Orientador: Ronaldo Aloise Pilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bockelmann_MariaAlice_D.pdf: 38380135 bytes, checksum: ccd3fbf3780ed6acdc817e4423cdfafd (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Quimica

Orientador: Ronaldo Aloise Pilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T07:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosso_GiovanniBernardi_D.pdf: 15549651 bytes, checksum: c4309cb39642c602d7b5b33d48fe1565 (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Quimica

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9574_1.pdf: 2755393 bytes, checksum: c501fbe3d0def5e85e710a6bff657501 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho são descritas novas metodologias para a utilização de compostos quirais de enxofre, uma vez que é conhecido seu potencial em transmitir quiralidade para outros centros. Primeiramente, realizou-se um estudo de transferência enantiosseletiva de ligantes a cetonas α,β-insaturadas - em uma adição do tipo Michael - mediadas por organocupratos de ordem superior utilizando-se o (SR)-metil-p-toluilsulfóxido como ligante não transferível. As reações, no entanto, não se mostraram estereosseletivas. Em outra parte do trabalho foi realizado um estudo da adição enantiosseletiva de brometo de alilzinco a aldeídos utilizando compostos quirais de enxofre como indutores de quiralidade. Diversos parâmetros como a quantidade de ligante utilizada nas reações, temperatura reacional e solvente, foram analisados e os álcoois homoalílicos desejados foram obtidos em bons rendimentos e em moderados excessos enantioméricos. Estes resultados podem ser considerados bastante significativos para este tipo de reação, visto que a quantidade de ligante quiral empregado nas reações (0,5 mol%) é uma das menores encontradas na literatura. A última parte deste trabalho descreve o estudo metodológico da adição de grupos arilas ao (SR)-4-hidróxi-4-[(p-toluilsulfinil)metil]-2,5-cicloexadienona. Os produtos de adição 1,4 foram obtidos em excelentes excessos diastereoméricos quando grupos arila foram utilizados em reações de adição ao p-quinol. Posteriormente, a metodologia desenvolvida, foi aplicada na síntese estereosseletiva de fenil-cicloexanonas e fenil-cicloexenonas substituídas, uma vez que estes fragmentos estão presentes em esqueletos de diversos produtos naturais, como os constituintes da família Amaryllidaceae. A estratégia sintética utilizada, mostrou-se bastante versátil, uma vez que foram sintetizados de maneira estereosseletiva, derivados funcionalizados de hexanonas cíclicas em bons rendimentos e bons excessos diastereoisoméricos

BORGES, K. B. Análise estereosseletiva da tioridazina e seus principais metabólitos: um estudo cinético de biotransformação empregando fungos. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. Atualmente, existe um grande interesse em estudar a biotransformação estereosseletiva de fármacos, incluindo os processos que reproduzem as vias de metabolização in vivo. Alguns desses estudos estão sendo realizados empregando microrganismos como, por exemplo, fungos. A cromatografia líquida de alta eficiência é umas das técnicas que pode ser empregada para a resolução, identificação e quantificação das espécies quirais formadas. A tioridazina (THD) é um fármaco quiral, com atividade antipsicótica utilizado para o tratamento da esquizofrenia. Possui como principais metabólitos a tioridazina-2-sulfóxido (THD-2-SO) e tioridazina-2-sulfona (THD-2-SO2), ambos com atividade antipsicótica, e a tioridazina-5-sulfóxido (THD-5-SO), que contribui para o efeito cardiotóxico do fármaco. Portanto, o presente trabalho tem por finalidade o desenvolvimento de um método de análise estereosseletiva da THD-2-SO e THD-5-SO em meio de cultura para avaliação do potencial de biotransformação da THD por alguns fungos. A melhor resolução dos estereoisômeros da THD-2-SO e THD-5-SO foi obtida utilizando a coluna CHIRALPAK® AS e fase móvel hexano : etanol : metanol (92:6:2, v/v/v) + 0,5% de dietilamina. A extração líquido líquido foi utilizada na preparação das amostras, tendo como solvente extrator o éter etílico. O método desenvolvido apresentou recuperação em torno de 100% para todos os compostos avaliados. Os coeficientes de variação e erros obtidos nos estudos de precisão e exatidão, intra e interensaios, foram inferiores a 10%. O método desenvolvido e validado foi empregado para avaliar o potencial de biotransformação da THD por 12 fungos endofíticos isolados de Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria e Viguiera robusta e 1 fungo de solo (Penicillium waksmanii). Dentre os 13 fungos avaliados, quatro merecem destaque por apresentarem um potencial de biotransformação estereosseletivo mais evidenciado: Phomopsis sp. (TD2) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (9,3% e 5,8%, respectivamente);Glomerella cingulata (VA1) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) + (R)-(FE) (39,7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) apresentou maior mono-2-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (84,4% e 82,5%, respectivamente) e Aspergillus fumigatus (VR12) apresentou maior mono-2-sulfoxidação das formas (S)-(FE) (20,7%) e (R)-(SE) (34,4%). / BORGES, K. B. Stereoselective analysis of thioridazine and its major metabolites: a kinetic study of biotransformation by fungi. 2006. 124p. Dissertation (Masters degree) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. The interest in stereoselective biotransformation of drugs including the processes that reproduce the in vivo metabolism has been increased. To study drug metabolism several models have been used. Among them, studies carried out using microorganisms, mainly fungi have been standing out. High-Performance Liquid Chromatography can be used for the resolution, identification and quantification of the chiral species formed. The thioridazine (THD) is a chiral drug used as antipsychotic for the treatment of schizophrenia. The main metabolites of THD are thioridazine-2-sulfoxide (THD-2-SO), thioridazine-2-sulfone (THD-2-SO2) and thioridazine-5-sulfoxide (THD-5-SO). The THD-2-SO and THD-2-SO2 possesss antipsychotic activity and THD-5-SO contributes to the cardiotoxicity of drug more than the parent compound. Therefore, the aim of the present work was to develop a method for the stereoselective analysis of THD-2-SO and THD-5-SO in culture medium to study biotransformation of THD by some fungi. The simultaneous determination of thioridazine-2-sulfoxide and thioridazine-5-sulfoxide was performed on a CHIRALPAK® AS column using a mobile phase constituted of hexane: ethanol: methanol (92:6:2, v/v/v) + 0.5% diethylamine. Diethyl ether was used as extraction solvent. Recoveries around 100% were obtained for all the evaluated species. The coefficients of variation and relative errors in precision and accuracy studies (within-day and between-day) were below 10%. The validated method was used to evaluate the biotransformation of THD by 12 endophytic fungi isolated from Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria and Viguiera robusta and 1 fungus isolated from soil (Penicillium waksmanii). Among the 13 fungi evaluated, four of them deserve prominence for presenting an evidenced stereoselective biotransformation potential: Phomopsis sp. (TD2) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) e (R)-(FE) (9.3% and 5.8%, respectively); Glomerella cingulata (VA1) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) + (R)-(FE) (39.7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) and (R)-(FE) (84.4% and 82.5%, respectively) and Aspergillus fumigatus (VR12) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(FE) (20.7%) and (R)-(SE) (34.4%).

BORGES, K. B. Análise estereosseletiva da tioridazina e seus principais metabólitos: um estudo cinético de biotransformação empregando fungos. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. Atualmente, existe um grande interesse em estudar a biotransformação estereosseletiva de fármacos, incluindo os processos que reproduzem as vias de metabolização in vivo. Alguns desses estudos estão sendo realizados empregando microrganismos como, por exemplo, fungos. A cromatografia líquida de alta eficiência é umas das técnicas que pode ser empregada para a resolução, identificação e quantificação das espécies quirais formadas. A tioridazina (THD) é um fármaco quiral, com atividade antipsicótica utilizado para o tratamento da esquizofrenia. Possui como principais metabólitos a tioridazina-2-sulfóxido (THD-2-SO) e tioridazina-2-sulfona (THD-2-SO2), ambos com atividade antipsicótica, e a tioridazina-5-sulfóxido (THD-5-SO), que contribui para o efeito cardiotóxico do fármaco. Portanto, o presente trabalho tem por finalidade o desenvolvimento de um método de análise estereosseletiva da THD-2-SO e THD-5-SO em meio de cultura para avaliação do potencial de biotransformação da THD por alguns fungos. A melhor resolução dos estereoisômeros da THD-2-SO e THD-5-SO foi obtida utilizando a coluna CHIRALPAK® AS e fase móvel hexano : etanol : metanol (92:6:2, v/v/v) + 0,5% de dietilamina. A extração líquido líquido foi utilizada na preparação das amostras, tendo como solvente extrator o éter etílico. O método desenvolvido apresentou recuperação em torno de 100% para todos os compostos avaliados. Os coeficientes de variação e erros obtidos nos estudos de precisão e exatidão, intra e interensaios, foram inferiores a 10%. O método desenvolvido e validado foi empregado para avaliar o potencial de biotransformação da THD por 12 fungos endofíticos isolados de Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria e Viguiera robusta e 1 fungo de solo (Penicillium waksmanii). Dentre os 13 fungos avaliados, quatro merecem destaque por apresentarem um potencial de biotransformação estereosseletivo mais evidenciado: Phomopsis sp. (TD2) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (9,3% e 5,8%, respectivamente);Glomerella cingulata (VA1) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) + (R)-(FE) (39,7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) apresentou maior mono-2-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (84,4% e 82,5%, respectivamente) e Aspergillus fumigatus (VR12) apresentou maior mono-2-sulfoxidação das formas (S)-(FE) (20,7%) e (R)-(SE) (34,4%). / BORGES, K. B. Stereoselective analysis of thioridazine and its major metabolites: a kinetic study of biotransformation by fungi. 2006. 124p. Dissertation (Masters degree) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. The interest in stereoselective biotransformation of drugs including the processes that reproduce the in vivo metabolism has been increased. To study drug metabolism several models have been used. Among them, studies carried out using microorganisms, mainly fungi have been standing out. High-Performance Liquid Chromatography can be used for the resolution, identification and quantification of the chiral species formed. The thioridazine (THD) is a chiral drug used as antipsychotic for the treatment of schizophrenia. The main metabolites of THD are thioridazine-2-sulfoxide (THD-2-SO), thioridazine-2-sulfone (THD-2-SO2) and thioridazine-5-sulfoxide (THD-5-SO). The THD-2-SO and THD-2-SO2 possesss antipsychotic activity and THD-5-SO contributes to the cardiotoxicity of drug more than the parent compound. Therefore, the aim of the present work was to develop a method for the stereoselective analysis of THD-2-SO and THD-5-SO in culture medium to study biotransformation of THD by some fungi. The simultaneous determination of thioridazine-2-sulfoxide and thioridazine-5-sulfoxide was performed on a CHIRALPAK® AS column using a mobile phase constituted of hexane: ethanol: methanol (92:6:2, v/v/v) + 0.5% diethylamine. Diethyl ether was used as extraction solvent. Recoveries around 100% were obtained for all the evaluated species. The coefficients of variation and relative errors in precision and accuracy studies (within-day and between-day) were below 10%. The validated method was used to evaluate the biotransformation of THD by 12 endophytic fungi isolated from Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria and Viguiera robusta and 1 fungus isolated from soil (Penicillium waksmanii). Among the 13 fungi evaluated, four of them deserve prominence for presenting an evidenced stereoselective biotransformation potential: Phomopsis sp. (TD2) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) e (R)-(FE) (9.3% and 5.8%, respectively); Glomerella cingulata (VA1) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) + (R)-(FE) (39.7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) and (R)-(FE) (84.4% and 82.5%, respectively) and Aspergillus fumigatus (VR12) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(FE) (20.7%) and (R)-(SE) (34.4%).

O uso de fungos na biotransformação estereosseletiva de fármacos pode constituirse em uma excelente alternativa à síntese assimétrica para obtenção de metabólitos, bem como aos estudos de biotransformação in vivo e in vitro convencionais. Neste trabalho foram empregados fungos isolados de órgãos internos de plantas, classificados como endofíticos, fungos fitopatógenos, bem como, fungos adquiridos de coleções de micro-organismos. Esses fungos foram empregados no estudo da biotransformação estereosseletiva dos fármacos midodrina, bufuralol e donepezila. Estes fármacos foram selecionados por produzirem metabólitos ativos nos processos de biotransformação em humanos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos dos fármacos foi necessário desenvolver e validar métodos analíticos com características adequadas para essa aplicação. Para determinação enantiosseletiva da midodrina e seu metabólito empregou-se a eletroforese capilar, enquanto que para a determinação aquiral empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência. Para avaliar a biotransformação estereosseletiva do bufuralol e donepezila foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência. Os dados referentes ao estudo de cada fármaco são apresentados em quatro capítulos. O primeiro capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método empregando a eletroforese capilar para a determinação enantiosseletiva de midodrina e seu metabólito desglimidodrina (DMAE) em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando 30 mmol L-1 de trimetil- -ciclodextrina dissolvida em solução de acetato de sódio 70 mmol L-1, pH 5, como tampão de análise. A técnica de preparação das amostras empregada foi a extração líquidolíquido. O método foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 12000 ng mL-1, com coeficientes de correlação linear 0.9975. Os resultados de precisão e exatidão foram inferiores a 15% e a robustez do método foi avaliada através de um planejamento fatorial fracionário. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos endofíticos. Foram avaliados oito fungos com destaque para o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) que biotransformou 21,3% da (+)-midodrina em (+)-DMAE e 2,4% da (-)-midodrina em (-)-DMAE, em 72 h de biotransformação, apresentando um excesso enantiomérico de 79,7%. O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método cromatográfico para a determinação de midodrina e DMAE em meio de cultura Czapek-Dox. As análises foram realizadas no modo reverso de eluição empregando uma coluna Lichrospher 100 RP 18 e fase móvel composta por acetonitrila:ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1 e detecção em 290 nm. O preparo de amostras empregado foi a extração líquido-líquido, usando acetato de etila como solvente extrator. O método foi validado na faixa de concentração de 0,4 a 40 ?g mL-1, com coeficientes de correlação linear superiores ii a 0,9997. Este método foi aplicado em um estudo de biotransformação da midodrina empregando o fungo endofítico Papulaspora immersa e duas linhagens do fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). Entre os fungos estudados, o Botrytis cinerea 2100, em condição de agitação, apresentou o maior percentual de biotransformação da midodrina em DMAE (42,2% em 48 h). Além disso, nos cromatogramas referentes a biotransformação em condição estática, pelos fungos Papulaspora immersa e Botrytis cinerea 2100, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles realizados. Estes fungos foram submetidos à biotransformação em escala ampliada, em condição estática, a partir das quais foram isolados DMAE de ambos os fungos e um derivado desaminado da midodrina (Botrytis cinerea 2100). No terceiro capítulo são apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método para a determinação estereosseletiva do bufuralol e seus metabólitos 1'-oxobufuralol e 1'-hidroxibufuralol em meio Czapek, usando a coluna Chiralcel OD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 248 e 273 nm. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca em três fases foi usada como procedimento de preparação das amostras. As condições empregadas na extração foram: fase doadora em pH 13 ajustado com NaOH 2 mol L-1, n-octanol como solvente orgânico, fase aceptora constituída por ácido acético 0,2 mol L-1, tempo de extração de 30 min e velocidade de agitação de 1750 rpm. Os valores de recuperação do método ficaram na faixa de 50 - 69%. O método foi aplicado em um estudo piloto de biotransformação com cinco espécies de fungos endofíticos. Nenhum dos fungos estudados biotransformou o bufuralol em 1'-oxobufuralol e/ou 1'-hidroxibufuralol e, devido a isso, o método desenvolvido não foi validado. O quarto capítulo mostra os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência na determinação enantiosseletiva da donepezila, 5-O-desmetil donepezila e 6-O-desmetil donepezila em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas na coluna Chiralpak AD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:etanol:metanol (75:20:5, v/v/v) acrescido de 0,3% de trietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 270 nm. A técnica de preparação das amostras foi a extração líquido-líquido e o solvente extrator foi o acetato de etila. O método descrito foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 10000 ng mL-1 para os enantiômeros da donepezila (r 0,9985) e 100 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da 5-O-desmetil donepezila e 6- O-desmetil donepezila (r 0,9951). Os valores de recuperação foram superiores a 90% para todos os analitos. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos. Foram avaliados cinco fungos endofíticos e os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os fungos endofíticos não desmetilaram a donepezila nas condições estudadas, entretanto, esta reação foi catalisada pelo fungo B. bassiana que biotransformou predominantemente 8,3% da donepezila em (-)-(R)-5-O-desmetil donepezila (ee, 60,6%), enquanto que o fungo C. elegans apresentou biotransformação enantiosseletiva da donepezila em (-)-(R)-6-O-desmetil donepezila (ee, 100%) com um rendimento de 15,1%. Os dados aqui apresentados demonstram que biotransformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em mamíferos e para a obtenção de metabólitos de fármacos, especialmente na forma de enantiômeros puros. / Drug biotransformations using fungi are considered an alternative approach to the asymmetric synthesis and conventional in vivo and in vitro metabolism studies. In this work, endophytic fungi isolated from health internal plant organs, phythophatogenic fungi and fungi purchased from ATCC were used to study the stereoselective biotransformation of midodrine, bufuralol and donepezil drugs. These drugs were selected because the biotrasformation process in humans results in active metabolites. To evaluate the metabolite formation during the biotransformation study, suitable analytical methods were required. The midodrine biotransformation was evaluated under chiral and achiral conditions. For the enantiosselective determination of midodrine, a capillary electrophoresis method was used, whereas the achiral determination of this drug and its metabolite was carried out by liquid chromatography. The determination of the other drugs was performed by chiral liquid chromatography.The results of each studied drug are presented in four chapters. In the first chapter, a capillary electrophoresis method was described for the stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine (DMAE) in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing endophytic fungi. The electrophoretic analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 70 mmol L-1 sodium acetate buffer solution (pH 5.0) containing 30 mmol L-1 heptakis (2, 3, 6-tri-O-methyl)--CD as running electrolyte. The applied voltage and temperature used were 15 kV and 15°C, respectively. The UV detector was set at 200 nm. The sample preparation was carried out by liquid- liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -12000 ng mL-1 for each enantiomer of midodrine and DMAE (r 0.9975). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The method proved to be robust by a fractional factorial design evaluation. The validated method was used to assess the midodrine biotransformation to DMAE by eight endophytic fungi. The fungus Papulaspora immersa (SS13) showed the best biotransformation results. It biotransformed 21.3% of (+)-midodrine to (+)-DMAE and 2.4% of (-)-midodrine to (-)-DMAE, after 72 hours. The observed enantiomeric excess was 79.7%. The second chapter describes the optimization and validation of a method for the determination of midodrine and DMAE in Czapek-Dox culture medium. The analyses were carried out under reverse elution mode using a Lichrospher 100 RP 18 column and acetonitrile: formic acid solution 40 mmol L-1 (60:40, v/v), as mobile phase, at a flow rate of 1.4 mL min-1 and UV detection at 290 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 0.4 - 40 ?g mL-1 for each analyte (r 0.9997). This method was applied to evaluate the biotransformation of midodrine by the endophyte Papulaspora immersa and two Botrytis cinerea strains (UCA 992 and 2100). Among the studied fungi, Botrytis v cinerea 2100, at shaken condition, showed the higher percentual of DMAE formation (42.2%, at 48 hours). Moreover, the chromatograms obtained for the biotransformation under static condition, showed additional peaks not detected at performed controls, for both Papulaspora immersa and Botrytis cinerea 2100. Further biotransformation experiments were carried out at large scale on static condition. In addition to DMAE, a deaminated midodrine derivative was isolated from Botrytis cinerea 2100. In the third chapter, a three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) method was used for the sample preparation of bufuralol and its metabolites 1'-oxobufuralol and 1'- hydroxybufuralol in Czapek culture medium. The analysis was carried out by chiral liquid chromatography using a Chiralcel OD-H column with hexane: isopropanol:methanol (97.5:2.0:0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved the use of n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1750 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 50-69%. The method was used to assess the biotransformation of bufuralol using five endophytic fungi strains. None of the studied fungi biotransformed bufuralol to 1'-oxobufuralol and / or 1'- hidroxybufuralol and because of this, the method developed was not validated. In the fourth chapter a chiral liquid chromatography method was described for the stereoselective determination of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil, and 6-Odesmethyl donepezil in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing fungi. The analysis was carried out using a Chiralpak AD-H column with hexane:ethanol:methanol (75:20:5, v/v/v) plus 0.3% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and UV detection at 270 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -10000 ng mL-1 for each enantiomer of donepezil (r 0.9985) and of 100 - 5000 ng mL-1 for each enantiomer of 5-O-desmethyl donepezil and 6-Odesmethyl donepezil (r 0.9951). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The recoveries were higher that 90% for all analytes. The validated method was used to assess the donepezil biotransformation by five endophytes and by Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159 fungi. The endophytic fungi do not demethylate donepezil at the studied conditions. On the other hand, Beauveria bassiana ATCC 7159 biotransformed 8.3% of donepezil to (-)- (R)-5-O-desmethyl donepezil (ee, 60.6%), while Cunninghamella elegans ATCC 10028B biotransformed 15.1% of donepezil to (-)-(R)-6-O-desmethyl donepezil (ee, 100%). The data presented here show that the biotransformations with fungi are an important alternative to mimetize biotransformations in mammals and to obtain drug metabolites, especially as pure enantiomers.

O uso de fungos na biotransformação estereosseletiva de fármacos pode constituirse em uma excelente alternativa à síntese assimétrica para obtenção de metabólitos, bem como aos estudos de biotransformação in vivo e in vitro convencionais. Neste trabalho foram empregados fungos isolados de órgãos internos de plantas, classificados como endofíticos, fungos fitopatógenos, bem como, fungos adquiridos de coleções de micro-organismos. Esses fungos foram empregados no estudo da biotransformação estereosseletiva dos fármacos midodrina, bufuralol e donepezila. Estes fármacos foram selecionados por produzirem metabólitos ativos nos processos de biotransformação em humanos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos dos fármacos foi necessário desenvolver e validar métodos analíticos com características adequadas para essa aplicação. Para determinação enantiosseletiva da midodrina e seu metabólito empregou-se a eletroforese capilar, enquanto que para a determinação aquiral empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência. Para avaliar a biotransformação estereosseletiva do bufuralol e donepezila foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência. Os dados referentes ao estudo de cada fármaco são apresentados em quatro capítulos. O primeiro capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método empregando a eletroforese capilar para a determinação enantiosseletiva de midodrina e seu metabólito desglimidodrina (DMAE) em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando 30 mmol L-1 de trimetil- -ciclodextrina dissolvida em solução de acetato de sódio 70 mmol L-1, pH 5, como tampão de análise. A técnica de preparação das amostras empregada foi a extração líquidolíquido. O método foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 12000 ng mL-1, com coeficientes de correlação linear 0.9975. Os resultados de precisão e exatidão foram inferiores a 15% e a robustez do método foi avaliada através de um planejamento fatorial fracionário. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos endofíticos. Foram avaliados oito fungos com destaque para o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) que biotransformou 21,3% da (+)-midodrina em (+)-DMAE e 2,4% da (-)-midodrina em (-)-DMAE, em 72 h de biotransformação, apresentando um excesso enantiomérico de 79,7%. O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método cromatográfico para a determinação de midodrina e DMAE em meio de cultura Czapek-Dox. As análises foram realizadas no modo reverso de eluição empregando uma coluna Lichrospher 100 RP 18 e fase móvel composta por acetonitrila:ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1 e detecção em 290 nm. O preparo de amostras empregado foi a extração líquido-líquido, usando acetato de etila como solvente extrator. O método foi validado na faixa de concentração de 0,4 a 40 ?g mL-1, com coeficientes de correlação linear superiores ii a 0,9997. Este método foi aplicado em um estudo de biotransformação da midodrina empregando o fungo endofítico Papulaspora immersa e duas linhagens do fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). Entre os fungos estudados, o Botrytis cinerea 2100, em condição de agitação, apresentou o maior percentual de biotransformação da midodrina em DMAE (42,2% em 48 h). Além disso, nos cromatogramas referentes a biotransformação em condição estática, pelos fungos Papulaspora immersa e Botrytis cinerea 2100, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles realizados. Estes fungos foram submetidos à biotransformação em escala ampliada, em condição estática, a partir das quais foram isolados DMAE de ambos os fungos e um derivado desaminado da midodrina (Botrytis cinerea 2100). No terceiro capítulo são apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método para a determinação estereosseletiva do bufuralol e seus metabólitos 1'-oxobufuralol e 1'-hidroxibufuralol em meio Czapek, usando a coluna Chiralcel OD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 248 e 273 nm. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca em três fases foi usada como procedimento de preparação das amostras. As condições empregadas na extração foram: fase doadora em pH 13 ajustado com NaOH 2 mol L-1, n-octanol como solvente orgânico, fase aceptora constituída por ácido acético 0,2 mol L-1, tempo de extração de 30 min e velocidade de agitação de 1750 rpm. Os valores de recuperação do método ficaram na faixa de 50 - 69%. O método foi aplicado em um estudo piloto de biotransformação com cinco espécies de fungos endofíticos. Nenhum dos fungos estudados biotransformou o bufuralol em 1'-oxobufuralol e/ou 1'-hidroxibufuralol e, devido a isso, o método desenvolvido não foi validado. O quarto capítulo mostra os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência na determinação enantiosseletiva da donepezila, 5-O-desmetil donepezila e 6-O-desmetil donepezila em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas na coluna Chiralpak AD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:etanol:metanol (75:20:5, v/v/v) acrescido de 0,3% de trietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 270 nm. A técnica de preparação das amostras foi a extração líquido-líquido e o solvente extrator foi o acetato de etila. O método descrito foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 10000 ng mL-1 para os enantiômeros da donepezila (r 0,9985) e 100 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da 5-O-desmetil donepezila e 6- O-desmetil donepezila (r 0,9951). Os valores de recuperação foram superiores a 90% para todos os analitos. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos. Foram avaliados cinco fungos endofíticos e os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os fungos endofíticos não desmetilaram a donepezila nas condições estudadas, entretanto, esta reação foi catalisada pelo fungo B. bassiana que biotransformou predominantemente 8,3% da donepezila em (-)-(R)-5-O-desmetil donepezila (ee, 60,6%), enquanto que o fungo C. elegans apresentou biotransformação enantiosseletiva da donepezila em (-)-(R)-6-O-desmetil donepezila (ee, 100%) com um rendimento de 15,1%. Os dados aqui apresentados demonstram que biotransformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em mamíferos e para a obtenção de metabólitos de fármacos, especialmente na forma de enantiômeros puros. / Drug biotransformations using fungi are considered an alternative approach to the asymmetric synthesis and conventional in vivo and in vitro metabolism studies. In this work, endophytic fungi isolated from health internal plant organs, phythophatogenic fungi and fungi purchased from ATCC were used to study the stereoselective biotransformation of midodrine, bufuralol and donepezil drugs. These drugs were selected because the biotrasformation process in humans results in active metabolites. To evaluate the metabolite formation during the biotransformation study, suitable analytical methods were required. The midodrine biotransformation was evaluated under chiral and achiral conditions. For the enantiosselective determination of midodrine, a capillary electrophoresis method was used, whereas the achiral determination of this drug and its metabolite was carried out by liquid chromatography. The determination of the other drugs was performed by chiral liquid chromatography.The results of each studied drug are presented in four chapters. In the first chapter, a capillary electrophoresis method was described for the stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine (DMAE) in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing endophytic fungi. The electrophoretic analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 70 mmol L-1 sodium acetate buffer solution (pH 5.0) containing 30 mmol L-1 heptakis (2, 3, 6-tri-O-methyl)--CD as running electrolyte. The applied voltage and temperature used were 15 kV and 15°C, respectively. The UV detector was set at 200 nm. The sample preparation was carried out by liquid- liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -12000 ng mL-1 for each enantiomer of midodrine and DMAE (r 0.9975). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The method proved to be robust by a fractional factorial design evaluation. The validated method was used to assess the midodrine biotransformation to DMAE by eight endophytic fungi. The fungus Papulaspora immersa (SS13) showed the best biotransformation results. It biotransformed 21.3% of (+)-midodrine to (+)-DMAE and 2.4% of (-)-midodrine to (-)-DMAE, after 72 hours. The observed enantiomeric excess was 79.7%. The second chapter describes the optimization and validation of a method for the determination of midodrine and DMAE in Czapek-Dox culture medium. The analyses were carried out under reverse elution mode using a Lichrospher 100 RP 18 column and acetonitrile: formic acid solution 40 mmol L-1 (60:40, v/v), as mobile phase, at a flow rate of 1.4 mL min-1 and UV detection at 290 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 0.4 - 40 ?g mL-1 for each analyte (r 0.9997). This method was applied to evaluate the biotransformation of midodrine by the endophyte Papulaspora immersa and two Botrytis cinerea strains (UCA 992 and 2100). Among the studied fungi, Botrytis v cinerea 2100, at shaken condition, showed the higher percentual of DMAE formation (42.2%, at 48 hours). Moreover, the chromatograms obtained for the biotransformation under static condition, showed additional peaks not detected at performed controls, for both Papulaspora immersa and Botrytis cinerea 2100. Further biotransformation experiments were carried out at large scale on static condition. In addition to DMAE, a deaminated midodrine derivative was isolated from Botrytis cinerea 2100. In the third chapter, a three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) method was used for the sample preparation of bufuralol and its metabolites 1'-oxobufuralol and 1'- hydroxybufuralol in Czapek culture medium. The analysis was carried out by chiral liquid chromatography using a Chiralcel OD-H column with hexane: isopropanol:methanol (97.5:2.0:0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved the use of n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1750 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 50-69%. The method was used to assess the biotransformation of bufuralol using five endophytic fungi strains. None of the studied fungi biotransformed bufuralol to 1'-oxobufuralol and / or 1'- hidroxybufuralol and because of this, the method developed was not validated. In the fourth chapter a chiral liquid chromatography method was described for the stereoselective determination of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil, and 6-Odesmethyl donepezil in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing fungi. The analysis was carried out using a Chiralpak AD-H column with hexane:ethanol:methanol (75:20:5, v/v/v) plus 0.3% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and UV detection at 270 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -10000 ng mL-1 for each enantiomer of donepezil (r 0.9985) and of 100 - 5000 ng mL-1 for each enantiomer of 5-O-desmethyl donepezil and 6-Odesmethyl donepezil (r 0.9951). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The recoveries were higher that 90% for all analytes. The validated method was used to assess the donepezil biotransformation by five endophytes and by Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159 fungi. The endophytic fungi do not demethylate donepezil at the studied conditions. On the other hand, Beauveria bassiana ATCC 7159 biotransformed 8.3% of donepezil to (-)- (R)-5-O-desmethyl donepezil (ee, 60.6%), while Cunninghamella elegans ATCC 10028B biotransformed 15.1% of donepezil to (-)-(R)-6-O-desmethyl donepezil (ee, 100%). The data presented here show that the biotransformations with fungi are an important alternative to mimetize biotransformations in mammals and to obtain drug metabolites, especially as pure enantiomers.

Este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de métodos para análise estereosseletiva de alguns fármacos e metabólitos, bem como a aplicação desses métodos na avaliação do potencial de fungos, principalmente endofíticos, em processos de biotransformação. Os seguintes fármacos foram selecionados para esse estudo: fluoxetina, propranolol, omeprazol, oxibutinina e ibuprofeno. Para determinação simultânea dos enantiômeros da fluoxetina (FLX) e norfluoxetina (NFLX) em meios de cultura de fungos endofíticos, empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta, em um sistema com duas colunas em série, sendo uma de fase reversa (C18) e outra com fase estacionária quiral (Chirobiotic® V). A fase móvel foi composta por etanol: tampão acetato de amônio 15 mmol L-1, pH 5,90: acetonitrila (77,5: 17,5: 5, v/v/v) e a detecção foi realizada em 227 nm. A extração líquido-líquido foi empregada na preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 12,5 a 3750 ng mL-1 (r 0,996) para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 10%. Nas condições empregadas, os cinco fungos endofíticos estudados não foram capazes de promover a biotransformação da FLX (reação de demetilação). A eletroforese capilar foi empregada para análise enantiosseletiva do propranolol (PROP) e 4-hidroxipropranolol (4-OHPROP). A melhor condição de resolução dos enantiômeros foi encontrada com a aplicação de um planejamento experimental de Box-Behnken: solução de eletrólitos composta por tampão trietilamina / ácido fosfórico (TEA/H3PO4), 25 mmol L-1, pH 9,00, carboximetil--ciclodextrina 4% (m/v) como seletor quiral e análise realizada na voltagem de 17 kV. O método de extração líquido-líquido também foi empregado para preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 0,25 a 10,0 g mL-1 para 4-OHPROP e de 0,10 a 10,0 g mL-1 para PROP, apresentando coeficientes de correlação (r) 0,995 para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 15%. Os cinco fungos endofíticos em estudo se mostraram eficientes na biotransformação estereosseletiva do PROP, com maior formação do metabólito (-)-(S)-4-OHPROP. O fungo Glomerella cingulata (VA1), em especial, apresentou uma concentração de 1,745 g mL-1 do enantiômero (-)-(S)-4-OHPROP depois de 72 horas de incubação, ao passo que a formação do enantiômero (+)-(R)-4-OHPROP não foi observada. A utilização deste fungo em escalas ampliadas pode ser uma fonte promissora de obtenção do metabólito 4-OHPROP na forma enantiomericamente pura. A determinação simultânea de omeprazol (OMZ), 5-hidroxiomeprazol (5-HOMZ) e omeprazol sulfona (OMZ SUL) em meio de cultura Czapek Dox modificado ii tamponado foi realizada empregando um método rápido de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector por arranjo de diodos (UPLC / DAD), usando coluna monolítica de fase reversa e eluição por gradiente. OMZ, 5-HOMZ e OMZ SUL foram extraídos das amostras utilizando uma mistura de acetato de etila: t-butil metil éter (9: 1, v/v). A separação foi obtida empregando uma coluna RP 18 Chromolith Fast Gradient endcapped e fase móvel constituída por 0,15% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (solvente A) e 0,15% (v/v) de TFA em acetonitrila (solvente B). Os tempos de retenção foram de 0,70 min para 5-HOMZ, 0,74 min para OMZ, 0,77 min para OMZ SUL e 0,91 min para o padrão interno (bupropiona, BUP). O método foi linear no intervalo de 0,2 a 10,0 g mL-1 (r 0,995) para todos os analitos. O processo de biotransformação foi realizado durante apenas 24 horas de incubação, por causa de problemas de estabilidade do OMZ. Por esse mesmo motivo, a biotransformação estereosseletiva não foi avaliada. Apenas três fungos apresentaram formação do metabólito 5-HOMZ, e dentre estes, apenas o fungo Botritis cinerea (BC) produziu esse metabólito em concentração superior ao limite de quantificação do método. A formação do metabólito OMZ SUL foi observada para todos os fungos, exceto para Glomerella cingulata (VA1) e Guignardia mangiferae (VA15). Esses fungos podem ser úteis para a obtenção dos metabólitos do OMZ, mas estudos detalhados do comportamento do fármaco nas condições de cultivo são necessários, uma vez que este substrato pode sofrer degradação em meio ácido e na presença de luz. A análise simultânea dos enantiômeros da oxibutinina (OXY) e da N-desetiloxibutinina (DEOB) em meio de cultura Czapek foi obtida empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (HPLC/UV). Os analitos foram separados usando coluna quiral Chiralpak AD e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) e detectados em 210 nm. Um estudo piloto de biotransformação empregando os mesmos fungos e as condições de biotransformação utilizadas para os demais fármacos mostrou que não houve a formação do metabólito de interesse. Além disso, não houve uma diminuição significativa da concentração de OXY durante o período de incubação, o que poderia ser um indicativo da formação de outros metabólitos não monitorados nas condições de análise. Como a reação de desetilação da OXY para formar a DEOB não foi observada nos experimentos, não foi necessário realizar a validação do método analítico. A separação simultânea do ibuprofeno (IBP), dos enantiômeros do 2-hidroxi-ibuprofeno (2-OH-IBP) e dos estereoisômeros do carboxi-ibuprofeno (COOH-IBP) foi realizada empregando-se uma coluna Chiralpak AS-H e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: TFA (95: 5: 0,1, v/v/v). O solvente extrator usado na extração líquido-líquido foi uma mistura de hexano: acetato de etila (1: 1, v/v). A detecção foi feita por espectrometria de massas (MS/MS), com a fonte de ionização por eletronebulização operada no modo positivo (ESI+). O método foi linear nos intervalos de 0,1 a 20,0 g mL-1 para IBP, de 0,05 a 7,5 g mL-1 para o cada enantiômero do 2-OH-IBP e de 0,025 a 5,0 g mL-1 para cada estereoisômero do COOH-IBP. Os demais parâmetros de validação obtidos para o método apresentaram-se dentro dos limites recomendados pela literatura. Os sete fungos endofíticos estudados se mostraram eficientes na biotransformação do IBP em seu principal metabólito 2-OH-IBP, mas apenas os fungos Nigrospora sphaerica (SS67) e Chaetomium globosum (VR10) iii biotransformaram o IBP de forma enantiosseletiva mais acentuada, observando-se maior formação do metabólito ativo (+)-(S)-2-OH-IBP. A não estereosseletividade observada para os demais fungos pode ser indício de uma possível conversão quiral do fármaco, similar a que ocorre em humanos. A formação dos estereoisômeros do COOH-IBP não foi observada, provavelmente, porque sua rota de formação envolve uma seqüência de reações. Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que fungos, particularmente os endofíticos, podem ser uma fonte promissora para obtenção de metabólitos de fármacos, inclusive de forma enantiomericamente pura. / This work aimed the development and validation of suitable methods for the stereoselective analysis of some drugs and metabolites, as well as, the application of these methods to assess the potential of fungi, mainly the endophytic ones, in biotransformation processes. The following drugs were selected for this study: fluoxetine, propranolol, omeprazole, oxybutynin and ibuprofen. The simultaneous determination of fluoxetine (FLX) and norfluoxetine (NFLX) enantiomers in culture media of endophytic fungi was carried out by high-performance liquid chromatography with UV-detection, in a system of two columns coupled in series, in which one of them was a reversed phase (C18) column and the another one was a chiral stationary phase column (Chirobiotic ® V). The mobile phase consisted of ethanol: ammonium acetate buffer, 15 mol L-1, pH 5.90: acetonitrile (77.5: 17.5: 5, v/v/v) and the detection was performed at 227 nm. Liquid-liquid extraction was employed for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 12.5 to 3750 ng mL-1 (r 0.996) for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of method precision and accuracy were lower than 10%. In the studied conditions, the five endophytic fungi used were not able to perform the biotransformation of FLX (demethylation reaction). Capillary electrophoresis was employed for the enantioselective analysis of propranolol (PROP) and 4-hydroxypropranolol (4-OHPROP). The best condition for enantiomer resolution was obtained by applying an experimental design of Box-Behnken: electrolyte solution composed of triethylamine / phosphoric acid (TEA/H3PO4) buffer, 25 mmol L-1, pH 9.00, with 4% (w/v) carboxymethyl--cyclodextrin as the chiral selector and analysis performed at 17 kV. Liquid-liquid extraction was also used for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 0.25 to 10.0 g mL-1 for 4-OHPROP and 0.10 to 10.0 g mL-1 for PROP, presenting correlation coefficients (r) 0.995 for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of precision and accuracy were lower than 15%. All the five endophytic fungi (Phomopsis sp. (TD2), Glomerella cingulata (VA1), Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globosum (VR10) and Aspergillus fumigatus (VR12)) showed effectiveness in the stereoselective biotransformation of PROP, with higher formation of (-)-(S)-4-OH-PROP. The fungus Glomerella cingulata (VA1), in particular, showed a concentration of 1.745 g mL-1 for the enantiomer (-)-(S)-4-OHPROP after 72 hours of incubation, whereas there was no formation of the enantiomer (+)-(R)-4-OHPROP. Therefore, the use of this fungus in large scale may be a promising source to obtain 4-OHPROP in the enantiomerically pure form. A fast analytical method based on ultra-performance liquid chromatography / diode array detector (UPLC/DAD) using a monolithic reversed phase column and gradient elution was developed for the simultaneous determination of omeprazole (OMZ), 5-hydroxyomeprazole (5-HOMZ) and omeprazole sulfone (OMZ SUL) in modified and buffered Czapek-Dox culture medium. OMZ, 5-HOMZ and OMZ SUL were extracted using a mixture of ethyl acetate: methyl t-butyl ether (9: 1, v/v). The separation was achieved using a Chromolith Fast Gradient RP 18 endcapped column with the mobile phase consisting of 0.15% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water (solvent A) and 0.15% (v/v) TFA in acetonitrile (solvent B). Retention times were 0.70 min for 5-HOMZ, 0.74 min for OMZ, 0.77 min for OMZ SUL and 0.91 min for internal standard (bupropion, BUP). The method was linear over the concentration range of 0.2 to 10.0 g mL-1 (r 0.995) for all analytes. The biotransformation process was carried out only within 24 hours of incubation, due to OMZ instability. For the same reason, the stereoselectivity in this process was not evaluated. The formation of the metabolite 5-HOMZ was observed only for three fungi, and among them, only the fungus Botrytis cinerea (BC) produced this metabolite in concentrations higher than the limit of quantification. The formation of OMZ SUL was observed for all fungi, except for Guignardia mangiferae (VA1) and Glomerella cingulata (VA15). The fungi evaluated in this study can be useful to obtain the metabolites of OMZ, but detailed study of the drug stability in culture conditions is required, since this substrate can undergo degradation in acidic conditions and in the presence of light. The simultaneous analysis of oxybutinin (OXY) and N-desethyloxybutinin (DEOB) enantiomers in Czapek culture medium was carried out by liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). The analytes were separated using a Chiralpak AD column employing as mobile phase hexane: isopropanol: ethanol: diethylamine (94: 4: 2: 0.05, v/v/v/v) and detection at 210 nm. A pilot study of biotransformation using the same fungi and conditions employed for the biotransformation of the other drugs showed that the metabolite of interest was not formed. Moreover, the decrease in the concentration of OXY, which could be indicative of the formation of other metabolites not monitored under the conditions of analysis, was not observed. Since the reaction of OXY desethylation to form DEOB was not observed in the experiments, the validation of the analytical method was not required. The method for the simultaneous analysis of ibuprofen (IBP), 2-hydroxyibuprofen (2-OH-IBP) enantiomers and carboxyibuprofen (IBP-COOH) stereoisomers was developed using a Chiralpak AS-H column and a mobile phase consisting of hexane: isopropanol: TFA (95: 5: 0.1, v/v/v). A mixture of hexane: ethyl acetate (1: 1, v/v) was used as solvent extractor for sample preparation. The detection was performed by tanden mass spectrometry (MS/MS) with the electrospray interface operated in the positive mode (ESI+). The method was linear over the concentration range of 0.1 to 20.0 g mL-1 for IBP, 0.05 to 7.5 g mL-1 for each 2-OH-IBP enantiomer and 0.025 to 5.0 g mL-1 for each COOH-IBP stereoisomer. The other validation parameters studied were within the limits established in the literature. The seven studied endophytic fungi showed to be efficient in the biotransformation of IBP to its main metabolite 2-OH-IBP, however, only the fungi Nigrospora sphaerica (SS67) and Chaetomium globosum (VR10) biotransformed IBP enantioselectively, with greater formation of the active metabolite (+)-(S)-2-OH-IBP. The lack of stereoselectivity observed for the other fungi could be caused by a possible chiral inversion process occurring for IBP, in a similar way that happens in humans. The formation of COOH-IBP stereoisomers was not observed probably because the route of formation of this metabolite requires a sequence of reactions. The results presented here show that fungi, particularly the endophytic ones, may be a promising source to obtain the metabolites of drugs, including in their enantiomerically pure form.

Este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de métodos para análise estereosseletiva de alguns fármacos e metabólitos, bem como a aplicação desses métodos na avaliação do potencial de fungos, principalmente endofíticos, em processos de biotransformação. Os seguintes fármacos foram selecionados para esse estudo: fluoxetina, propranolol, omeprazol, oxibutinina e ibuprofeno. Para determinação simultânea dos enantiômeros da fluoxetina (FLX) e norfluoxetina (NFLX) em meios de cultura de fungos endofíticos, empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta, em um sistema com duas colunas em série, sendo uma de fase reversa (C18) e outra com fase estacionária quiral (Chirobiotic® V). A fase móvel foi composta por etanol: tampão acetato de amônio 15 mmol L-1, pH 5,90: acetonitrila (77,5: 17,5: 5, v/v/v) e a detecção foi realizada em 227 nm. A extração líquido-líquido foi empregada na preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 12,5 a 3750 ng mL-1 (r 0,996) para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 10%. Nas condições empregadas, os cinco fungos endofíticos estudados não foram capazes de promover a biotransformação da FLX (reação de demetilação). A eletroforese capilar foi empregada para análise enantiosseletiva do propranolol (PROP) e 4-hidroxipropranolol (4-OHPROP). A melhor condição de resolução dos enantiômeros foi encontrada com a aplicação de um planejamento experimental de Box-Behnken: solução de eletrólitos composta por tampão trietilamina / ácido fosfórico (TEA/H3PO4), 25 mmol L-1, pH 9,00, carboximetil--ciclodextrina 4% (m/v) como seletor quiral e análise realizada na voltagem de 17 kV. O método de extração líquido-líquido também foi empregado para preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 0,25 a 10,0 g mL-1 para 4-OHPROP e de 0,10 a 10,0 g mL-1 para PROP, apresentando coeficientes de correlação (r) 0,995 para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 15%. Os cinco fungos endofíticos em estudo se mostraram eficientes na biotransformação estereosseletiva do PROP, com maior formação do metabólito (-)-(S)-4-OHPROP. O fungo Glomerella cingulata (VA1), em especial, apresentou uma concentração de 1,745 g mL-1 do enantiômero (-)-(S)-4-OHPROP depois de 72 horas de incubação, ao passo que a formação do enantiômero (+)-(R)-4-OHPROP não foi observada. A utilização deste fungo em escalas ampliadas pode ser uma fonte promissora de obtenção do metabólito 4-OHPROP na forma enantiomericamente pura. A determinação simultânea de omeprazol (OMZ), 5-hidroxiomeprazol (5-HOMZ) e omeprazol sulfona (OMZ SUL) em meio de cultura Czapek Dox modificado ii tamponado foi realizada empregando um método rápido de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector por arranjo de diodos (UPLC / DAD), usando coluna monolítica de fase reversa e eluição por gradiente. OMZ, 5-HOMZ e OMZ SUL foram extraídos das amostras utilizando uma mistura de acetato de etila: t-butil metil éter (9: 1, v/v). A separação foi obtida empregando uma coluna RP 18 Chromolith Fast Gradient endcapped e fase móvel constituída por 0,15% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (solvente A) e 0,15% (v/v) de TFA em acetonitrila (solvente B). Os tempos de retenção foram de 0,70 min para 5-HOMZ, 0,74 min para OMZ, 0,77 min para OMZ SUL e 0,91 min para o padrão interno (bupropiona, BUP). O método foi linear no intervalo de 0,2 a 10,0 g mL-1 (r 0,995) para todos os analitos. O processo de biotransformação foi realizado durante apenas 24 horas de incubação, por causa de problemas de estabilidade do OMZ. Por esse mesmo motivo, a biotransformação estereosseletiva não foi avaliada. Apenas três fungos apresentaram formação do metabólito 5-HOMZ, e dentre estes, apenas o fungo Botritis cinerea (BC) produziu esse metabólito em concentração superior ao limite de quantificação do método. A formação do metabólito OMZ SUL foi observada para todos os fungos, exceto para Glomerella cingulata (VA1) e Guignardia mangiferae (VA15). Esses fungos podem ser úteis para a obtenção dos metabólitos do OMZ, mas estudos detalhados do comportamento do fármaco nas condições de cultivo são necessários, uma vez que este substrato pode sofrer degradação em meio ácido e na presença de luz. A análise simultânea dos enantiômeros da oxibutinina (OXY) e da N-desetiloxibutinina (DEOB) em meio de cultura Czapek foi obtida empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (HPLC/UV). Os analitos foram separados usando coluna quiral Chiralpak AD e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) e detectados em 210 nm. Um estudo piloto de biotransformação empregando os mesmos fungos e as condições de biotransformação utilizadas para os demais fármacos mostrou que não houve a formação do metabólito de interesse. Além disso, não houve uma diminuição significativa da concentração de OXY durante o período de incubação, o que poderia ser um indicativo da formação de outros metabólitos não monitorados nas condições de análise. Como a reação de desetilação da OXY para formar a DEOB não foi observada nos experimentos, não foi necessário realizar a validação do método analítico. A separação simultânea do ibuprofeno (IBP), dos enantiômeros do 2-hidroxi-ibuprofeno (2-OH-IBP) e dos estereoisômeros do carboxi-ibuprofeno (COOH-IBP) foi realizada empregando-se uma coluna Chiralpak AS-H e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: TFA (95: 5: 0,1, v/v/v). O solvente extrator usado na extração líquido-líquido foi uma mistura de hexano: acetato de etila (1: 1, v/v). A detecção foi feita por espectrometria de massas (MS/MS), com a fonte de ionização por eletronebulização operada no modo positivo (ESI+). O método foi linear nos intervalos de 0,1 a 20,0 g mL-1 para IBP, de 0,05 a 7,5 g mL-1 para o cada enantiômero do 2-OH-IBP e de 0,025 a 5,0 g mL-1 para cada estereoisômero do COOH-IBP. Os demais parâmetros de validação obtidos para o método apresentaram-se dentro dos limites recomendados pela literatura. Os sete fungos endofíticos estudados se mostraram eficientes na biotransformação do IBP em seu principal metabólito 2-OH-IBP, mas apenas os fungos Nigrospora sphaerica (SS67) e Chaetomium globosum (VR10) iii biotransformaram o IBP de forma enantiosseletiva mais acentuada, observando-se maior formação do metabólito ativo (+)-(S)-2-OH-IBP. A não estereosseletividade observada para os demais fungos pode ser indício de uma possível conversão quiral do fármaco, similar a que ocorre em humanos. A formação dos estereoisômeros do COOH-IBP não foi observada, provavelmente, porque sua rota de formação envolve uma seqüência de reações. Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que fungos, particularmente os endofíticos, podem ser uma fonte promissora para obtenção de metabólitos de fármacos, inclusive de forma enantiomericamente pura. / This work aimed the development and validation of suitable methods for the stereoselective analysis of some drugs and metabolites, as well as, the application of these methods to assess the potential of fungi, mainly the endophytic ones, in biotransformation processes. The following drugs were selected for this study: fluoxetine, propranolol, omeprazole, oxybutynin and ibuprofen. The simultaneous determination of fluoxetine (FLX) and norfluoxetine (NFLX) enantiomers in culture media of endophytic fungi was carried out by high-performance liquid chromatography with UV-detection, in a system of two columns coupled in series, in which one of them was a reversed phase (C18) column and the another one was a chiral stationary phase column (Chirobiotic ® V). The mobile phase consisted of ethanol: ammonium acetate buffer, 15 mol L-1, pH 5.90: acetonitrile (77.5: 17.5: 5, v/v/v) and the detection was performed at 227 nm. Liquid-liquid extraction was employed for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 12.5 to 3750 ng mL-1 (r 0.996) for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of method precision and accuracy were lower than 10%. In the studied conditions, the five endophytic fungi used were not able to perform the biotransformation of FLX (demethylation reaction). Capillary electrophoresis was employed for the enantioselective analysis of propranolol (PROP) and 4-hydroxypropranolol (4-OHPROP). The best condition for enantiomer resolution was obtained by applying an experimental design of Box-Behnken: electrolyte solution composed of triethylamine / phosphoric acid (TEA/H3PO4) buffer, 25 mmol L-1, pH 9.00, with 4% (w/v) carboxymethyl--cyclodextrin as the chiral selector and analysis performed at 17 kV. Liquid-liquid extraction was also used for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 0.25 to 10.0 g mL-1 for 4-OHPROP and 0.10 to 10.0 g mL-1 for PROP, presenting correlation coefficients (r) 0.995 for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of precision and accuracy were lower than 15%. All the five endophytic fungi (Phomopsis sp. (TD2), Glomerella cingulata (VA1), Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globosum (VR10) and Aspergillus fumigatus (VR12)) showed effectiveness in the stereoselective biotransformation of PROP, with higher formation of (-)-(S)-4-OH-PROP. The fungus Glomerella cingulata (VA1), in particular, showed a concentration of 1.745 g mL-1 for the enantiomer (-)-(S)-4-OHPROP after 72 hours of incubation, whereas there was no formation of the enantiomer (+)-(R)-4-OHPROP. Therefore, the use of this fungus in large scale may be a promising source to obtain 4-OHPROP in the enantiomerically pure form. A fast analytical method based on ultra-performance liquid chromatography / diode array detector (UPLC/DAD) using a monolithic reversed phase column and gradient elution was developed for the simultaneous determination of omeprazole (OMZ), 5-hydroxyomeprazole (5-HOMZ) and omeprazole sulfone (OMZ SUL) in modified and buffered Czapek-Dox culture medium. OMZ, 5-HOMZ and OMZ SUL were extracted using a mixture of ethyl acetate: methyl t-butyl ether (9: 1, v/v). The separation was achieved using a Chromolith Fast Gradient RP 18 endcapped column with the mobile phase consisting of 0.15% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water (solvent A) and 0.15% (v/v) TFA in acetonitrile (solvent B). Retention times were 0.70 min for 5-HOMZ, 0.74 min for OMZ, 0.77 min for OMZ SUL and 0.91 min for internal standard (bupropion, BUP). The method was linear over the concentration range of 0.2 to 10.0 g mL-1 (r 0.995) for all analytes. The biotransformation process was carried out only within 24 hours of incubation, due to OMZ instability. For the same reason, the stereoselectivity in this process was not evaluated. The formation of the metabolite 5-HOMZ was observed only for three fungi, and among them, only the fungus Botrytis cinerea (BC) produced this metabolite in concentrations higher than the limit of quantification. The formation of OMZ SUL was observed for all fungi, except for Guignardia mangiferae (VA1) and Glomerella cingulata (VA15). The fungi evaluated in this study can be useful to obtain the metabolites of OMZ, but detailed study of the drug stability in culture conditions is required, since this substrate can undergo degradation in acidic conditions and in the presence of light. The simultaneous analysis of oxybutinin (OXY) and N-desethyloxybutinin (DEOB) enantiomers in Czapek culture medium was carried out by liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). The analytes were separated using a Chiralpak AD column employing as mobile phase hexane: isopropanol: ethanol: diethylamine (94: 4: 2: 0.05, v/v/v/v) and detection at 210 nm. A pilot study of biotransformation using the same fungi and conditions employed for the biotransformation of the other drugs showed that the metabolite of interest was not formed. Moreover, the decrease in the concentration of OXY, which could be indicative of the formation of other metabolites not monitored under the conditions of analysis, was not observed. Since the reaction of OXY desethylation to form DEOB was not observed in the experiments, the validation of the analytical method was not required. The method for the simultaneous analysis of ibuprofen (IBP), 2-hydroxyibuprofen (2-OH-IBP) enantiomers and carboxyibuprofen (IBP-COOH) stereoisomers was developed using a Chiralpak AS-H column and a mobile phase consisting of hexane: isopropanol: TFA (95: 5: 0.1, v/v/v). A mixture of hexane: ethyl acetate (1: 1, v/v) was used as solvent extractor for sample preparation. The detection was performed by tanden mass spectrometry (MS/MS) with the electrospray interface operated in the positive mode (ESI+). The method was linear over the concentration range of 0.1 to 20.0 g mL-1 for IBP, 0.05 to 7.5 g mL-1 for each 2-OH-IBP enantiomer and 0.025 to 5.0 g mL-1 for each COOH-IBP stereoisomer. The other validation parameters studied were within the limits established in the literature. The seven studied endophytic fungi showed to be efficient in the biotransformation of IBP to its main metabolite 2-OH-IBP, however, only the fungi Nigrospora sphaerica (SS67) and Chaetomium globosum (VR10) biotransformed IBP enantioselectively, with greater formation of the active metabolite (+)-(S)-2-OH-IBP. The lack of stereoselectivity observed for the other fungi could be caused by a possible chiral inversion process occurring for IBP, in a similar way that happens in humans. The formation of COOH-IBP stereoisomers was not observed probably because the route of formation of this metabolite requires a sequence of reactions. The results presented here show that fungi, particularly the endophytic ones, may be a promising source to obtain the metabolites of drugs, including in their enantiomerically pure form.

A análise estereosseletiva tem um lugar de destaque em várias áreas e, dentre elas, a farmacêutica, pois diversos fármacos quirais são comercializados como misturas racêmicas. A análise estereosseletiva empregando a cromatografia líquida de alta eficiência e a eletroforese capilar é prática e bastante eficaz para aplicações que envolvem a determinação de enantiômeros ao nível de traços em matrizes complexas, como por exemplo, em estudos de disposição cinética. Entretanto, devido à complexidade das matrizes biológicas, há necessidade da preparação da amostra antes de sua análise. Entre as diversas técnicas existentes, as mais utilizadas são a extração líquido-líquido e a extração em fase sólida. Contudo, essas técnicas apresentam algumas desvantagens,sendo a principal delas o uso de grandes quantidades de solventes. Portanto, técnicas que requerem pouco ou nenhum consumo de solventes orgânicos são bastante desejáveis. Entre essas técnicas destacam-se a microextração em fase sólida (SPME) e a microextração em fase líquida (LPME). Essas técnicas relativamente recentes têm como vantagens a utilização de quantidades mínimas de solventes orgânicos, o alto poder de concentração, a remoção dos interferentes da matriz biológica e a simplicidade de automação. Nesse trabalho propusemos a utilização da SPME e LPME como técnicas de preparação de amostras de urina, visando o desenvolvimento de métodos estereosseletivos com detectabilidade e seletividade adequadas para aplicação em estudos posteriores de disposição cinética. A SPME foi empregada para análise estereosseletiva do ibuprofeno e de seus principais metabólitos, carboxiibuprofeno e 2-hidroxiibuprofeno e da hidroxicloroquina e seus principais metabólitos, enquanto que a LPME foi usada para a análise estereosseletiva da hidroxicloroquina e seus metabólitos. Inicialmente, foi realizada a otimização da separação dos fármacos e metabólitos em diversas colunas quirais,a otimização da separação da hidroxicloroquina e seus metabólitos por eletroforese capilar e,em seguida, a otimização dos procedimentos de extração e a validação dos métodos desenvolvidos. Utilizando a coluna Chiralpak AD-RH® e fase móvel composta por solução de ácido fosfórico 1 mol L-1 pH 3 : metanol (75 : 25, v/v), foi validado um método para análise enantiosseletiva do ibuprofeno em urina. A SPME foi empregada para extração do ibuprofeno das amostras de urina utilizando a fibra PDMS-DVB 60 6;m. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 0,25 a 25 μg mL–1 para cada enantiômero. Para a análise do 2-hidroxiibuprofeno e carboxiibuprofeno, foi utilizada a coluna Chiralpak AS® e fase móvel composta por hexano: isopropanol (94 : 6, v/v) + 0,05% de ácido trifluoracético. A extração desses metabólitos foi feita empregando a fibra de CW-TPR 50 µm. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 5 a 50 µg mL -1. Já para a análise da hidroxicloroquina e seus principais metabólitos, DHCQ e DCQ, foi utilizada a coluna Chiralcel OD-H® e fase móvel composta por hexano : etanol : metanol (96 : 2 : 2, v/v/v) + 0,2% de dietilamina. A extração desses metabólitos foi feita empregando a fibra de PDMSDVB 60 μm. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 50 a 1000 ng mL -1para HCQ e 42 - 416 ng mL-1 para os metabólitos. A microextração em fase líquida foi avaliada na análise da hidroxicloroquina e seus metabólitos, BDCQ, DHCQ e DCQ e separação por eletroforese capilar. Para tanto foi utilizado um capilar de sílica fundida nãorecoberto com um comprimento efetivo de 42 cm, e 30 mmol L-1 de HP-b-CD + 1% de CD-b- sulfatada dissolvida em tampão tris(hidroxiaminometano) 100 mmol L-1 pH 9 como tampão de análise. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 10 - 1000 ng mL-1 para HCQ e 21-333 ng mL-1 para os metabólitos. Obteve-se precisão com coeficientes de variação inferiores a 15% e exatidão com erros relativos menores que 15% para todos os métodos desenvolvidos. Após validação, os métodos foram empregados na determinação da quantidade excretada acumulada do do ibuprofeno, da hidroxicloroquina e de seus metabólitos após administração de de rac-ibuprofeno e rac-hidroxicloroquina a voluntários sadios. Em suma, as duas técnicas foram eficientes na extração dos fármacos e metabólitos estudados. A SPME mostrou ser uma técnica de mais fácil manuseio, porém com baixos valores de recuperação. Por outro lado, a LPME apresentou valores de recuperação maiores, porém o manuseio do sistema de extração foi mais difícil, necessitando de um tempo maior para o domínio da técnica. / The stereoselective analysis has been standing out in several areas, and it is mainly present in the pharmaceutical industry, since many drugs are marketed as racemic mixtures. The stereoselective analysis employing high-performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE) is very useful for the determination of enantiomers at very low concentrations, as the ones found in biological matrices, for instance, in pharmacokinetic studies. The first step in the analysis of drugs in biological fluids is the extraction procedure. The most common extraction procedures employed are liquid-liquid extraction and solidphase extraction. These techniques show several drawbacks, such as the high amount of organic solvent consumed. So, based on this fact, techniques that consume small amounts of organic solvents are desirable. Among these techniques, solid-phase microextraction (SPME) and liquid-phase microextraction (LPME) have been stood out. The main advantages of these techniques are the small amount of organic solvent consumed and its high capacity in drug concentration. In this work, our purpose was to employ the SPME and the LPME as sample preparation techniques to develop stereoselective methods to be further applied in pharmacokinetic studies. SPME was employed for the stereoselective analysis of ibuprofen, hydroxychloroquine and their major metabolites.On the other hand,LPME was employed only for the enantioselective analysis of hydroxychloroquine and its metabolites. The first step was the separation optimization of the drugs and their metabolites by HPLC using several chiral columns, and the separation optimization of hydroxychloroquine and its metabolites by CE. Next, the extraction optimizations and method validations were performed. The enantioselective analysis of ibuprofen in human urine was carried out in the Chiralpak AD-RH® column, using methanol-pH 3.0 phosphoric acid solution (75 : 25 v/v) as mobile phase. The method was linear over the 0.5 - 25 µg mL-1 concentration range for both enantiomers. The fiber used in this method was PDMS-DVB 60 µm.The analysis of 2-hydroxyibuprofen and carboxyibuprofen was performed on a Chiralpak AS® column using hexane:isopropanol (95 : 5 v/v) plus 0.05% trifluoroacetic acid as the mobile phase. The method was linear over the 5 - 50 µg mL-1 concentration range. To perform the extractions, a CW-TPR 50 µm coated fiber was employed. The analysis of hydroxychloroquine and its major metabolites (DCQ and DHCQ) was done on a Chiralcel OD-H® column using hexane-methanol-ethanol (96 : 2 : 2, v/v/v) plus 0.2% diethylamine as mobile phase. The extraction was performed using a PDMS-DVB 60 µm coated fiber. The method was linear over the range of 50 - 1000 ng mL-1 for HCQ enantiomers and over the range of 42 - 416 ng mL-1 for DCQ and DHCQ enantiomers. LPME and CE were applied for the chiral determination of hydroxychloroquine and its metabolites (DCQ, DHCQ, BDCQ) in human urine. The electrophoretic separations were carried out in 100 mmol L-1tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer (pH adjusted to 9.0 with phosphoric acid) containing 1% (w/v) S-b-CD and 30 mg mL-1 HP-?-CD, with a constant voltage of +18 kV. The method was linear over the concentration range of 10-1000 ng mL -1 for each HCQ stereoisomer and 21-333 ng mL -1 for each metabolite stereoisomer. Within-day and between-day assay precision and accuracy for all described methods were lower than 15%. The developed methods were applied for the determination of the cumulative urinary excretion of ibuprofen metabolites and hydroxychloroquine and its metabolites after oral administration of racibuprofen and rac-hydroxychloroquine to health volunteers. Comparing the techniques, both SPME and LPME were efficient to extract the drugs and their metabolites from human urine. iv SPME showed to be an easier technique to handle, however, the drug amount recovered by this technique was too small. On the contrary, LPME was a more difficulty technique to be handled, but better recovery values were obtained with this technique.