la neurotransmisión, la espongiosis y la muerte neuronal. Para abordar experimentalmente cada una de estas líneas de interés, nuestros estudios van ecaminados a: conocer el estado de la vía de señalización vinculada a la transmisión glutamatérgica y de adenosina; conocer el papel de los canales de agua o aquaporinas cerebrales en relación a la vacuolización y al cambio espongiforme característico de las EETs y, por último, estudiar la vía de señalización de las MAPKs en relación a la degeneración neuronal. Estos estudios se realizan sobre corteza frontal de material humano post-mortem de casos con ECJ y sobre la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB, esto es, de ratones transgénicos para la PrP bovina infectados con EEB en diferentes estadíos de desarrollo de la enfermedad. Los resultados obtenidos muestran, en primer lugar, un deterioro de las vías de señalización de los receptores metabotrópicos de glutamato de grupo I en la corteza frontal de ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad, lo cual sugiere que las fosfolipasas y los elementos constituyentes de la transducción de señales de dicha vía son particularmente sensibles a las EETs. En segundo lugar, se ha encontrado un incremento de la expresión y la actividad de los receptores A1 de adenosina en la corteza frontal de casos con ECJ así como un aumento de la expresión de estos receptores en corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento en los niveles de A1Rs puede ser una respuesta al daño neuronal, teniendo en cuenta su papel neuroprotector en el SNC. En tercer lugar, se ha detectado un incremento de la expresión de AQP1 y AQP4 en la corteza frontal de casos con ECJ así como en la corteza cerebral de un modelo murino de la EEB asociado al progreso de la enfermedad. El incremento de la expresión de AQPs se puede asociar a una alteración de la homeostasis celular y a la formación de vacuolas que pueden contribuir al cambio espongiforme característico de las enfermedades priónicas. Por último, se ha encontrado un descenso de los niveles proteicos de los factores de transcripción c-fos y CREB en la corteza frontal de casos con ECJ, en contraste con el mantenimiento de los niveles de las MAPKs. El agotamiento de c-fos y CREB puede inducir neurodegeneración en estadios terminales de ECJ, considerando su papel mediador en los fenómenos de muerte y supervivencia celular.Si bien, los resultados que se desprenden de esta tesis mejoran la comprensión de los fenómenos celulares y moleculares que acompañan a la patología de las EETs, serán necesarios estudios ulteriores con modelos celulares y animales para conocer con mayor exactitud de qué modo y en qué medida contribuye el prión a estas alteraciones. / Prion diseases, also known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), are a group of fatal neurodegenerative diseases that have had an important social, political and economical impact in the last decades, according to their potential transmissibility. TSEs affect human and animals, and their incubation period is long. They caused death after a few months from the first clinical symptoms. TSEs origin is associated to the presence, multiplication and deposition of an abnormal protein called prion. Prion, also called PrPSc, is an abnormal form of the cellular prion protein (PrPC), which is a cell-anchored glycoprotein expressed in a wide range of animal tissues but it is enriched into the central nervous system (CNS). Prions are partially resistant to protease digestion and also resistant to conventional physical-chemical treatments. Prions are able to recruit PrPC leading to the propagation of the pathogenic conformation. Prions are transmissible, not only between individuals from the same specie, but also between individuals from different species.The most important animal TSEs are scrapie, affecting sheep and goats, and Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) affecting cows (also called mad cow disease). In humans, TSEs include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome (GSS), Fatal Familial Insomnia (FFI) and Kuru. CJD has an incidence of 1 or 2 cases per million of population within a year around the world, affects both men and women and causes dementia, myoclonia and cerebellar ataxia. Neuropathologically, CJD is characterized by neuron loss, astrocytosis, mycroglyosis and spongiform change. The presence of 14-3-3 protein in CSF and a typical EEG are diagnosis factors but final diagnosis is done by PrPSc detection by immunohistochemistry of Western blotting. The impact of TSEs on public and animal health in the last decades was originated, mainly, by the BSE epidemic which affected United Kingdom in the nineties. This epidemic was attributed to the enrichment of cows food with proteins derived from scrapie-infected sheep. Due to the inter-specific transmissibility of prions, cows became infected from consumption of cow-derived food. CJD has a sporadic origin in 85% of cases. This origin is associated to the presence of residual prions into the brain or to punctual mutations in the prion protein gene (PRNP) or to a spontaneous PrP conversion due to physical or chemical environmental changes. The rest of CJD cases have an inherited or an iatrogenic transmission.The general purpose of this thesis is the study of TSEs directed to increase knowledge about cellular and molecular mechanisms involved in the neuropathology of prion diseases. It can be assumed that the multiplication and accumulation of prions into the CNS are likely the causes of TSEs, but also that mechanisms associated to neuropathologycal alterations linked to prion pathology have probably a multifactor origin. In this scenario, the alterations in neurotransmission and the dysfunction of many groups of proteins related to cell survival are considered crucial in the development of prion diseases and their neuropathological features. Giving some consideration to these observations, this thesis has been focused in the study of the role of some groups of proteins in neurotransmission, spongiform change and neuron loss. More specifically, we have studied signalling pathways linked to glutamate and adenosine transmission, water channel brain aquaporins in relation with vacuolization and spongiform change, and MAPKs signaling in relation with neurodegeneration. All these studies have been done on human cerebral cortex from neurological post-mortem material of CJD cases and on the cerebral cortex of BSE-infected PrP-bovine transgenic mice at different stages of disease progression. The results obtained show, first of all, impaired group I metabotropic glutamate transmission and also increased adenosine A1 receptor signaling in the cerebral cortex of CJD cases and, on the other hand, in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased adenosine A1 receptor levels could be a response to neuronal damage due to the neuroprotective role of these receptors into the brain. In addition, we have found an increased AQP1 and AQP4 expression in the cerebral cortex of CJD cases and in the cortex of a BSE murine model with disease progression. Increased AQPs expression in brain could be associated with abnormal cell homeostasis and with the formation of vacuoles which can lead to spongiform change. Finally, we have also found decreased c-fos and CREB levels, in both inactivated and activated forms, in frontal cortex of CJD cases and also in the cerebral cortex of a BSE murine model with disease progression. Decreased c-fos and CREB transcription factors are associated with cell death and cell death, so could lead to neurodegeneration in terminal stages of CJD. Although the results presented here can improve the understanding of cellular and molecular events involved in TSEs pathology, further studies using animals and cell models would be necessary to know more exactly whether prions can lead to these alterations.
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Scrapie: diagnóstico por imuno-histoquímica, caracterização de surtos e genótipos em ovinos no brasil / Scrapie: diagnosis by imunohistichemistry, and genotiping of sheep in BrazilLeal, Juliano de Souza January 2013 (has links)
As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.
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Scrapie: diagnóstico por imuno-histoquímica, caracterização de surtos e genótipos em ovinos no brasil / Scrapie: diagnosis by imunohistichemistry, and genotiping of sheep in BrazilLeal, Juliano de Souza January 2013 (has links)
As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), ou doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no encéfalo. A presença de uma forma protéica anormal (PrPSc), ao invés da sua forma normal (PrPC), no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel, resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amiloides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. A partir da implantação do programa de vigilância epidemiológica da encefopatia espongiforme bovina (EEB), coordenado pelo Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH) do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Setor de Patologia Veterinária da UFRGS tem sido requisitado frequentemente para realização de exames de necropsias e de materiais de animais com suspeita de scrapie. A técnica de imuno-histoquímica (IHQ) é o teste para o diagnóstico das EETs mais específico disponível até o momento, sendo cada vez mais utilizado para diagnóstico, rastreamento, estudo da patogênese e fornecimento de informações comparativas em nível molecular. Por outro lado, a genotipagem é uma ferramenta importante no auxílio da identificação da suscetibilidade genética a scrapie, tornando o diagnóstico mais seguro, além de possibilitar a identificação de casos atípicos de scrapie, como a Nor98. Este trabalho consistiu na realização da IHQ para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos, associado à genotipagem dos ovinos. Entre 2009 e 2012 foram realizadas colheitas de materiais para exames de IHQ e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de ovinos das raças Suffolk, Santa Inês, Dorper e mestiços. As amostras foram obtidas a partir de biopsias e necropsias para diagnóstico de scrapie. Foi realizada também a genotipagem nos animais para os códons 136, 154 e 171 da proteína PRP, e em alguns casos no códon 141. Foram realizadas três repetições da IHQ para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por IHQ no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentou um número de, no mínimo, três folículos linfoides com centros germinativos marcados pela técnica. Entre os resultados obtidos neste trabalho pode-se incluir o primeiro diagnóstico positivo para scrapie de genótipo resistente (ARR/ARR) não Nor98, na espécie ovina no Brasil, com marcação por IHQ nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosa reto-anal. Este animal era pertencente a um rebanho de ovinos mestiços Sufolk, no qual foram diagnosticados mais nove animais positivos para scrapie nas tonsilas palatínicas, terceira pálpebra e mucosas reto-anal. A coleta e envio de material de vários órgãos linfoides foi considerada importante por possibilitar a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, reduzindo o número de casos considerados suspeitos, o risco de falsos positivos, e parte, senão a totalidade, dos casos com material insuficiente para diagnóstico. Em necropsia, a coleta de tonsilas palatínicas mostrou-se eficaz pelo seu alto índice de marcação positiva. A coleta de amostras de sangue foi importante para a realização do teste de genotipagem, permitindo avaliar o grau de resistência/susceptibilidade do animal, complementando os resultados de IHQ. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), the prion diseases, occurs both in animals and in humans, are responsable for a transmissible and hereditary disease, and cause degenerative lesions in the brain tissue. The presence of an abnormal protein (PrPSc), instead of its normal form (PrPC), on the nervous and lymphoreticular tissue is characteristic of TSEs. This protein is highly insoluble and resistant to degradation by proteases and eventually settles in the gray matter in the form of amyloid plaques that causes massive death of neurons and glial cells, causing intense vacuolization in the affected tissue. After the establishment of the Bovine Spongiform Encephalopathy surveillance program, coordinated by the National Rabies and Other Encephalopathies Control Program, the Setor de Patologia Veterinária of UFRGS has been usually required to proceed necropsy and other diagnosis in suspicious animals. The immunohistochemistry (IHC) is the most specific technique actually used to TSEs identification, being increasingly used to diagnosis, traceability, pathogenesis study and providing comparative information on the molecular level. On the other hand, genotyping is an important tool on scrapie genetic susceptibility identification, making more secure the diagnosis, beyond to enable the atypical scrapie cases identification, like Nor98. This work consisted to performing IHC to prionic protein, on nervous system and lymphoreticular tissue, as scrapie diagnostic method in sheep and goat, associate to genotyping in sheep. Sheep tissues were sampled from Suffolk, Santa Inês, Dorper and crossbreed to proceed IHC and hematoxilin-eosin staining between 2009 and 2012. The samples were obtained by biopsy and necropsy to scrapie diagnose. Genotyping of codons 136, 154 and 171 of PRP protein was performed, as well as a few of codon 141. The monoclonal antibody anti-prion F98/160.1.5 and F99/97.6.1 was used at the IHC. For each positive sample three repetitions were performed. The diagnostic by IHC at lymphoreticular tissue was considered positive when it shows at minimum three follicles with germinal centers stained. Among the obteined results, could be included the first diagnostic of scrapie not Nor98 in resistant genotype (ARR/ARR) sheep in Brazil. This animal belongs to a Suffolk sheep flock in which were diagnosed more nine scrapie positive animals showing IHC staining on tonsils, third eyelid and rectal mucosa. The sampling and dispatch of many lymphoid tissues was considered important to enable the confirmation of agent presence or not in at least two of them, reducing the number of suspicious cases, the risk of false positive, and part, if not all, of cases with insufficient material for diagnosis. At necropsy, the tonsils collecting showed efficient by the it high positive staining level. Blood sampling becomes important to proceed genotyping test, allowing measure the animal resistance/susceptibility grade, complementing the IHC results.
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