Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T19:54:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gaspari_PriscylaDanielyMarcato_M.pdf: 3916509 bytes, checksum: 15b4d148bf7fb5ebc6d8b40b2108c914 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O projeto consistiu na preparação e caracterização de sistemas de liberação sustentada veiculando a estreptomicina, um agente antimicobacteriano. A estreptomicina (STM) foi encapsulada em micropartículas poliméricas preparadas a partir do polímero biodegradável poli(e-caprolactona) (PCL) e do copolímero biodegradável poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), pela técnica de emulsificação seguida da evaporação do solvente. Estas partículas foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio e distribuição de tamanho, morfologia, Potencial Zeta e eficiência de encapsulamento. Micropartículas de PCL e PHBV foram obtidas pelo método de dupla emulsão e evaporação de solvente com diferentes morfologias, sendo que as partículas de PCL apresentaram superfície mais lisa do que as de PHBV. Além disto, a adição do co-solvente acetona na fase orgânica, provocou a formação de micropartículas de PHBV maiores e mais porosas. Alterações em parâmetros da preparação como, aumento da concentração do tensoativo, evaporação de solvente a baixa pressão e uso de polímero com menor massa molar foram fatores que reduziram do diâmetro das partículas. A eficiência de encapsulamento nas micropartículas de PHBV, medida por eletroforese capilar, foi de 43 ± 4 %. No ensaio biológico in vitro em células V- 79 (células de fibroblastos de pulmão derivadas de hamsters chineses), hepatócitos e Vero (células do rim de macaco) foi verificada baixa toxicidade do antibiótico estreptomicina nos alvos celulares avaliados (captura do corante vermelho neutro, conteúdo de ácidos nucléicos e redução do corante metiltiazoletetrazolium). Entretanto, as micropartículas de PHBV com e sem fármaco apresentaram alteração no lisossoma, que pode ter sido causada pela presença de PVA na superfície das partículas. A atividade antimicrobiana da estreptomicina livre e encapsulada frente à Escherichia coli foi verificada, obtendo menor eficiência do fármaco encapsulado em relação ao fármaco livre. Entretanto, nos testes frente à Streptococcus lentus, foi verificada maior eficiência quando o fármaco estava encapsulado. / Abstract: This research was related to the preparation and characterization of a sustained release system with streptomycin, an antimycobacterial agent. The streptomycin (STM) was encapsulated in polymeric micro and nanopartículas from the biodegradable polymers, poli(e-caprolactona) (PCL) and of the biodegradable copolymers, poli(3-hydroxybutirate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV), by double emulsion and solvent evaporation method. These particles were characterized in function of the size and size distribution, morphology, Potential Zeta and encapsulation efficiency. PCL and PHBV microparticles that were obtained by described methods, PCL presented surface smoother than the PHBV microparticles. Moreover, the addiction of the co-solvent acetone in the organic phase provoked the formation of PHBV microparticles larger and more porous than in PCL. Alterations in preparation parameters such as increase of the surfactant concentration, solvent evaporation in low pressure and a decrease molar mass were factors that reduced the particle sizes. The encapsulation efficiency in microparticles of PHBV, measured by capillary electrophoresis, it was 43 ± 4.4%. In the in vitro biological assay in V-79 cells (permanent lung fibroblasts cell line derived from Chinese hamsters), hepatocytes and Vero cells (from monkey kidney) was verified low toxicity of the streptomycin in the endpoints targets (neutral red uptake, nucleic acid content and tetrazolium reduction). However, microparticles of PHBV with and without drug demonstrated an alteration in the lysosome that it could have been caused by the presence of poly vinylic alcohol (PVA) in the particles surfaces. The antimicrobial activity of free and encapsulated streptomycin against Escherichia coli was demonstrated. A smaller efficiency of encapsulated drug than the free one was found. However, in the tests against Streptococcus lentus was verified larger efficiency of the free drug than the encapsulated one. / Mestrado / Físico-Química / Mestre em Química

Este trabalho propõe estudos sobre a caracterização do comportamento térmico dos aminoglicosídeos estreptomicina e tobramicina, que são antibióticos bactericidas, utilizados no combate a microorganismos patogênicos, que agem interrompendo a síntese de proteínas. Após a caracterização espectroscópica dos analitos, foram realizadas medidas termogravimétricas, em atmosfera de ar e nitrogênio, que possibilitaram a determinação da estabilidade térmica do fármaco e o reconhecimento das etapas de decomposição. A calorimetria exploratória diferencial forneceu informações a respeito de processos físicos com variação de entalpia. Os gases envolvidos foram analisados usando termogravimetria acoplada à espectroscopia vibracional na região do infravermelho (TG-FTIR), possibilitando a proposta de um mecanismo para sua decomposição térmica. Intermediários de decomposição térmica foram caracterizados por CG-MS e o conjunto de todas essas informações forneceu um possível mecanismo para o comportamento térmico dessas drogas. Também foi sintetizado, caracterizado e analisado por TG, DSC e TG-FTIR, o complexo de tobramicina com o íon Cu+2. / A study regarding the thermal behavior characterization of the aminoglycosides streptomycin and tobramycin which are bactericidal antibiotics is presented. These antibiotics are widely against pathogenic microorganisms and act by interrupting the synthesis of proteins. Thermogravimetric measurements were performed under air and nitrogen conditions. To evaluate thermal stability of the drugs and their decomposition steps. A differential scanning calorimetry provided information on physical processes with enthalpy change. Evolved gas analysis was performed using thermogravimetry coupled to infrared spectroscopy (TG-FTIR), and was used to characterize the gases released during the thermal heating of the samples. Decomposition intermediates were characterized by CG-MS and the set of all these resultsallowed the proposition of a mechanism for the thermal behavior of drugs. The complex of tobramycin with the Cu+2 ion was also synthesized, characterized and analyzed by TG, DSC and TG-FTIR.

Este trabalho propõe estudos sobre a caracterização do comportamento térmico dos aminoglicosídeos estreptomicina e tobramicina, que são antibióticos bactericidas, utilizados no combate a microorganismos patogênicos, que agem interrompendo a síntese de proteínas. Após a caracterização espectroscópica dos analitos, foram realizadas medidas termogravimétricas, em atmosfera de ar e nitrogênio, que possibilitaram a determinação da estabilidade térmica do fármaco e o reconhecimento das etapas de decomposição. A calorimetria exploratória diferencial forneceu informações a respeito de processos físicos com variação de entalpia. Os gases envolvidos foram analisados usando termogravimetria acoplada à espectroscopia vibracional na região do infravermelho (TG-FTIR), possibilitando a proposta de um mecanismo para sua decomposição térmica. Intermediários de decomposição térmica foram caracterizados por CG-MS e o conjunto de todas essas informações forneceu um possível mecanismo para o comportamento térmico dessas drogas. Também foi sintetizado, caracterizado e analisado por TG, DSC e TG-FTIR, o complexo de tobramicina com o íon Cu+2. / A study regarding the thermal behavior characterization of the aminoglycosides streptomycin and tobramycin which are bactericidal antibiotics is presented. These antibiotics are widely against pathogenic microorganisms and act by interrupting the synthesis of proteins. Thermogravimetric measurements were performed under air and nitrogen conditions. To evaluate thermal stability of the drugs and their decomposition steps. A differential scanning calorimetry provided information on physical processes with enthalpy change. Evolved gas analysis was performed using thermogravimetry coupled to infrared spectroscopy (TG-FTIR), and was used to characterize the gases released during the thermal heating of the samples. Decomposition intermediates were characterized by CG-MS and the set of all these resultsallowed the proposition of a mechanism for the thermal behavior of drugs. The complex of tobramycin with the Cu+2 ion was also synthesized, characterized and analyzed by TG, DSC and TG-FTIR.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-04-03T22:31:54Z No. of bitstreams: 1 JessicaDeFatimaVianna_DISSERT.pdf: 3724208 bytes, checksum: f7d62fbcd54bf6b212f2003b461810c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-04-11T18:14:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JessicaDeFatimaVianna_DISSERT.pdf: 3724208 bytes, checksum: f7d62fbcd54bf6b212f2003b461810c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T18:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JessicaDeFatimaVianna_DISSERT.pdf: 3724208 bytes, checksum: f7d62fbcd54bf6b212f2003b461810c5 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A tuberculose ? uma doen?a bacteriana provocada pelo Mycobacterium tuberculosis, e de acordo com a Organiza??o Mundial de Sa?de, apenas em 2015 foram 10,4 milh?es de novos casos relatados e 1,4 milh?o de mortes. Cresce o n?mero de casos de pacientes infectados com cepas resistentes aos antimicrobianos mais comumente utilizados, fazendo-se necess?rio uso de drogas de segunda-linha. A capreomicina e a estreptomicina encaixam-se nesse grupo, e s?o antibi?ticos que possuem como mecanismo de atua??o a inibi??o da s?ntese proteica. Entretanto, seus mecanismos de liga??o em seus s?tios s?o distintos: a capreomicina ? capaz de se ligar a ambas subunidades ribossomais (30S e 50S), enquanto que a estreptomicina liga-se ? subunidade ribossomal menor (30S), e interage com alguns pontos da prote?na S12. Atrav?s de dados cristalogr?ficos e simula??es computacionais, foi calculada a energia de intera??o da capreomicina e da estreptomicina com cada um dos res?duos constituintes de seus s?tios utilizando a Teoria Funcional da Densidade (DFT) e do M?todo de Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC). Os resultados revelaram valores energ?ticos de cada nucleot?deo pertencente ao s?tio de liga??o desses dois medicamentos, como tamb?m dos amino?cidos da prote?na S12 com os quais a estreptomicina interage. Assim, para a capreomicina na subunidade 30S, foram avaliados res?duos presentes em um raio de at? 14 ? distantes do f?rmaco, totalizando 44 res?duos; e na subunidade 50S, 30 nucleot?deos foram analisados, e estavam distribu?dos at? o raio de 30 ? de dist?ncia. Com a estreptomicina foram levados em considera??o 60 nucleot?deos distribu?dos at? 12,5 ? de dist?ncia da droga na subunidade 30S, e 25 amino?cidos da prote?na S12 com at? 15 ? de dist?ncia. Identificamos tamb?m as contribui??es das liga??es de hidrog?nio e das intera??es hidrof?bicas nas intera??es f?rmaco-receptor; as regi?es dos f?rmacos que mais contribu?ram para as fixa??es desses em seus s?tios de liga??o; como tamb?m a identifica??o dos res?duos que s?o mais associados ?s muta??es e consequente resist?ncia. / Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis, and according to the World Health Organization, only in 2015 occurred 10.4 million new cases reported and 1.4 million deaths. The number of cases of patients infected with antimicrobial resistant strains most used is increasing, requiring the use of second-line drugs. Capreomycin and streptomycin are part of the group, and are antibiotics whose mechanism of action is the inhibition of protein synthesis. However, its binding mechanisms in their sites are distinct: capreomycin is able to bind to both ribosomal (30S and 50S) subunits, whereas streptomycin binds to the smaller ribosomal subunit (30S), and interacts with some points of S12 protein. Through crystallographic data and computational simulations, we calculated the interaction energy of capreomycin and streptomycin with each of the residues component of their sites using the Density Functional Theory (DFT) and Molecular Fractionation with Conjugated Caps (MFCC). The results showed energy values of each nucleotide belonging to binding site of these two drugs, as well as the amino acids of the S12 protein with which streptomycin interacts. Thus, for capreomycin in the 30S subunit, residues present in a radius of up to 14 ? distant from the drug, totaling 44 residues; and in the 50S subunit, 30 nucleotides were analyzed, and were distributed up to the 30? radius distance. Regarding streptomycin, 60 nucleotides distributed up to 12.5 ? away from the drug in the 30S subunit, and 25 amino acids of the S12 protein with up to 15 ? were taken into account. We also identify the contributions of hydrogen bonds and hydrophobic interactions in drug-receptor interactions; the regions of the drugs that most contributed to the anchorages of these in their binding sites; as well as the identification of residues that are most associated with mutations and consequent resistance.

Orientador: Felix Guillermo Reys Reys / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-13T21:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RenataCabrerade_M.pdf: 696928 bytes, checksum: 7026171fdbd90be240a19f0afb58a12c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A presença de resíduos de medicamentos veterinários em níveis acima dos limites máximos (LMR) estabelecidos apresentam riscos à saúde humana. O conhecimento da dimensão da exposição da população a esses compostos é necessário para garantir a proteção do consumidor. Para tanto, é imprescindível que métodos de análise validados estejam disponíveis, para assegurar a confiabilidade dos resultados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos analíticos para a determinação de resíduos de estreptomicina e diidroestreptomicina em leite e empregá-los na análise de amostras comercializadas na região de Campinas, São Paulo. Os métodos analíticos desenvolvidos e validados incluem o ensaio imunoenzimático (ELISA) e a cromatografia líquida associada à espectrometria de massas em tandem (LCMS/MS QToF). A validação analítica foi realizada de acordo com as recomendações da Comunidade Européia e IUPAC. Os seguintes parâmetros foram avaliados: seletividade, curva analítica, linearidade, sensibilidade, precisão (repetibilidade intra e inter-dias), exatidão e limites de detecção e de quantificação. Os resultados do procedimento de validação dos métodos de ELISA e LC-MS/MS demonstraram que estes são adequados para a análise de triagem e confirmatória, respectivamente, de resíduos de estreptomicina e diidroestreptomicina em leite pasteurizado, em níveis de concentração inferiores ao LMR estabelecido para essas substâncias (200 µg kg-1). Nas amostras analisadas não foram encontrados resíduos de estreptomicina e diidroestreptomicina em níveis detectáveis / Abstract: Veterinary drugs pose a risk to human health when there residual levels in foods exceed the maximum residue limit (MRL). Knowledge of the extent of human exposure to these compounds is necessary to provide consumer protection. To achieve this, it is essential that validated analytical methods are available to ensure reliable results. The aim of the present work was to develop and validate analytical methods for the analysis of streptomycin and dihydrostreptomycin residues in milk, and to employ these methods for analysis of samples marketed in the region of Campinas, São Paulo. The developed and/or validated methods include enzyme immunoassay (ELISA) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS QToF). Method validation was performed according to the recommendations established by European Community and IUPAC. The following parameters were evaluated: analytical curve, linearity, sensitivity, precision (intra and inter-day repeatability), accuracy and the detection and quantification limits. The results demonstrated the effectiveness of ELISA and LCMS/MS methods for trial and confirmatory analyses, respectively, of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk at concentrations below the established MRL (200µg kg-1). In the analyzed samples streptomycin and dihydrostreptomycin were not found at detectable levels / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

[pt] Os aminoglicosídeos (AMG) pertencem a uma classe de antibióticos eficazes no tratamento de infecções provocadas por micro-organismos Gram-negativos e Gram-positivos. Ototoxidade, nefrotoxidade e alterações musculares são efeitos colaterais provocados pelo uso dessas substâncias, implicando na importância do controle das medicações com uso de métodos analíticos práticos para a rotina, sensíveis e seletivos. As estruturas dos AMG não possuem grupos cromóforos que habilitem a medição de atividade óptica direta, dessa maneira, os métodos descritos na literatura para determinação dos mesmos, normalmente, fazem uso da derivatização química implicando em alta morosidade, elevados custos e toxicidade (dados os reagentes utilizados) em tais métodos. No presente trabalho, propõe-se a utilização de nanopartículas de ouro (AuNPs) como sondas analíticas para a determinação espectrofotométrica de AMG, tirando-se proveito do efeito de ressonância plasmônica na superfície de AuNPs. Investigou-se o potencial analítico do uso de dispersões aquosas de AuNPs como sondas para a determinação de tobramicina (TBR), neomina (NEO), gentamicina (GENTA), canamicina (CANA), estreptomicina (EST) e amicacina (AMIC), observando-se resultados promissores para todos os AMG citados, excerto para a EST. No caso da TBR, foi desenvolvido um método analítico para a sua determinação em soluções oftálmicas. As curvas analíticas foram construídas a partir do monitoramento da luz transmitida em 529 nm ou 681 nm. O monitoramento do sinal analítico em 529 nm apresentou uma faixa linear entre 6,5 x 10-9 mol L-1 a 1,6 x 10-7 mol L-1 com boa linearidade (R2=0,9943) e limite de detecção (LD) igual a 6,2 x 10-9 mol L-1. O monitoramento do sinal analítico em 681 nm apresentou uma faixa linear entre 4,4 x 10-9 mol L-1 a 1,6 x 10-7 mol L-1 com boa linearidade (R2=0,9949) e valor de LD igual a 3,8 x 10-9 mol L-1. O método mostrou-se robusto em uma faixa de pH entre 2,6 e 4,5, durante 120 min. O método apresentou precisão satisfatória e demonstrou seletividade com relação a outro AMG, STP, e com relação aos excipientes presentes nas amostras analisadas. Obtiveram-se percentuais de recuperação para as amostras (simuladas e reais de soluções oftálmicas) de 104,0 a 123,1 por cento e de 101,1 a 123,6 por cento, para o monitoramento do sinal analítico em 529 nm e 681 nm, respectivamente. Utilizando-se um método comparativo para validar esses resultados, verificou-se através do teste t-student que os percentuais de recuperação encontrados através das sondas de AuNPs e através do método comparativo foram estatisticamente iguais. Estudos com saliva de pacientes em tratamento com TBR indicam o potencial da sonda para a análise de fluidos biológicos. / [en] Aminoglycosides (AMG) belong to a class of antibiotics effective for the treatment of infections caused by Gram-negative and Gram-positive micro-organisms. Ototoxicity, nephrotoxicity and muscle disorders are side effects of using these substances, implying the importance of controlling the use of pharmaceutical formulations based on AMG with practical analytical methods for routine, sensitive and selective. The molecular structures of the AMG does not present any relevant chromophores groups that enable direct measurement of their optical activity, thus, the methods described in the literature for determining it normally to use of chemical derivatization implying high delays, high costs and toxicity (dice reagents used) in such methods. The studies present in this dissertation, it is proposed to use of gold nanoparticles (AuNPs) as analytical probes for spectrophotometric determination of AMG, by exploration of the resonance Plasmon effect on the surface of AuNPs. Was investigated the analytical potential of aqueous dispersions of AuNPs as probes for the determination of tobramycin (TBR) neomina (NEO), gentamicin (GENTA), kanamycin (CANA), streptomycin (EST) and amikacin (AMIC). Promising results were found for all AMG cited excerpt EST. In the case of TBR, an analytical method for its determination in ophthalmic solutions was proposed. The analytical curves were constructed by monitoring the transmitted light at 529 nm or 681 nm. The monitoring of the analytic signal in 529 nm yielding a linear range from 6.5 x 10-9 mol L-1 to 1.6 x 10-7 mol L-1 with good linearity (R2= 0.9943) and the limit of detection (LOD) equal to 6.2 x 10-9 mol L-1. The monitoring of the analytic signal in 681 nm yielding a linear range from 4.4 x 10-9 mol L-1 to 1.6 x 10-7 mol L-1 with good linearity (R2= 0.9949) and the LOD equal to 3.8 x 10-9 mol L-1. The method showed to be robust in a pH range between 2.6 and 4.5, for 120 min. The method showed satisfactory accuracy and demonstrated selectivity with respect to other AMG, EST, and with respect to excipients present in the samples analyzed. Yielded percentage recoveries for samples (simulated and real ophthalmic solutions) from 104.0 to 123.1 percent and from 101.1 to 123.6 percent, for the monitoring of the analytical signal at 529 nm and 681 nm, respectively. Using a comparative method to validate these results, it was found through the t-student test that the percentage recovery found through the AuNPs probes and the comparative method were statistically equal. Studies in saliva from patients under TBR treatment indicated the potential of the probe for the analysis of biological fluids.

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T07:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_CintiaYuri_D.pdf: 2096053 bytes, checksum: 36802787c48fa671b02e82fdc5d9de40 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na Distrofia Muscular de Duchene (DMD) e em seu modelo experimental, camundongos mdx, a ausência ou disfunção da proteína distrofina leva a degeneração muscular. Acredita-se que a patogênese da DMD esteja relacionada à fragilidade do sarcolema, ao estresse mecânico e ao maior influxo de íons cálcio na fibra muscular resultante do funcionamento anormal de canais iônicos, como os canais de cálcio ativados por estiramento. O conhecimento das proteínas envolvidas na degeneração/regeneração muscular e na proteção a mionecrose da fibra muscular distrófica é essencial para a caracterização das distrofias musculares, bem como para o estabelecimento de métodos diagnósticos e de tratamentos preventivos ou terapêuticos. No presente trabalho estudamos os mecanismos de proteção a degeneração muscular, sendo dois os objetivos. No primeiro, identificamos proteínas envolvidas na proteção a mionecrose e nos processos de degeneração/regeneração muscular através do estudo proteômico dos músculos afetados ou não pela distrofia muscular em camundongos mdx e em animais controle. No segundo, verificamos a participação dos canais de cálcio ativados por estiramento na degeneração da fibra muscular através do seu bloqueio pela estreptomicina nos diferentes músculos distróficos de mdx. Adicionalmente, verificamos os potenciais efeitos secundários da estreptomicina na estabilidade do sarcolema e no tamponamento e sinalização de cálcio. Quanto ao estudo proteômico, nossos resultados sugerem que a diferença constitutiva dentre músculos afetados e não afetados pela degeneração são fundamentais para proteção a mionecrose, permitindo a manutenção da homeostase de cálcio e melhor resposta ao estresse mecânico e oxidativo. As proteínas galectina-1, anexina A1 e proteína 1 de interação com Reticulon-4 são possíveis biomarcadores para a distrofia muscular, uma vez que participam de diferentes processos celulares. Quanto a terapia farmacológica verificamos que os músculos distróficos mais afetados, como o diafragma, possuem maior quantidade de canais de cálcio ativados por estiramento e a estreptomicina atenuou a degeneração dos músculos distróficos. Diferente do efeito secundário de outros bloqueadores de canais de cálcio, a estreptomicina não alterou as proteínas do complexo distrofina-glicoproteína (beta-distroglicana e alfa-sintrofina), bem como as relacionadas ao cálcio (calsequestrina e calmodulina). Nossos resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias farmacológicas relacionadas a proteínas envolvidas na degeneração muscular e na proteção a mionecrose, assim como para o desenvolvimento de métodos diagnóstico e de acompanhamento das distrofinopatias pelos marcadores moleculares / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in the mdx mice model of DMD, the lack of dystrophin leads to muscle degeneration. The pathogenesis of DMD is related to sarcolemmal fragility, mechanical stress and increased influx of calcium in muscle fibers, due to dysfunction of ion channels, such as the stretch-activated calcium channels. The knowledge of the proteins related to muscle degeneration/regeneration and to the protection against myonecrosis is essential to better characterize the muscular dystrophy and to establish new diagnostic tools, in addition to new preventive or therapeutic treatments. In the present study, we addressed new mechanisms of muscle protection by focusing on two main objectives. First, to identify proteins related to the protection agaisnt myonecrosis and to muscle degeneration/regeneration by performing a comparative proteomic study of spared and affected muscles of mdx and control mice. Second, to verify the involvement of stretch-activated calcium channels in dystrophic muscle degeneration by performing a drug therapy with a stretch-activated calcium channels blocker, streptomycin, in muscles that are differently affected by the lack of dystrophin, in the exercised-mdx mice. Furthermore, we were interested to see whether the stretch-activated calcium channels blocker would have additional effects on sarcolemal stability and on calcium buffering and signaling, as previously reported for other calcium channels blockers. The proteomic study suggests that constitutive differences among spared and affected dystrophic muscles are essential for muscle protection agaisnt myonecrosis, allowing a better calcium homeostasis and response to oxidative and mechanical stress. Galectin-1, annexin A1 and the protein interacting with Reticulon-4 are potencial biomarkers for muscular dystrophy, due to their involvement in different cellular processes. The drug therapy study shows that stretch-activated calcium channels participates in dystrophic muscle degeneration, showing higher levels in the mostly affected muscle, the diaphragm. Streptomycin protects the dystrophic muscles against myonecrosis, but has no further effects on other mechanisms of dystrophic muscle protection, i.e., did not improve the dystrophin-glycoprotein complex (assayed by beta-dystroglycan and alpha-syntrofin levels), nor calcium binding protein (assayed by calsequestrin and calmodulin levels). Overall, the present study opens new perspectives for the development of drug therapies to dystrophinopathies by suggesting potential new molecular markers of dystrophy (proteomic study) and by suggesting new mechanistic views to explain the differences in the response of dystrophic muscles to the lack of dystrophin (drug therapy) / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-24T11:51:36Z No. of bitstreams: 1 Marcelo Rodrigues Figueira de Mello.pdf: 590787 bytes, checksum: 0b21179fd04d627436888523d18d7338 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T11:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcelo Rodrigues Figueira de Mello.pdf: 590787 bytes, checksum: 0b21179fd04d627436888523d18d7338 (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The production of Chinese cabbage (Brassica pekinensis) may be limited by occurrence of diseases, among which the soft rot caused by Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc). The effect of inducers and antibiotics on the disease control was studied in laboratory, greenhouse and field. In the first paper acibenzolar-S-metil (ASM) (0.025 g L-1), Ecolife® (2 mL L-1), Agro-Mos® (2 mL L-1) and calcium oxide (0.22 g L-1) were evaluated for in vitro bacterial growth inhibition; epidemiological components, incidence (INC), incubation period (PI), disease final severity (SEVF), diasease index (IDO) and area under disease curve progress (AUPDC); enzymatic activity of peroxidase and polyphenoloxidase and physiological cost of induction. Under greenhouse and field conditions inducers were sprayed seven days after transplant, and seven days after induction strain Pcc120 was inoculated by pricking, except for enzymatic activity and physiological cost experiments. In vitro Pcc120 was not inhibited by any tested product. The INC was not reduced in any experiment. In greenhouse SEVF was reduced by 47.5% by Agro-Mos® and ASM which also reduced IDO by 35.1 and 45.3% respectively and AUDCP. Induced resistance was confirmed by negative antibiosisagainst pathogen and increase of peroxidase and polyphenoloxidase activities in treated plants. In field only ASM confirmed greenhouse results by reducing disease intensity. There was no physiological cost for plants sprayed with ASM or Agro-Mos®. In the second paper it was evaluated the in vitro sensibility of Pcc to bactericides, and the effect of Mycoshield® (oxitetracycline 20%) at 3.0 and 1.5 g L-1, and yeasts (Rh1 and Rh2 - Rhodotorula spp. and Sc1 - Saccharomyces cerevisae at 108 cel mL-1) to control the disease in greenhouse and field. Plants were sprayed with Mycoshield® and yeasts seven days after transplant and inoculated seven days and 12 h after treatment, respectively. In all experiments INC, PI, SEVF, IDO and AUDPC were evaluated. In vitro 40 Pcc isolates were resistant to copper sulfate and sensitive to oxitetracycline, streptomycin, oxitetracycline+ streptomycin and oxitetracycline + copper sulfate all at 0.2 g L-1. Six Pcc isolates were significantly more inhibited by MycoshieldÒ than by Agri-Micina® (oxitetracycline 1.5% + streptomycin 15%), but there was no inhibition by Kasumin® (kasugamicin 2%). In greenhouse MycoshieldÒ at 3.0 g L-1 reduced SEVF and IDO until 47.4 and 19.0%. The yeast Sc1 reduced SEVF and AUDCP till 27.6 and 39.3% respectively, while Rh1 reduced AUDCP until 33.5%. In field MycoshieldÒ reduced IDO, SEVF and AUDCP by 14.4; 15.5 and 28.9% respectively; while Rh1 reduced IDO by 8.8% and Sc1diminished the AUDCP by 15.7%. The reduction of disease intensity and low physiological cost of induction indicate the potentiality of ASM in an integrate management program of Chinese cabbage soft rot. On the other hand MycoshieldÒ and yeasts showed low efficiency for controlling disease in field. / A produção de couve-chinesa (Brassica pekinensis) pode ser limitada pela ocorrência de doenças, dentre as quais se destaca a podridão-mole causada por Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc). O efeito de indutores e antibióticos no controle desta doença foi estudado em laboratório, casa de vegetação e campo. No primeiro trabalho, foram testados acibenzolar-S-metil (ASM) (0,025 g/L), Ecolife® (2 mL/L), Agro-Mos® (2 mL/L) e óxido de cálcio (0,22 g/L). Foram avaliados, a inibição do crescimento bacteriano “in vitro”; os componentes epidemiológicos, incidência (INC), período de incubação (PI), severidade final da doença (SEVF), índice de doença (IDO) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD); a atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase e o custo fisiológico da indução. Em casa de vegetação e campo os indutores foram pulverizados sete dias após o transplante e sete dias após a indução, o isolado Pcc120 foi inoculado por picada, exceto nos experimentos de atividade enzimática e custo fisiológico. Pcc120 não foi inibido “in vitro” por nenhum dos produtos testados. Não houve redução da INC em nenhum dos experimentos. Em casa de vegetação, a SEVF da doença foi reduzida em 47,5% pelos tratamentos Agro-Mos® e ASM, os quais também, respectivamente, reduziram o IDO em 35,1% e 45,3% e propiciaram as menores AACPD. A resistência induzida foi evidenciada pela ausência de antibiose dos dois produtos contra Pcc e pelo aumento das atividades da peroxidase e polifenoloxidase. Em campo, apenas o ASM confirmou os resultados de casa de vegetação reduzindo a intensidade da doença. Não houve custo fisiológico para as plantas com aplicação do ASM ou Agro-Mos®. No segundo trabalho avaliou-se a sensibilidade “in vitro” de Pcc a bactericidas, o efeito de Mycoshield® (oxitetraciclina 20%) nas dosagens de 3,0 e 1,5 g/L, e das leveduras (Rh1 e Rh2 - Rhodotorula spp. e Sc1 - Saccharomyces cerevisae a 108 cel/mL) no controle da doença em casa de vegetação e em campo. As plantas foram pulverizadas com Mycoshield® e leveduras sete dias após o transplante, e inoculadas sete dias e 12 h após o tratamento, respectivamente. Foram avaliados INC, PI, SEVF,IDO e AACPD. In vitro, 40 isolados de Pcc testados apresentaram resistência ao sulfato de cobre e sensibilidade a oxitetraciclina, estreptomicina, oxitetraciclina+estreptomicina e oxitetraciclina+sulfato de cobre, todos na concentração de 0,2 g/L. Seis isolados de Pcc foram significativamente mais inibidos por MycoshieldÒ do que por Agri-Micina® (oxitetraciclina 1,5% + estreptomicina 15%), não sendo inibidos por Kasumin® (casugamicina 2%). Em casa de vegetação, o MycoshieldÒ na dosagem 3,0 g/L reduziu a SEVF e o IDO em até 47,4 e 19%; já a levedura Sc1 reduziu a SEVF e a AACPD em até 27,6 e 39,3%, respectivamente, enquanto Rh1 reduziu a AACPD em até 33,5. Em campo, o MycoshieldÒ reduziu o IDO, a SEVF e a AACPD em respectivamente 14,4; 15,5 e 28,9%; enquanto que Rh1 reduziu o IDO em 8,8% e Sc1 reduziu a AACPD em 15,7%. A redução da intensidade da doença e o baixo custo fisiológico da indução indicam a potencialidade do uso do ASM em um programa de manejo integrado da podridão-mole em couve-chinesa. No entanto,o MycoshieldÒ e as leveduras apresentaram baixa eficiência para o controle da doença em campo.