Apesar da espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. ser bastante rústica e estar adaptada às condições adversas de clima e solo brasileiros, seu rendimento é muito baixo. Diversas causas têm sido levantadas para explicar esse comportamento; entre elas destacam-se as doenças fúngicas, sobretudo aquelas cujos patógenos são transmitidos por sementes, em especial a podridão cinzenta do caule, causada por Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. A abordagem analítica desse patossistema revelou alguns problemas emergentes. Entre eles, destacam-se: a) desconhecimento da qualidade sanitária das sementes de caupi, utilizadas para semeadura; b) desunifomidade na metodologia usada para detectar os patógenos presentes nas semente; c) dificuldade na esporulação do patógeno, máxime de alguns isolados reticentes em esporular em meios artificiais de cultivo, cujo comportamento dificulta os trabalhos de seleção de genótipos resistentes; d) carência de medidas de controle do patógeno, que empreguem práticas naturais, como uso de sementes sadias, de indutores de resistência e de cultivares resistentes, de fácil uso e passível de adoção por parte dos produtores. Na estruturação da matriz lógica do presente estudo, referidos problemas foram transformados em objetivos. Os trabalhos foram conduzidos no Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP, em Piracicaba-SP. Os resultados indicaram o teste de sanidade de sementes de caupi empregando o método do papel de filtro com restrição hídrica utilizando NaCl a -0,8Mpa, como o mais adequado para detecção dos fungos presentes nas sementes de caupi, especialmente M. phaseolina. A análise sanitária das amostras de sementes originadas de vários estados brasileiros revelou que, em 62% das amostras analisadas, o fungo M. phaseolina estava presente, sendo as amostras originadas do estado da Paraíba, Piauí, Pará e Bahia as que apresentaram maiores níveis de incidência do patógeno. Os melhores níveis de esporulação do patógeno foram conseguidos com a combinação de sobreposição de discos de folhas de trigo ao meio BDA, com temperatura de 25oC. Quanto à identificação de indutores de resistência, capazes de controlar M. phaseolina, os resultados revelaram que o acibenzolar-S-metil (ASM) foi o mais eficiente, quando comparado com quitosana e com um produto silicatado derivado de rocha micronizada (PSiM), apresentando um controle residual por mais de 40 dias após a semeadura. A maior eficiência verificada pelo ASM ocorreu devido a sua capacidade de ativar mecanismos bioquímicos de defesa, configurando-se em efetivo ativador da resistência induzida nas plantas de caupi, por atuar na cinética de importantes enzimas relacionadas à defesa, como a fenilalanina amônia-liase, peroxidase e quitinase. Quanto à reação de cultivares de caupi à doença, foi possível verificar razoável nível de resistência de algumas cultivares, tendo sido consideradas resistentes Mulato, Guariba e Maratauã. / Notwithstanding the specie Vigna unguiculata (L.) Walp is sufficiently rustic and adapted to the adverse conditions of the Brazilian soil and climate, its improvement is very low. Many causes have been raised in order to explain such behavior; among them the fungal diseases stand out, over all those whose pathogens are transmitted by the seeds especially the charcoal rot disease caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. The analytical approach of such pathosystem has revealed some emerging problems. Among them, it stands out: a) the ignorance of the sanitary quality of the cowpea seeds used for sowing; b) the non-uniformity in the used methodology in order to detect the pathogens, which are present in the seed; c) the difficult in pathogen sporulation, principally of some isolated reticent in forming spores in cultivation artificial environments whose behavior hampers the selection works of the resistant genotypes; d) lack of pathogen control measures, which utilize natural practices, such as the use of healthy seeds, resistance inducers and resistant cultivars of easy utilization and liable to adoption by the producers. In structuring the logical matrix of this study, such problems were transformed into objectives. The works were conducted at the Entomology, Phytopathology and Agricultural Zoology Departments of ESALQ/USP, in Piracicaba-SP. The results have pointed out the sanity test of the cowpea seeds through the method of filter paper with hydric restriction using NaCI - 0,8Mpa, as the most suitable for detecting the current fungus in cowpea seeds, especially M. phaseolina. The sanitary analysis of the seeds samples originated from several Brazilian states has revealed that in 63% of the analyzed samples, the fungus M. phaseolina was present, and the samples originated from the states of Paraíba, Piauí, Pará and Bahia were those that have presented higher incident levels of pathogen. The best levels of sporulation were obtained with the combination of the superposition of wheat leaves disks in the middle of BDA in 25ºC. As to the identification of the resistance inducers, capable of controlling the M. phaseolina, the results have revealed that the acinbezolar-S-methyl (ASM) was more efficient when compared to chitosan and with a silicate product originated from micronized rock (PsiM), presenting a residual control for more than 40 days after the sowing. The greatest efficiency ascertained by ASM has occurred due to its capacity of activate the defense biochemistries mechanisms, forming itself in an activator effect of the induced resistance in cowpea plants because it acts in the kinetic of important enzymes related to the defense, such as the phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and chitinase. As to the cowpea cultivars reaction to the disease, it was possible to ascertain a reasonable resistance level of some cultivars, and BR 14 Mulato, Guariba e Maratauã were considered as resistant.

The ex situ fungal cultures collections represent important biological heritage and is useful for mycologists and plant pathologists, supporting several scientific works. They provide viable pathogens anytime and assisting at identification, morpho-physiological aspects, life cycle, epidemiology, resistance to fungicides and breeding programs in resistance of diseases. However, there is not a universal preservation method that is efficient and suitable for the different groups of fungi. The most appropriate is the one that maintain, even after long periods, the original characteristics of culture: viability, sporulation and pathogenicity, excluding mutations and undesirable contamination. The choice will depend of the laboratory infrastructure, micro-organism, objectives, preferences and knowledge of the researcher. For necrotrophic fungi, after passing their life cycle stage as saprophytes they can be isolated in growing medium, using different preservation methods, especially: periodic transfer, dried host tissues, sterile water (Castellani), mineral oil, sterile soil, freezing, silica gel, lyophilization and cryopreservation. The study aimed to describe the efficiency of sterile soil (68 isolates), resistant structures (Sclerotinia sclerotiorum) in 4°C (10 strains), gelatin (17 strains), mineral oil (31 strains) and silica gel (14 strains) on the maintenance of viability, sporulation and colonization-pathogenicity of phytopathogenic necrotrophic fungi preserved in different dates, in Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP), Uberlândia (MG), and in Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia (LAMIF), Monte Carmelo (MG). The gelatine method has never been tested for fungi. The viability remained in 38 strains of sterile soil; three of mineral oil, 10 of gelatin. Sclerotia s maximum time of preservation was four years, and all fungal strains were viable on silica gel. / As coleções ex situ de culturas fúngicas são um importante patrimônio biológico, úteis à micologia e fitopatologia como suporte em trabalhos científicos. Disponibilizam patógenos a qualquer momento para: identificação, estudos morfofisiológicos, ciclo de vida, epidemiologia, resistência aos fungicidas e programas de melhoramento, visando resistência a doenças. Não há um método de preservação que seja eficiente e recomendado para os diferentes grupos de fungos, sendo mais adequado aquele que mantiver, mesmo após longos períodos, as características originais da cultura viabilidade, esporulação e patogenicidade , evitando mutações e contaminações indesejadas. A escolha irá depender da infraestrutura do laboratório, do microrganismo em estudo, dos objetivos do trabalho e de preferências e conhecimentos do pesquisador. Para os fungos necrotróficos, que passam alguma fase de seu ciclo de vida como saprófitas, podendo ser isolados em meio de cultivo, utilizam-se: repicagens periódicas, tecidos secos do hospedeiro, Castellani, óleo mineral, terriço, congelamento, sílica-gel, liofilização e criopreservação. O trabalho objetivou avaliar a eficiência de métodos de preservação e o tempo máximo de manutenção da viabilidade, esporulação, colonização/patogenicidade de fungos fitopatogênicos necrotróficos utilizados no Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP) em Uberlândia (MG) e no Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia (LAMIF) em Monte Carmelo (MG), preservados pelos métodos: terriço (68 isolados), escleródios (Sclerotinia sclerotiorum) em 4 °C (10 isolados), gelatina (17 isolados), óleo mineral (31 isolados) e sílica-gel (14 isolados), em diferentes datas. Mantiveram-se viáveis 38 isolados em terriço, três isolados em óleo mineral e 10 isolados em gelatina. O tempo máximo de preservação de escleródios foi de quatro anos, sendo que todos os isolados em sílica-gel permaneceram viáveis. / Mestre em Agronomia

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis – Minas gerais State and Jardinópolis – São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.

Apesar da espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. ser bastante rústica e estar adaptada às condições adversas de clima e solo brasileiros, seu rendimento é muito baixo. Diversas causas têm sido levantadas para explicar esse comportamento; entre elas destacam-se as doenças fúngicas, sobretudo aquelas cujos patógenos são transmitidos por sementes, em especial a podridão cinzenta do caule, causada por Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. A abordagem analítica desse patossistema revelou alguns problemas emergentes. Entre eles, destacam-se: a) desconhecimento da qualidade sanitária das sementes de caupi, utilizadas para semeadura; b) desunifomidade na metodologia usada para detectar os patógenos presentes nas semente; c) dificuldade na esporulação do patógeno, máxime de alguns isolados reticentes em esporular em meios artificiais de cultivo, cujo comportamento dificulta os trabalhos de seleção de genótipos resistentes; d) carência de medidas de controle do patógeno, que empreguem práticas naturais, como uso de sementes sadias, de indutores de resistência e de cultivares resistentes, de fácil uso e passível de adoção por parte dos produtores. Na estruturação da matriz lógica do presente estudo, referidos problemas foram transformados em objetivos. Os trabalhos foram conduzidos no Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP, em Piracicaba-SP. Os resultados indicaram o teste de sanidade de sementes de caupi empregando o método do papel de filtro com restrição hídrica utilizando NaCl a –0,8Mpa, como o mais adequado para detecção dos fungos presentes nas sementes de caupi, especialmente M. phaseolina. A análise sanitária das amostras de sementes originadas de vários estados brasileiros revelou que, em 62% das amostras analisadas, o fungo M. phaseolina estava presente, sendo as amostras originadas do estado da Paraíba, Piauí, Pará e Bahia as que apresentaram maiores níveis de incidência do patógeno. Os melhores níveis de esporulação do patógeno foram conseguidos com a combinação de sobreposição de discos de folhas de trigo ao meio BDA, com temperatura de 25oC. Quanto à identificação de indutores de resistência, capazes de controlar M. phaseolina, os resultados revelaram que o acibenzolar-S-metil (ASM) foi o mais eficiente, quando comparado com quitosana e com um produto silicatado derivado de rocha micronizada (PSiM), apresentando um controle residual por mais de 40 dias após a semeadura. A maior eficiência verificada pelo ASM ocorreu devido a sua capacidade de ativar mecanismos bioquímicos de defesa, configurando-se em efetivo ativador da resistência induzida nas plantas de caupi, por atuar na cinética de importantes enzimas relacionadas à defesa, como a fenilalanina amônia-liase, peroxidase e quitinase. Quanto à reação de cultivares de caupi à doença, foi possível verificar razoável nível de resistência de algumas cultivares, tendo sido consideradas resistentes Mulato, Guariba e Maratauã. / Notwithstanding the specie Vigna unguiculata (L.) Walp is sufficiently rustic and adapted to the adverse conditions of the Brazilian soil and climate, its improvement is very low. Many causes have been raised in order to explain such behavior; among them the fungal diseases stand out, over all those whose pathogens are transmitted by the seeds especially the charcoal rot disease caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. The analytical approach of such pathosystem has revealed some emerging problems. Among them, it stands out: a) the ignorance of the sanitary quality of the cowpea seeds used for sowing; b) the non-uniformity in the used methodology in order to detect the pathogens, which are present in the seed; c) the difficult in pathogen sporulation, principally of some isolated reticent in forming spores in cultivation artificial environments whose behavior hampers the selection works of the resistant genotypes; d) lack of pathogen control measures, which utilize natural practices, such as the use of healthy seeds, resistance inducers and resistant cultivars of easy utilization and liable to adoption by the producers. In structuring the logical matrix of this study, such problems were transformed into objectives. The works were conducted at the Entomology, Phytopathology and Agricultural Zoology Departments of ESALQ/USP, in Piracicaba-SP. The results have pointed out the sanity test of the cowpea seeds through the method of filter paper with hydric restriction using NaCI – 0,8Mpa, as the most suitable for detecting the current fungus in cowpea seeds, especially M. phaseolina. The sanitary analysis of the seeds samples originated from several Brazilian states has revealed that in 63% of the analyzed samples, the fungus M. phaseolina was present, and the samples originated from the states of Paraíba, Piauí, Pará and Bahia were those that have presented higher incident levels of pathogen. The best levels of sporulation were obtained with the combination of the superposition of wheat leaves disks in the middle of BDA in 25ºC. As to the identification of the resistance inducers, capable of controlling the M. phaseolina, the results have revealed that the acinbezolar-S-methyl (ASM) was more efficient when compared to chitosan and with a silicate product originated from micronized rock (PsiM), presenting a residual control for more than 40 days after the sowing. The greatest efficiency ascertained by ASM has occurred due to its capacity of activate the defense biochemistries mechanisms, forming itself in an activator effect of the induced resistance in cowpea plants because it acts in the kinetic of important enzymes related to the defense, such as the phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and chitinase. As to the cowpea cultivars reaction to the disease, it was possible to ascertain a reasonable resistance level of some cultivars, and BR 14 Mulato, Guariba e Maratauã were considered as resistant.