A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.

A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.

A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.

Orientador: Patrícia Simone Leite Vilamaior / Banca: Ana Paula Girol / Banca: Fernanda Cristina Alcantara dos Santos / Resumo: A próstata é uma glândula acessória do sistema genital dos mamíferos cujo desenvolvimento ocorre sob influência de andrógenos, hormônios esteroides responsáveis por induzir a diferenciação e a maturação do sistema reprodutor masculino e por atuar no desenvolvimento das características sexuais secundárias masculinas. A privação dos andrógenos pode ocorrer por meio da orquiectomia (castração cirúrgica), a fim de suprimir os níveis de testosterona e promove, na glândula prostática, a atrofia das células epiteliais. E as células musculares lisas passam a atuar na adaptação do compartimento estromal que interage e contribui para a redução da atividade das estruturas epiteliais. Nesse compartimento é possível observar a presença de vários tipos celulares, como os macrófagos, que são responsáveis por atuar ativamente na homeostase do sistema reprodutivo. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar as modificações decorrentes da remodelação tecidual resultantes da privação de andrógenos na próstata ventral de gerbilos, com ênfase na distribuição e ocorrência dos macrófagos. Foram utilizados gerbilos (Meriones unguiculatus) machos adultos divididos nos grupos: controle e castrados (eutanasiados no 3º, 7º e 14º dia após a orquiectomia). O lobo ventral da próstata desses animais foi removido, pesado e processado para microscopia de luz. Foram realizadas análises estereológicas, morfométricas, sorológica, imunoistoquímicas e imunofluorescência. Os dados obtidos indicam que... / Abstract: The prostate is an accessory gland of the genital system of the mammals and its development occurs under the influence of androgens, steroid hormones wich are responsible for inducing the differentiation and maturation of the male reproductive system, operating in the development of the male secondary sex characteristics. Deprivation of androgens may occur through orchiectomy (surgical castration) in order to suppress testosterone levels. Orchiectomy promotes atrophy of the epithelial cells in the prostate gland and the smooth muscle cells are adapted to operate in the stromal compartment to reduce the epithelial structures activity. In the stromal compartment is possible to observe various cell types, including macrophages that work actively in the homeostasis of the reproductive system tissues. Thus, this study aims to evaluate the changes resulting from tissue remodeling resulting from androgen deprivation in the ventral prostate of gerbils, with emphasis on the distribution and occurrence of macrophages. Adult males gerbils (Meriones unguiculatus) was divided into groups: control and castrated (euthanized at 3 th, 7th and 14th days after orchiectomy). In these animals, the ventral lobe of the prostate was removed, weighed and processed for light microscopy. Stereological, morphometric, serological, immunohistochemistry and immunofluorescence analysis was performed. The data indicated that castration promoted a rearrangement of the different cell types and influenced in alterations in the relative proportion of the tissue compartments of the ventral prostate. Thus, the results may contribute to a better understanding of the stromal cells actions in the tissue remodeling process, especially in gerbils, in which the short-term effects (three days) had not been reported / Mestre

Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: O remodelamento ósseo é um processo complexo que depende do balanço entre formação e reabsorção óssea, mecanismo regulado pelas células ósseas e fatores sistêmicos, como o Sistema Nervoso Simpático (SNS). Os mediadores deste sistema são capazes de regular o metabolismo ósseo através dos receptores adrenérgicos expressos na superfície dos osteoblastos. Entretanto, o papel dos receptores β-adrenérgicos ainda não está totalmente elucidado no processo de diferenciação osteogênica. Objetivos: avaliar o papel dos receptores β-adrenérgicos na diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) foram utilizados para a coleta da medula óssea a partir do fêmur, as quais foram plaqueadas em garrafas de cultivo celular e depois em placas de 24 poços, onde receberam o meio osteogênico (MO: MEM, mais 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de β-glicerofosfato e 10-8 M de dexametasona), e o tratamento com Isoprenalina (0,01 µM), Carvedilol (1 µM), antagonista adrenérgico não seletivo, ou Nebivolol (0,1 µM), antagonista β1-adrenérgico. O ensaio de proliferação celular (MTT) e a atividade de fosfatase alcalina (Fal) foram realizados nos dias 7, 10 e 14. A mineralização foi avaliada no dia 14 através do vermelho de Alizarina. A expressão gênica dos marcadores osteogênicos e dos receptores β1 e β2 adrenérgicos foi avaliada no dia 7 por RT-PCR em tempo real. A atividade pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-07Bitstream added on 2015-03-03T12:06:10Z : No. of bitstreams: 1 000799295.pdf: 1434919 bytes, checksum: 36275b6266ae49abeed7a7bba084d604 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas a partir da medula óssea são capazes de se diferenciarem, sobretudo, em condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Durante a osteogênese in vitro, alguns parâmetros são utilizados para caracterizar este processo, tais como atividade da fosfatase alcalina (FAL), mineralização e expressão de proteínas associadas à osteoblastos. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) são um modelo animal de hipertensão essencial humana e desenvolvem hipertensão após 4 semanas de idade. Esta linhagem apresenta alterações significativas no metabolismo ósseo. O objetivo do presente estudo foi investigar se, o genótipo hipertensivo poderia interferir na diferenciação osteoblástica das CTMs de ratos SHR e qual mecanismo está alterado quando comparadas com a linhagem progenitora, ratos Wistar. Para isso, nós obtivemos CTMs da medula óssea de ratos Wistar e SHR com 4 semanas de idade, sem a hipertensão estabelecida, afim de avaliar somente o possível efeito do genótipo hipertensivo na diferenciação osteogênica in vitro. Nós induzimos, ou não, a diferenciação osteogênica in vitro por meio da utilização dos indutores osteogênicos: ácido ascórbico, ?-glicerofosfato e dexametasona. Os resultados demonstraram que, CTMs indiferenciadas de SHR (SHRC) demonstraram taxa de proliferação aumentada em comparação a CTMs, na mesma condição, de Wistar (WC), e após a indução da osteogênica, a taxa de proliferação apresentou uma diminuição acentuada no grupo SHR (SHRMO) do que no grupo Wistar na mesma condição (WMO). Embora não fora observada diferença significativa na atividade da FAL entre SHRMO e WOM no 7° dia, a mineralização e a diferenciação osteoblástica foram menores no grupo SHRMO no mesmo período experimental. Os fatores de transcrição Osterix e ?-catenina parecem estar envolvidos na diferenciação reduzida no grupo SHRMO... / Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow are able to differentiate mainly into chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. During in vitro osteogenesis, some parameters are used to characterize this process, such as the activity of alkaline phosphatase (ALP), mineralization and osteoblast-associated proteins expression. Spontaneously hypertensive rats (SHR) is an animal model of human essential hypertension. This animals developing hypertension after 4 weeks of age. This strain shows significant changes in bone metabolism. The aim of this study was to investigate whether the hypertensive genotype could influence the osteoblastic differentiation of MSCs from SHR and which mechanism are altered when compared to the parental strain, Wistar rats. For that, we have obtained bone marrow MSCs from Wistar and SHR rats at 4 weeks of age, without hypertension established in order to evaluate only the possible effect of hypertensive genotype on osteogenic differentiation in vitro. We induced or non-osteogenic differentiation in vitro using osteogenic inducers: ascorbic acid, dexamethasone and ?-glycerophosphate. The results demonstrate that undifferentiated MSCs SHR (SHRC) showed increased proliferation rate compared to MSCs, in the same condition Wistar (WC) and after osteogenic induction, proliferation rate showed a marked decrease in SHR (SHRMO) than in Wistar group in the same condition (WMO). Although it was not observed significant difference in ALP activity between WMO and SHRMO on day 7, mineralization and osteoblast differentiation were lower on group SHRMO in the same experimental period. The transcription factors Osterix and ?-catenin appear to be involved in reduced differentiation in SHRMO group because they showed lower expression in this experimental group. Furthermore, the decreased... / FAPESP: 12/01924-9 / FAPESP: 11/06070-5 / FAPESP: 11/19458-1

Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O potencial efeito terapeutico das celulas-tronco mesenquimais (MSCs) e seu meio condicionado (CM) tem sido extensivamente estudados. Eles possuem a capacidade de reparar tecidos, reduzir inflamacao local e modular respostas imunologicas. A inflamacao tubulo-intersticial progride para fibrose e pode levar a doenca renal cronica (DRC). A obstrucao ureteral unilateral (UUO) e um modelo bem estabelecido de fibrose renal. No presente estudo examinamos fatores que podem ser influenciados pela administracao de MSCs ou de seu CM na modelo de UUO. As MSCs foram extraidas de femures e tibias de ratos, cultivadas in vitro e caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciacao celular. Quatro grupos de ratas foram usados nos experimentos (n=7, cada): SHAM, UUO (Obstrucao Ureteral Unilateral), UUO+MSCs (Obstrucao+ MSCs) e UUO+CM (Obstrucao + CM). As MSCs ou seu CM foram administrados via veia cava abdominal apos total ligadura do ureter. Apos 7 ou 14 dias os animais foram eutanasiados e tiveram soro e rins coletados. Foram observadas reducoes nas expressoes de moleculas como COL1A1, α-SMA e TNF-α nos animais tratados com MSCs ou seu CM. Observou-se, por imunohistoquimica, reducoes nos niveis de caspase-3 ativada, α-SMA and PCNA nos animais tratados. Os resultados sugerem que a administracao intravenosa de MSCs ou de seu CM reduz a progressao da fibrose e modula fatores envolvidos na apoptose, inflamacao proliferacao celular e transdiferenciacao epitelio-mesenquimal (EMT) em ratas Wistar submetidas a UUO, indicando uma possivel ferramenta na prevencao ou reducao na progressao para DRC / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337734.pdf: 3377384 bytes, checksum: 41c3085f595d79158f356834905b6bcd (MD5) Previous issue date: 2015 / Neste estudo, foi avaliado o potencial de um novo tratamento para lesões cutâneas baseado em dois componentes da engenharia de tecidos: células e arcabouço. Foi utilizado como arcabouço o hidrogel de carragenana, um polímero termo reversível de origem natural, associado a células estromais multipotentes (CEM) humanas no tratamento de lesões cutâneas em modelo murino. Inicialmente foi realizada a caracterização química da carragenana teste, obtida da alga Kappaphycus alvarezii cultivada em Florianópolis e da carragenana comercial (Sigma®). Os resultados mostraram que a carragenana teste é da classe kappa e apresenta porcentagem de sulfato semelhante à encontrada na carragenana comercial (Sigma®). Em seguida, foi avaliada a regeneração cutânea após 3, 7 e 14 dias de pós-operatório. Os resultados mostraram que o tratamento com CEM encapsuladas no hidrogel de carragenana teste (HCT) não altera a densidade do infiltrado leucocitário, a vascularização e a espessura da epiderme, além de aumentar o tecido de granulação e o depósito de colágeno quando comparado ao grupo sem tratamento (S/T). Além disso, o tratamento com CEM + HCT apresenta um menor infiltrado leucocitário, não altera a espessura do tecido de granulação e a vascularização, aumenta o depósito de colágeno quando comparado aos grupos HCT e CEM. Os resultados mostraram também que as células humanas permanecem no tecido cicatricial murino após 3 dias de pós-operatório. Em conclusão, este estudo mostrou que a carragenana obtida da alga K. alvarezii cultivada em Florianópolis representa um material de baixo custo com potencial para aplicações terapêuticas. Apesar da associação do hidrogel de carragenana teste com as CEM humanas não apresentar melhora quando comparado ao grupo sem tratamento, demostrou bons resultados quando comparado aos tratamentos isoladamente (grupos HCT e CEM) e representa uma abordagem nova, barata e potencialmente aplicável na engenharia de tecidos.<br> / Abstract : This study evaluated the potential of a new treatment for cutaneous wound based on two components of tissue engineering: cells and scaffold. Carrageenan hydrogel, a thermo reversible polymer of natural origin was used as a scaffold for the delivery of human multipotent stromal cells (MSC) for treatment of cutaneous wound in mice. At first the chemical characterization of native carrageenan obtained from seaweed Kappaphycus alvarezii grown in Florianopolis and commercial carrageenan (Sigma®) was carried out. The results showed that the native carrageenan belongs to the kappa class and shows a percentage of sulphate similar to that found in commercial sample. Evaluation of mouse skin wound healing was carried out by three steps: excisional wound in the dorsal region, treatment application and coating with Tegaderm® dressing. The results after 3, 7 and 14 days post-wounding showed that treatment with MSC encapsulated in native carrageenan hydrogel (NCH) does not change the density of the leukocyte infiltrate, vascularity and the thickness of the epidermis, and increase granulation tissue and collagen deposition when compared to the control untreated group. Furthermore, treatment with MSC encapsulated in NCH has a lower leukocyte infiltration, does not change the thickness of the granulation tissue, epidermis and vascularity, and increase collagen deposition when compared with MSC and NCH groups. In addition, human cells were detected in the scar tissue within 72 h post-wounding. In conclusion, this study showed that the carrageenan obtained of seaweed K. alvarezii cultivated in Florianopolis is a low cost material with potential therapeutic applications. The carrageenan hydrogel association with human MSC did not showed improvement compared to untreated group, but showed good results when compared to NCH and MSC groups. Thus, MSC encapsulated NCH represents a new approach applicable in tissue engineering.