Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-10T19:38:43Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Leslie Raphael de Moura Ferraz.pdf: 8655466 bytes, checksum: a554c3d8872057ed335fb3671da5d4ac (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T19:38:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Leslie Raphael de Moura Ferraz.pdf: 8655466 bytes, checksum: a554c3d8872057ed335fb3671da5d4ac (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) / Desenvolvido inicialmente como agente antimalárico, o sulfato de hidroxicloroquina (HCQ) é frequentemente utilizado como fármaco antirreumático de ação lenta no tratamento de desordens de tecido conectivo. Apesar de ser bastante conhecido na prática clínica, muito pouco é sabido sobre as propriedades físico-químicas do sulfato de HCQ no âmbito da tecnologia farmacêutica. O objetivo do presente estudo foi realizar estudo de pré-formulação com o sulfato de HCQ utilizando o conceito de Quality by Desing (QbD), como etapa limitante para o desenvolvimento de formas farmacêuticas. A caracterização da matéria-prima foi realizada através de diferentes técnicas analíticas, a fim de gerar robusta carta de identidade do fármaco. Devido à ausência de monografia específica no compêndio oficial brasileiro, foram desenvolvidos/otimizados dois métodos para doseamento do fármaco: o primeiro, utilizando espectroscopia por absorção na região do ultravioleta, seguido de validação e, o segundo, utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência. Para evidenciar o comportamento térmico do sulfato de HCQ frente a uma mistura dos excipientes, foram utilizadas as técnicas de análise térmica e cálculos dos parâmetros cinéticos. A compatibilidade do fármaco-excipiente foi avaliada através de calorimetria exploratória diferencial, seguida de análises complementares. A etapa inicial de caracterização do sulfato de HCQ forneceu especificações físico-químicas compondo robusta carta de identidade do fármaco, essencial para o desenvolvimento do trabalho. Os métodos analíticos demonstraram-se satisfatórios para todos os critérios preconizados pelas normativas, sendo mais simples rápidos e práticos para a rotina laboratorial. Através da obtenção de cinéticas de degradação dinâmica e isotérmica, a matéria-prima mostrou um prazo de validade estimado de 622 dias, enquanto que a mistura de excipientes avaliada, evidenciou uma interação positiva dos excipientes, sendo observada pelo prolongamento do prazo de validade, estimado em 790 dias. Foi observada incompatibilidade entre o fármaco e o glicolato sódico e a lactose. O presente trabalho apresentou informações relevantes sobre a natureza físico-química do fármaco sulfato de HCQ e forneceu subsídios para desenvolvimento de formas farmacêuticas que o utilizem como insumo farmacêutico ativo. Os resultados foram utilizados na padronização de parâmetros de qualidade para o setor de produção e controle de qualidade de medicamentos.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-04-10T19:15:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Fabiana Licia Araujo dos Santos.pdf: 3305306 bytes, checksum: e915bed6750342cef5b377cd2e10834e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T19:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Fabiana Licia Araujo dos Santos.pdf: 3305306 bytes, checksum: e915bed6750342cef5b377cd2e10834e (MD5) Previous issue date: 2015-05-25 / CNPQ / Associação em Dose Fixa (ADF) é uma combinação de dois ou mais princípios ativos em uma razão fixa de doses em uma mesma forma farmacêutica. Comodidade para o paciente e consequente incremento na adesão ao tratamento são razões aventadas para estimular desenvolvimento de ADF, sendo estas particularmente importantes no tratamento de doenças crônicas. Assim, por associar atividade antiinflamatória, imunomoduladora e antiartritica, Baccharis trimera (Less.) DC. é uma planta promissora para compor uma ADF com o sulfato de hidroxicloroquina (HCQ), como alternativa inovadora para o tratamento da artrite reumatoide. O sulfato de HCQ integra a relação de fármacos recomendados no consenso brasileiro de doenças reumáticas, podendo inclusive ser utilizado durante o período de amamentação. Sendo assim, o objetivo desse estudo é a obtenção de uma forma farmacêutica ADF (cápsulas), utilizando como agentes terapêuticos o extrato seco liofolizado de B. trimera e o fármaco sulfato de HCQ. O extrato foi obtido por infusão e seco por processo de liofilização, apresentando rendimento de 9% (p/p). A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi utilizada no ensaio de doseamento da droga vegetal e do extrato seco. As amostras apresentaram valores de 9 e 0,2 mg.g-1 de ácidos cafeicos, respectivamente. A técnica de termogravimetria (TG) revelou a eficiência do processo de liofilização, uma vez que não foi observado na curva TG do extrato seco o evento de perda de água na faixa de 27-100ºC, presente no perfil da droga vegetal. Em relação às propriedades de fluxo e tamanho de partícula, o extrato liofilizado apresentou-se como um pó fino, de elevada área superficial e presença de mesoporos, com baixa capacidade de fluxo, demonstrando a necessidade da adição de excipientes que possibilitem a utilização do insumo para a obtenção da forma farmacêutica. Na sequência, o sulfato de HCQ foi caracterizado por diversas técnicas, com destaque para a polarimetria, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Difração de raios-X (DRX), comprovando a proporção equimolar dos isômeros da HCQ na mistura racêmica e a existência de cristais de tamanhos irregulares com formatos predominantemente hexagonais. A partir de um estudo de planejamento fatorial, otimizou-se o método analítico para doseamento do sulfato de HCQ por CLAE, com base na metodologia descrita na Farmacopeia Americana. O novo método provou ser mais rápido e mais eficiente em relação ao método de referência, por promover redução no tempo de retenção e redução no fluxo da fase móvel. Além disso, o método permitiu a quantificação do sulfato de HCQ a partir de um pico de alta resolução, apresentando valor de 1,087 para o fator de cauda, assegurando uma quantificação precisa da matéria-prima enquanto mistura racêmica. Através da obtenção de cinéticas de degradação dinâmica e isotérmica, o sulfato de HCQ revelou um prazo de validade estimado de 622 dias. A compatibilidade do fármaco-excipiente foi avaliada através de calorimetria exploratória diferencial (DSC), seguida de análises complementares, evidenciando incompatibilidade do fármaco com o glicolato de amido sódico e com a lactose. Diante de todos os dados obtidos durante os estudos de pré-formulação, foi possível desenvolver uma forma farmacêutica ADF que apresentou boas propriedades de fluxo e baixo teor de umidade, situação ideal para manter a estabilidade de formulações que contém extrato de origem vegetal. Esse produto inovador pode surgir como um alívio ao desconforto do paciente que muitas vezes utiliza diferentes classes de medicamentos para o controle de doenças crônicas, como a artrite reumatoide. / Fixed-dose combination (FDC) is an association of two or more active ingredients in a fixed ratio of doses in the same pharmaceutical form. Convenience for the patient and consequent increase in treatment adherence are reasons to stimulate development of FDC, which are particularly important in the treatment of chronic diseases. Thus, by associating anti-inflammatory, immunomodulatory and anti-arthritic activity, Baccharis trimera (Less.) DC is a promising plant to compose a FDC with hydroxychloroquine (HCQ ) sulfate, as an innovative alternative for the treatment of rheumatoid arthritis. The HCQ sulfate integrates the list of drugs recommended in the Brazilian consensus of rheumatic diseases, and it can even be used during breastfeeding. Therefore, the aim of this study is to obtain a pharmaceutical form (capsules) of a FDC, using as therapeutic agents the dry extract of B. trimera and the drug HCQ sulfate. The extract was obtained by infusion and dried by lyophilization process, with yield of 9% (w / w). The high-performance liquid chromatography (HPLC) was used in the assay of the herbal drug and its dry extract. The samples exhibited values of 9 and 0.2 mg.g-1 of cafeic acids, respectively. The thermogravimetry (TG) showed the efficiency of the lyophilization process, since it was not observed in the TG curve of the dry extract a water loss event from 27 to 100°C that is present in the herbal drug profile. Whereas flow properties and particle size, the lyophilized extract was characterized as a fine powder with a high surface area and the presence of mesopores, with low flowability, demonstrating the need for the addition of excipients that enable its use as an active pharmaceutical ingredient to obtaining the pharmaceutical form. Further, the HCQ sulfate was characterized by several techniques, especially polarimetry, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-ray Diffraction (XRD), proving the equimolar ratio of the isomers of HCQ in the racemic mixture and the existence of irregular crystal sizes predominantly in hexagonal shapes. The analytical method for determination of HCQ sulfate by HPLC was also optimized using factorial design. The new method has proved to be faster and more efficient compared to the reference method described at United States Pharmacopeia, by promoting a reduction in the retention time and reducing the flow of mobile phase. Furthermore, the method allows the quantification of HCQ sulfate from a peak of high resolution, presenting value of 1.087 for the tailing factor, assuring a precise quantification of the raw material as the racemic mixture. By obtaining dynamic and isothermal kinetics of degradation, HCQ sulfate revealed an estimated shelf life of 622 days. The drug-excipient compatibility was evaluated by differential scanning calorimetry (DSC), followed by complementary tests, highlighting drug incompatibility with sodium starch glycolate and lactose. Considering all the data obtained during the pre-formulation studies, it was possible to develop a FDC pharmaceutical dosage form which showed good flow properties and low moisture content, ideal situation to maintain the stability of formulations containing herbal extract. This innovative product may come as a relief to the discomfort of the patient who often uses different classes of drugs for the control of chronic diseases such as rheumatoid arthritis.

Objetivos: Estimar la mortalidad relacionada a hidroxicloroquina y azitromicina en pacientes con COVID-19 en ventilación mecánica de una unidad de cuidados intensivos. Material y métodos: Cohorte analítica retrospectiva. Se incluyeron 105 pacientes con COVID-19 en ventilación mecánica invasiva que ingresaron con el diagnóstico de Insuficiencia Respiratoria Aguda a la unidad de cuidados intensivos del Hospital Cayetano Heredia durante el año 2020. Resultados: La mortalidad global fue 38%; el 79% fueron varones, la edad media fue 50±13 años, el 65% no tuvo comorbilidades; al ingreso la puntuación en la escala APACHE II fue 12±6 puntos y en la escala SOFA 5±3 puntos; el 30% recibió hidroxicloroquina, el 32% azitromicina y 32% la combinación de los mismos. La mortalidad fue significativamente mayor en pacientes que recibieron hidroxicloroquina (p=0.00), azitromicina (p=0.03), y la combinación hidroxicloroquina más azitromicina (p=0.001). Conclusiones: La mortalidad en los pacientes con COVID–19 en ventilación mecánica invasiva fue significadamente mayor en pacientes que recibieron hidroxicloroquina, azitromicina o la combinación de ambos. / Objective: To estimate mortality rates associated with hydroxichloroquine and azithromycin use in Covid-19 patients undergoing mechanical ventilation in an intensive care unit in Lima. Material and methods: This is a retrospective analytical cohort. One hundred and five patients with Covid-19 undergoing invasive mechanical ventilation who were admitted with a diagnosis of acute respiratory insufficiency to the intensive care unit of Cayetano Heredia Hospital in Lima during 2020. Results: The overall mortality rate was 38%. Most patients (79%) were male, their mean age was 50 ± 13 years, two thirds (65%) did not have comorbidities; APACHE II and SOFA scores were 12 ± 6 points and 5 ± 3 points, respectively. Thirty percent of all patients received hydroxichloroquine, 32% received azithromycin, and 32% received both drugs. Mortality was significantly higher in those patients who received hydroxichloroquine (p= 0.001), azithromycin (p= 0.03), and the combination of hydroxichloroquine and azithromycin (p= 0.001). However, when a Cox regression analysis was performed, it was evidenced that deceased patients were more likely to have been exposed to hydroxichloroquine (p= 0.001) (HR: 21, CI: 3.4-131.3), but this was not the case with azithromycin (p= 0.22) (HR: 0.43, CI: 0.11-1.6). Conclusion: Mortality in Covid-19 patients undergoing invasive mechanical ventilation was higher in those who received hydroxichloroquine.

Submitted by TULIO MORANDIN FERRISSE null (tuliomferrisse@gmail.com) on 2016-05-30T18:50:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - FINAL.doc: 8888832 bytes, checksum: ca99c5983969f9477ae1a74714d6d280 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-31T17:11:40Z (GMT) / Submitted by TULIO MORANDIN FERRISSE null (tuliomferrisse@gmail.com) on 2016-06-02T18:27:31Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO - FINAL.doc: 8888832 bytes, checksum: ca99c5983969f9477ae1a74714d6d280 (MD5) DISSERTAÇÃO_Mestrado_24_05_2016.pdf: 2063661 bytes, checksum: 945e0429ad165f9d8b64a9f65b91534a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-02T19:56:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferrisse_tm_me_arafo.pdf: 2063661 bytes, checksum: 945e0429ad165f9d8b64a9f65b91534a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferrisse_tm_me_arafo.pdf: 2063661 bytes, checksum: 945e0429ad165f9d8b64a9f65b91534a (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O conceito de reação liquenóide ou interface liquenóide foi introduzido na dermatologia para definir diversas doenças inflamatórias da pele que apresentam características histopatológicas similares. Assim como a pele, a mucosa oral é afetada por uma variedade de lesões liquenóides orais (LLOs). As LLOs foram classificadas em: lesão liquenóide de contato; lesão liquenóide a medicamento; doença do enxerto-versus-hospedeiro e lesões liquenóides não classificáveis de aspecto liquen plano-like, como a estomatite ulcerativa crônica (EUC) recentemente descrita. Além da sobreposição de características entres as lesões que compõem este grupo, o líquen plano oral (LPO) representa o principal diagnóstico diferencial. Tradicionalmente, o diagnóstico das LLOs e do LPO depende da associação clínica e histopatológica, mas em vários casos, esta abordagem não oferece um diagnóstico confiável. As realizações de estudos clínicos e laboratoriais podem auxiliar no entendimento da etiopatogenia destas doenças e refinar a capacidade de diferenciar as LLOs. Diante disto, os objetivos específicos deste estudo foram: (1) Realizar uma revisão sistemática sobre EUC com ênfase específica nas características clínicas, histopatológicas e imunopatológicas desta condição recentemente descrita; e (2) Realizar um estudo prospectivo para avaliar as características clínicas e histopatológicas das LLOs. / The concept of lichenoid reaction or lichenoid interface was introduced in dermatology to define various inflammatory diseases of the skin that have similar histopathological features. Just as the skin and oral mucosa is affected by a variety of oral lichenoid lesions (OLLs). OLLs were classified as contact Lichenoides injury; drug Lichenoides injury; chronic graft versus host and not classifiable lichenoid lesions aspect lichen planus-like, such as chronic ulcerative stomatitis (CUS) recently described. Besides the overlapping features among injuries that make up this group, oral lichen planus (OLP) is the main differential diagnosis. Traditionally, the diagnosis of OLLs and the OLP depends on the clinical and histopathological association, but in many cases, this approach does not provide a confident diagnosis. The achievement of clinical and laboratory studies may help to understand the pathogenesis of these diseases and refine the ability to differentiate OLLs. Thus, the specific objectives of this study were: (1) conduct a systematic review of CUS with particular emphasis on clinical, histopathological and immunopathological of this newly described condition; and (2) Conducting a prospective study to evaluate the clinical and histopathological characteristics of OLLs.

Actualmente nos encontramos en una pandemia mundial causada por el coronavirus 2019 o COVID–19, presentando diferentes desafíos para el sistema de salud debido a que no se cuenta aún con alguna vacuna ni con un tratamiento que haya demostrado su eficacia en totalidad, siendo el manejo actual preventivo y de soporte. Por lo que, en esta revisión se estudiará a los fármacos antirreumáticos más resaltantes que tengan un probable efecto farmacológico, como son la hidroxicloroquina, el tocilizumab, el anakinra y el baricitinib, frente al COVID–19. Se espera que brinde apoyo para futuros tratamientos e investigaciones sobre la enfermedad. / We are currently in a global pandemic caused by the coronavirus 2019 or COVID- 19, presenting different challenges for the health system due to the fact that there is still no vaccine or a treatment that has proven its effectiveness in its entirety, being the management current preventive and supportive. Therefore, this review will study the most prominent antirheumatic drugs that have a probable pharmacological effect, such as hydroxychloroquine, tocilizumab, anakinra and baricitinib, against COVID-19. It is expected that they will provide support for future treatments. and research on the disease.

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: O conceito de reação liquenóide ou interface liquenóide foi introduzido na dermatologia para definir diversas doenças inflamatórias da pele que apresentam características histopatológicas similares. Assim como a pele, a mucosa oral é afetada por uma variedade de lesões liquenóides orais (LLOs). As LLOs foram classificadas em: lesão liquenóide de contato; lesão liquenóide a medicamento; doença do enxerto-versus-hospedeiro e lesões liquenóides não classificáveis de aspecto liquen plano-like, como a estomatite ulcerativa crônica (EUC) recentemente descrita. Além da sobreposição de características entres as lesões que compõem este grupo, o líquen plano oral (LPO) representa o principal diagnóstico diferencial. Tradicionalmente, o diagnóstico das LLOs e do LPO depende da associação clínica e histopatológica, mas em vários casos, esta abordagem não oferece um diagnóstico confiável. As realizações de estudos clínicos e laboratoriais podem auxiliar no entendimento da etiopatogenia destas doenças e refinar a capacidade de diferenciar as LLOs. Diante disto, os objetivos específicos deste estudo foram: (1) Realizar uma revisão sistemática sobre EUC com ênfase específica nas características clínicas, histopatológicas e imunopatológicas desta condição recentemente descrita; e (2) Realizar um estudo prospectivo para avaliar as características clínicas e histopatológicas das LLOs. / Abstract: The concept of lichenoid reaction or lichenoid interface was introduced indermatology to define various inflammatory diseases of the skin that have similarhistopathological features. Just as the skin and oral mucosa is affected by a variety oforal lichenoid lesions (OLLs). OLLs were classified as contact Lichenoides injury;drug Lichenoides injury; chronic graft versus host and not classifiable lichenoidlesions aspect lichen planus-like, such as chronic ulcerative stomatitis (CUS) recentlydescribed. Besides the overlapping features among injuries that make up this group,oral lichen planus (OLP) is the main differential diagnosis. Traditionally, the diagnosisof OLLs and the OLP depends on the clinical and histopathological association, butin many cases, this approach does not provide a confident diagnosis. Theachievement of clinical and laboratory studies may help to understand thepathogenesis of these diseases and refine the ability to differentiate OLLs. Thus, thespecific objectives of this study were: (1) conduct a systematic review of CUS withparticular emphasis on clinical, histopathological and immunopathological of thisnewly described condition; and (2) Conducting a prospective study to evaluate theclinical and histopathological characteristics of OLLs. / Mestre

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A hidroxicloroquina (HCQ) é um importante fármaco quiral usado, principalmente, no tratamento de artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico e malária e cujas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas são estereosseletivas. Em relação às propriedades farmacocinéticas, alguns estudos prévios indicam que o metabolismo estereosseletivo parece ser função da espécie estudada, o que implica na necessidade de métodos seletivos para a determinação de seus enantiômeros em materiais biológicos. Assim, propôs-se o desenvolvimento e a validação de métodos para análise dos enantiômeros do fármaco inalterado e de seus principais metabólitos em frações microssomais de homogeneizados de fígado de ratos e camundongos. Para tanto foram empregadas as técnicas de eletroforese capilar (CE) e de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Inicialmente foi desenvolvido um método por HPLC, em uma etapa, para a quantificação dos enantiômeros de dois metabólitos da HCQ, desetilcloroquina (DCQ) e desetilhidroxicloroquina (DHCQ) em microssomas de fígado de ratos e camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se a coluna Chiralpak AD-RH e hexano:isopropanol (92:8, v/v) acrescido de 0,1% de dietilamina como fase móvel. O procedimento de extração líquido-líquido foi utilizado para a preparação das amostras. A metodologia desenvolvida resultou na completa resolução dos enantiômeros da HCQ, DCQ e DHCQ e pode ser considerada adequada, visto que os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. O segundo método desenvolvido permitiu a quantificação dos enantiômeros dos três metabólitos da HCQ: DCQ, DHCQ e bisdesetilcloroquina (BDCQ) em microssomas de fígado de camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se um tubo capilar de sílica fundida e solução do eletrólito tris(hidroximetil)aminometano 100 mmol/L, ajustada a pH 9,0 com ácido fosfórico e acrescida de 1% (m/v) de β –CD - sulfatada e 30 mmol/L de β –CD - hidroxipropilada. O procedimento de extração líquido-líquido foi eficiente para remover interferentes e os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. Os métodos desenvolvidos foram aplicados no estudo in vitro do metabolismo da HCQ em frações microssomais de fígado dos animais, verificando-se que o principal metabólito formado é o (-)-(R)-DHCQ, para ambas espécies estudadas. / Hydroxychloroquine (HCQ) is an important chiral drug used specially in the treatment of rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and malaria, with stereoselective pharmacokinetic and pharmacodinamic properties. Concerning these properties, some previous studies indicate that the stereoselective metabolism seems to be a function of the studied species, therefore selective methods are required for the determination of its enantiomers in biological matrix. Thus, the present work reports the development and validation of methods for the analysis of the enantiomers of HCQ and its main metabolites in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. Capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used for this purpose. Initially, a one-step HPLC method was developed for the quantification of the enantiomers of two HCQ metabolites, desethylchloroquine (DCQ) and desethylhydroxychloroquine (DHCQ) in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. The separation was performed on a Chiralpak AD-RH column using hexane:isopropanol (92:8, v/v) plus 0.1% diethylamine as the mobile phase. Liquid-liquid extraction procedure was used for sample preparation. The developed methodology resulted in the complete resolution of HCQ, DCQ and DHCQ enantiomers and can be considered suitable because the validation parameters are in accordance with the limits established in the literature. The second developed method allowed the quantification of the enantiomers of the three HCQ metabolites, DCQ, DHCQ and bisdesethylchloroquine (BDCQ) in microsomal fraction of mice liver homogenates. The separation was performed using a fused-silica capillary tube and tris (hydroxymethyl) aminometane 100 mmol/L electrolyte solution, adjusted at pH 9.0 with phosphoric acid, containing 1% (w/v) sulfated- β -CD and 30 mmol/L hydroxypropyl- β -CD. The liquid-liquid extraction procedure was efficient to remove interferents and the validation parameters showed values within accordance to the literature. The developed methods were applied in the in vitro metabolism study of HCQ in microsomal fractions of the liver of the animals and it was verified that the main metabolite formed is (-)-(R)-DHCQ for both animal species studied.

A hidroxicloroquina (HCQ) é um importante fármaco quiral usado, principalmente, no tratamento de artrite reumatóide, lupus eritematoso sistêmico e malária e cujas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas são estereosseletivas. Em relação às propriedades farmacocinéticas, alguns estudos prévios indicam que o metabolismo estereosseletivo parece ser função da espécie estudada, o que implica na necessidade de métodos seletivos para a determinação de seus enantiômeros em materiais biológicos. Assim, propôs-se o desenvolvimento e a validação de métodos para análise dos enantiômeros do fármaco inalterado e de seus principais metabólitos em frações microssomais de homogeneizados de fígado de ratos e camundongos. Para tanto foram empregadas as técnicas de eletroforese capilar (CE) e de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Inicialmente foi desenvolvido um método por HPLC, em uma etapa, para a quantificação dos enantiômeros de dois metabólitos da HCQ, desetilcloroquina (DCQ) e desetilhidroxicloroquina (DHCQ) em microssomas de fígado de ratos e camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se a coluna Chiralpak AD-RH e hexano:isopropanol (92:8, v/v) acrescido de 0,1% de dietilamina como fase móvel. O procedimento de extração líquido-líquido foi utilizado para a preparação das amostras. A metodologia desenvolvida resultou na completa resolução dos enantiômeros da HCQ, DCQ e DHCQ e pode ser considerada adequada, visto que os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. O segundo método desenvolvido permitiu a quantificação dos enantiômeros dos três metabólitos da HCQ: DCQ, DHCQ e bisdesetilcloroquina (BDCQ) em microssomas de fígado de camundongos. A separação foi efetuada utilizando-se um tubo capilar de sílica fundida e solução do eletrólito tris(hidroximetil)aminometano 100 mmol/L, ajustada a pH 9,0 com ácido fosfórico e acrescida de 1% (m/v) de β –CD - sulfatada e 30 mmol/L de β –CD - hidroxipropilada. O procedimento de extração líquido-líquido foi eficiente para remover interferentes e os parâmetros de validação mostraram valores dentro dos limites exigidos na literatura. Os métodos desenvolvidos foram aplicados no estudo in vitro do metabolismo da HCQ em frações microssomais de fígado dos animais, verificando-se que o principal metabólito formado é o (-)-(R)-DHCQ, para ambas espécies estudadas. / Hydroxychloroquine (HCQ) is an important chiral drug used specially in the treatment of rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and malaria, with stereoselective pharmacokinetic and pharmacodinamic properties. Concerning these properties, some previous studies indicate that the stereoselective metabolism seems to be a function of the studied species, therefore selective methods are required for the determination of its enantiomers in biological matrix. Thus, the present work reports the development and validation of methods for the analysis of the enantiomers of HCQ and its main metabolites in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. Capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used for this purpose. Initially, a one-step HPLC method was developed for the quantification of the enantiomers of two HCQ metabolites, desethylchloroquine (DCQ) and desethylhydroxychloroquine (DHCQ) in microsomal fraction of rats and mice liver homogenates. The separation was performed on a Chiralpak AD-RH column using hexane:isopropanol (92:8, v/v) plus 0.1% diethylamine as the mobile phase. Liquid-liquid extraction procedure was used for sample preparation. The developed methodology resulted in the complete resolution of HCQ, DCQ and DHCQ enantiomers and can be considered suitable because the validation parameters are in accordance with the limits established in the literature. The second developed method allowed the quantification of the enantiomers of the three HCQ metabolites, DCQ, DHCQ and bisdesethylchloroquine (BDCQ) in microsomal fraction of mice liver homogenates. The separation was performed using a fused-silica capillary tube and tris (hydroxymethyl) aminometane 100 mmol/L electrolyte solution, adjusted at pH 9.0 with phosphoric acid, containing 1% (w/v) sulfated- β -CD and 30 mmol/L hydroxypropyl- β -CD. The liquid-liquid extraction procedure was efficient to remove interferents and the validation parameters showed values within accordance to the literature. The developed methods were applied in the in vitro metabolism study of HCQ in microsomal fractions of the liver of the animals and it was verified that the main metabolite formed is (-)-(R)-DHCQ for both animal species studied.

Submitted by Nathalya Silva (nathyjf033@gmail.com) on 2017-05-30T15:33:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AcaoHidroxicloroquinaNeuronios.pdf: 1481946 bytes, checksum: a9d07b8a4773b23720d1d74dd905cc64 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-06-06T21:33:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AcaoHidroxicloroquinaNeuronios.pdf: 1481946 bytes, checksum: a9d07b8a4773b23720d1d74dd905cc64 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T21:33:02Z (GMT). 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Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do fármaco HCQ sobre células da retina, bem como seus possíveis mecanismos de citotoxicidade. Como modelo de estudo, utilizamos culturas de células da retina de embrião de galinha. Para avaliar a viabilidade celular foi usado o ensaio de medida de atividade mitocondrial por MTT. A função lisossomal foi avaliada pela taxa de incorporação do corante vermelho neutro. Os níveis de espécies reativas de oxigênio geral e de ânion superóxido foram avaliados pela sonda CellROX e por Nitro Blue Tetrazolium (NBT), e os níveis de glutationa total foram quantificados usando o reagente de Ellman. A viabilidade foi testada em culturas mistas (glia e neurônios), ou culturas enriquecidas com neurônios ou glia, após tratamento com HCQ. Para comparação foi utilizado a cloroquina (CQ), fármaco da qual a HCQ é derivada. As células foram expostas às concentrações de 25μM, 50μM e 75μM por 24 horas. Os resultados demostram que culturas mistas tratadas com CQ apresentaram redução na viabilidade de 36 e 61% para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente, enquanto HCQ não altera a viabilidade em nenhuma das concentrações testadas. No entanto, quando culturas enriquecidas com células gliais foram expostas a HCQ por 24 horas, a concentração de 75μM teve uma pequena redução na viabilidade das células, sendo as reduções nas células neuronais mais acentuadas, 20, 33 e 56% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM, respectivamente. Mesmo um tempo menor de tratamento (6 horas) causou perda de viabilidade em neurônios retinianos. A capacidade de incorporação do corante supravital vermelho neutro, também foi alterada em culturas neuronais tratadas com HCQ por 24 horas, tendo redução de 19 e 32%, comparadas ao controle, para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente. HCQ reduziu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio produzidas pelas células neuronais, principalmente ânion superóxido, 43, 52 e 61% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM de HCQ em 24 horas de tratamento, respectivamente. Os níveis de glutationa total em células neuronais apresentaram redução de 37 e 53% quando tratados com 50μM e 75μM de HCQ por 24 horas, respectivamente, comparado ao controle. Quando o meio condicionado de células gliais foi utilizado em células neuronais tratadas com HCQ por 6 horas, este reverteu completamente o processo de citotoxicidade causado pelo fármaco. E quando os níveis de glutationa total foram mensurados em culturas enriquecidas com glia, tratadas com HCQ por 24 horas, não foram observadas quaisquer alterações. Estes resultados sugerem ação citotóxica de CQ em cultura mista de células da retina de embrião de galinha, o que não é observado no tratamento com HCQ. Entretanto, HCQ mostrou ação citotóxica quando as células são cultivadas separadamente, principalmente sobre neurônios, que é revertida por algum fator liberado pelas células gliais no ambiente extracelular, sendo a glutationa uma possível candidata a exercer essa função neuroprotetora. / Hydroxychloroquine (HCQ) is currently used in the treatment of malaria and autoimmune diseases and others therapeutic purposes. However, this drug is known to cause side effects, including producing visual disturbances, which may be irreversible. The mechanisms that produce these visual disorders are not completely known. HCQ - related retinal toxicity may be due to high metabolic rate, being very susceptible to the action of xenobiotics and oxidative damages. Thus, this work aims to evaluate the effects of the HCQ on retinal cells, as well as their possible mechanisms of cytotoxicity. The model used in this work was of cultures of retina cells from chicken embryo. To evaluate cell viability, mitochondrial activity was measured by MTT. The lysosomal function was evaluated by the incorporation rate of the neutral red dye. The levels of reactive species of general oxygen and superoxide anion were evaluated by the CellROX probe and by Nitro Blue Tetrazolium (NBT) and total glutathione levels were quantified using the Ellman reagent. Viability was tested in mixed cultures (glia and neurons) or enriched cultures of neurons and glia after treatment with HCQ and compared with chloroquine (CQ). Cells were exposed to concentrations of 25μM, 50μM and 75μM for 24 hours. The results show that mixed cultures treated with CQ presented a reduction in viability of 36 and 61% at concentrations of 50μM and 75μM, respectively, whereas HCQ did not alter viability at any of the concentrations tested. However, when cultures enriched with glial cells were exposed to HCQ for 24 hours, the concentration of 75μM had a small reduction in cell viability, while that the reduction in neuronal cells was of 20, 33 and 56% at the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM, respectively. Even a shorter treatment time (6 hours) there was loss of viability in retinal neurons. The incorporation of neutral red supravital dye was also altered in neuronal cultures treated with HCQ for 24 hours, with reduction of 19 and 32%, compared to the control for the concentrations of 50μM and 75μM, respectively. HCQ significantly reduced the levels of reactive oxygen species produced by the neuronal cells, mainly superoxide anion, 43, 52 and 61% for the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM of HCQ in 24 hours of treatment, respectively. In concentrations of 50μM and 75μM of HCQ for 24 for hours, the levels of total glutathione in neuronal cells presented a reduction of 37 and 53%, respectively. When the glial cell conditioned medium was used in neuronal cells for 6 hours after treatment with HCQ, it completely reversed the drug-induced cytotoxicity. When total glutathione levels were measured in culture of glia treated with HCQ for 24 hours no changes were observed. These results suggest cytotoxic action of CQ in mixed culture of chicken embryo retina cells which is not observed in HCQ treatment. However, HCQ showed cytotoxic action when cells are cultured separately, mainly on neurons, which is reversed by some factor released by glial cells in the extracellular environment, and glutathione is a possible candidate to exert this neuroprotective function.