Orientador: Cristina Antoniali Silva / Coorientador: Adalberto Luiz Rosa / Banca: Alberto Carlos Botazzo Delbem / Banca: Márcio Mateus Beloti / Banca: Mário Taba Júnior / Banca: Natália Marcumini Pola / Resumo: A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada... / Abstract: Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest... / Doutor

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: A utilização de terapias celulares no tratamento de lesões musculoesqueléticas cresce mundialmente em larga escala e é cada vez mais aceita. As células tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas e expandidas in vitro, sendo tipicamente obtidas do próprio paciente (autóloga). Contudo, o uso de células provenientes de um animal doador (alogênica) e submetidas ao cultivo e a criopreservação, cria a oportunidade de iniciar o tratamento imediatamente após o diagnóstico. Há evidencias de que as CTMs possuem capacidade de imunomodulação, interagindo com os linfócitos T de diversas maneiras, além de não estimularem a indução de uma resposta imune complexa por não expressarem MHC II. Contudo, ainda há falta de consenso entre os estudos quanto a imunogenicidade das CTMs. Desta forma, o presente estudo objetivou avaliar a segurança da administração das células alogênicas em equinos através da análise de uma possível inflamação decorrente do implante alogênico de CTMs em músculo hígido de equinos, por meio de exame físico, ultrassonográfico, termográfico, histopatológico e pela expressão gênica de IL-1 beta e TNF- alfa. Os resultados demostraram que aplicação de CTM alogênicas é um processo seguro uma vez que não houveram alterações clínicas significativas, contudo uma segunda aplicação de CTM alogênicas de um mesmo doador levou ao aumento significativo da expressão gênica de TNF- alfa, podendo caracterizar uma resposta imune celular mais acentuada. Nossos resultados contribuíram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of cell therapy for treatment of musculoskeletal injuries in horses is increasing in large scale worldwide. The mesenchymal stem cells (MSCs) are easily isolated and expanded in vitro, making them promising for use in clinical trials. Typically, these cells are obtained from the own patient (autologous), however, cell from a donor horse (allogeneic) expanded in vitro and cryopreserved create the opportunity of immediate treatment after diagnosis. There is evidence that MSCs have immunomodulatory capacity by interacting with T lymphocytes in several ways, and do not stimulate a complex immune response for not expressing MHC II. However, there is still a lack of consensus among the studies on the immunogenicity of MSCs. Thus, this study aimed to evaluate the safety of administration of allogeneic mesenchymal stem cells in horses. For such a possible inflammation reaction to the implantation was analysed through physical examination, ultrasound, thermography, histopathology and gene expression of IL 1beta and TNF-alpha. The results showed that the implantation of allogeneic MSCs is a safe process since there were no significant clinical changes in the animals, but a second application of allogeneic MSCs from the same donor led to significant increase in gene expression of TNF-alpha, which can characterize a cellular immune response. Our results contribute to future research on treatment of musculoskeletal injuries in horses using MSCs, by creating banks of cells derived ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: O tendão flexor digital superficial (TFDS) é uma estrutura importante para a espécie equina e para animais de alto desempenho atlético. Atualmente, a medicina regenerativa vem evoluindo de forma significativa no tratamento de diversas enfermidades, no entanto, o entendimento a respeito do comportamento celular quando do transplante de células tronco mesenquimais (CTMs) em tecido hígido ainda não é completamente conhecido. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo a avaliação da resposta inflamatória local após aplicação de células tronco mesenquimais alogênicas derivadas do tecido adiposo (AdCTMs) em tendão equino comparado ao transplante autólogo e ao grupo controle. Para isso, 18 membros torácicos de 9 animais, divididos em três grupos, foram submetidos à aplicação de AdCTMs em tendão hígido, sendo que em Galog os animais receberam aplicação de AdCTMs alogênicas no membro torácico (MT); em Gauto, aplicação de células autólogas no MT e em Gcont aplicou-se o PBS como grupo controle. Esses animais foram avaliados por parâmetros físicos, exames ultrassonográficos e termográficos até o momento da biópsia, que foi realizada uma semana após aplicação das células autólogas e alogênicas para avaliar a possível reação inflamatória aguda, decorrente do implante de células no tecido tendíneo. O transplante alogênico de CTMs não resultou em reação adversa ou inflamatória que comprometesse o uso dessas células, elucidando a sua segurança neste trabalho. O seu comportamento mostrou-se ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The superficial digital flexor tendon (SDFT) is an important structure for the equine species and for high performance animals. Currently, regenerative medicine has evolved significantly in the treatment of several diseases, even though the cellular behavior during the implantation of mesenchymal stem cells in healthy tissue is not completely known, despite the fact that it has been tirelessly studied in the last few years. This study aims to evaluate and compare the local inflammatory response upon injection in equine tendon of either allogeneic and autologous mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AdMSC). For this purpose, 18 forelimbs, 9 animals were submitted to the application of AdMSC in healthy tendon, which were divided into 3 groups: in Galog the animals received application of allogeneic AdMSC in the thoracic member; in Gauto, autologous AdMSC were injected in the thoracic member; in Gcont, PBS was implanted as control group. These animals were evaluated through physical exams, ultrasound, and thermography up until the moment of the biopsy, which was performed a week after the application of AdMSC in order to evaluate the inflammatory response due to the implantation of the cells in the tendinous tissue. Biopsy samples were taken to histopathology and immunohistochemistry in order to evaluate the actions of allogeneic AdMSC. The allogeneic MSCs implantation did not result in adverse or inflammatory reaction which could compromise the use of these cells,... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobral_LaysMartin_D.pdf: 3033003 bytes, checksum: 6019edf717b2f1f1088e0f9584909707 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Miofibroblastos são células mesenquimais caracterizadas pela expressão da isoforma ? da actina de músculo liso (?-SMA) e pela secreção de proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento e proteases. Estas células desempenham um papel importante na reparação de feridas e em processos patológicos, incluindo fibroses e cânceres. Os objetivos deste estudo foram 1) analisar o papel do fator de crescimento de tecido conjuntivo bem como o efeito da superexpressão de Smad7 na transdiferenciação de miofibroblastos gengivais induzida pelo fator de crescimento transformante-?1 (TGF-?1), 2) isolar e caracterizar linhagens celulares de miofibroblastos do estroma de carcinomas espinocelulares (CEC) orais e comparar o potencial proliferativo e produção de metaloproteinases de matriz (MMP) com linhagens celulares de fibroblastos do estroma de CEC orais, e 3) analisar a influência de miofibroblastos na modulação da proliferação e invasão de linhagens celulares de CEC oral. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com TGF-?1 induziu simultaneamente a expressão de ?-SMA e CTGF e a neutralização de CTGF com RNA de interferência (siRNA) bloqueou o efeito de TGF-?1 na indução da transdiferenciação de células de gengiva normal em miofibroblastos. A superexpressão de Smad7 em células de GN inibiu a cascata de ativação de TGF-?1, caracterizada pela fosforilação de Smad2 e expressão de ?-SMA, CTGF e colágeno tipo I. Similarmente, miofibroblastos isolados do tecido gengival de fibromatose gengival hereditária (FGH) superexpressando Smad7 demonstraram níveis reduzidos de ?-SMA e pSmad2, além de baixos níveis de expressão de CTGF e colágeno tipo I. Três linhagens celulares de miofibroblastos foram isoladas do estroma de CEC de língua e caracterizadas pela expressão de ?-SMA e por níveis elevados de produção de colágeno tipo I. Embora o potencial proliferativo dos clones de fibroblastos e miofibroblastos tenham sido semelhantes, as produções de MMP-1, -2, -9 e -13 foram significantemente maiores em miofibroblastos. Finalmente, nós demonstramos que miofibroblastos do estroma tumoral produzem níveis elevados de alguns fatores de crescimento comparado com fibroblastos, incluindo ativina A. Meios de cultura condicionados por miofibroblastos contendo ativina A significantemente induziu a proliferação de linhagens celulares de CEC oral e uma maior progressão tumoral in vivo, enquanto que o bloqueio de ativina A por siRNA diminuiu significantemente a proliferação das células de CEC oral. In vitro, miofibroblastos induziram a invasão de linhagens celulares de CEC oral, o qual foi acompanhado por uma indução na produção de MMPs, e in vivo uma significante correlação entre presença de miofibroblastos e atividades de MMP-2 e MMP-9 foi observada. O bloqueio da síntese de ativina A por siRNA em miofibroblastos não alterou a capacidade de indução da invasão e síntese de MMPs. Os resultados deste estudo demonstram 1) que Smad7 bloqueia a transdiferenciação de miofibroblastos gengivais por meio da inibição da fosforilação de Smad2 e da transcrição de CTGF, 2) que miofibroblastos no estroma de CEC orais podem contribuir para um fenótipo mais invasivo via secreção de elevados níveis de MMPs e 3) que produtos de síntese dos miofibroblastos induzem a proliferação e invasão das células de CEC oral e os estímulos proliferativos são controlados pela produção de ativina A. / Abstract: Myofibroblasts are mesenchymal cells, characterized by the specific isoform ? of the smooth muscle actin (?-SMA) expression and the extracellular matrix proteins, growth factors and proteases secretion. These cells play a central role on wound healings and in pathologic process, including fibrosis and cancers. The aims of this study were 1) analyze the connective tissue growth factor (CTGF) role and the superexpression of Smad7 effect on TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation, 2) isolate and characterize myofibroblast cell lines from oral squamous cell carcinomas stroma (OSCC) and compare the proliferative potential and matrix metalloproteinases (MMP) production with fibroblast cell lines from OSCCs stroma, and 3) analyze the myofibroblasts influence on the modulation of OSCC cell lines proliferation and invasion. Our results demonstrated that the TGF-?1 treatment induced simultaneously the ?-SMA and CTGF expression and the CTGF neutralization using the small interference RNA (siRNA) blocked the TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation. Smad 7 superexpression in normal gingival cells (NG) inhibit the TGF-?1 cascade activation, characterized by the Smad2 phosphorilation and ?-SMA, CTGF and type I collagen expression. Similarly, hereditary gingival fibromatosis (HGF) myofibroblasts superexpressing Smad 7, demonstrated reduced levels of ?-SMA and phospho-Smad2, and low expression levels of CTGF and type I collagen. Three myofibroblast cell lines were isolated from tongue OSCC stroma and characterized by the ?-SMA expression and high levels of type I collagen. Although the proliferative potential of fibroblast and myofibroblast clones has been similar, the MMP-1, -2, -9 and -13 were significantly higher in myofibroblasts. Finally, we demonstrated that tumor stroma myofibroblasts produce high levels of some growth factors compared with fibroblasts, including activin A. Myofibroblasts conditioned medium containing activin A induce significantly the OSCC cell lines proliferation and a tumor progression in vivo, while the activin A dowregulation by siRNA significantly decreased the OSCC cells proliferation. In vitro, myofibroblasts induced OSCC cells invasion, accompanied by an induction of MMPs production, and in vivo was observed a significant correlation between the myofibroblasts presence and the MMP-2 and MMP-9 activity. The myofibroblasts dowregulation of activin A by siRNA did not affect the induction of invasion and MMPs synthesis. The results of this study demonstrate that 1) Smad 7 blockage the gingival myofibroblasts transdifferantiation through the inhibition of Smad 2 phosphorilation and CTGF transcription, 2) myofibroblasts on the OSCCs stroma can contribute to a more invasive phenotype via elevated levels of MMPs secretion, 3) myofibroblasts released products induce an OSCC cells proliferation and invasion and the proliferative stimulus are controlled by the activin A production. / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hussein_Fernanda_M.pdf: 13730743 bytes, checksum: 0ded9b4ee837e3040ae51d3a2c5d6b02 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As células tronco são células indiferenciadas capazes de se auto replicar e de se diferenciar em diversos tipos celulares maduros com funções especializadas. As células tronco de medula óssea são particularmente interessantes por serem células multipotentes, ou seja, geram células de diversos tecidos, são de fácil obtenção através da aspiração da medula óssea femural e eliminam os problemas de rejeição por ser possível realizar transplante autólogo.As células de Schwann são um dos tipos celulares mais importantes do Sistema Nervoso Periférico (SNP). Elas são uma fonte de sinais para a geração e desenvolvimento dos nervos periféricos, da mielinização e, ainda, auxiliam na regeneração axonal no caso de lesões tanto do SNP quanto do SNC. Os estudos enfocando a indução da diferenciação de células progenitoras a tipos celulares específicos desejados estão em seus passos iniciais. Já são conhecidos diversos fatores que favorecem o desenvolvimento de um determinado tipo celular a partir de células progenitoras in vitro. Contudo, permanecem desconhecidos os fatores intrínsecos ao organismo que induzem esse processo. Faz-se necessário portanto que se investigue, ainda in vitro, porém sem manipulações exógenas e mimetizando o microambiente corpóreo, quais fatores endógenos são os responsáveis pela deflagração do processo de diferenciação. Neste sentido, o Meio Condicionado por células de Schwann mostrou exercer efeitos importantes sobre as células mesenquimais de medula óssea, promovendo sua proliferação e possivelmente induzindo o processo de diferenciação nestas células. Ainda, a Eletroforese 2DE comparativa mostrou uma similaridade maior entre CS e CMMO do que com as CMMO cultivadas em MC, indicando que esta última poderia estar sofrendo um processo de diferenciação celular, diferentemente das CS e das CMMO / Abstract: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) are capable to differentiate into several cell types. The differentiation depends on culture media molecules signaling. In this study we investigated the effect of Schwann cell conditioned media on BMMSC morphology and molecular phenotype. Schwann cells (SC) were isolated from adult Wistar rats sciatic nerve (Glia, 17: 327-338, 1996) and were cultivated in DMEM plus 10% FBS (D10). Every 48 hours the SC conditioned media (CM) were collected and stored at -80°C. The BMMSC were isolated from adult Wistar rats femur bone marrow (PNAS, 95:3908-3913,1995). BMMSC were maintained in D10. Subsequently, they were cultivated in CM for 7, 14 and 21 days. After 14 days in CM it was detected changes on the BMMSC typical flattened morphology to the SC bipolar morphology. The frequency of these changes increased after 21 days. These changes have been followed by changes on immunoreactivity and S100b protein localization on BMMSC. Before they were cultivated in CM, the BMMSC showed low immunoreactivity to S100b protein on cytoplasm. Culture in CM generated a S100b label gradual increase and it was found in nuclear compartment. Only the nucleous was S100b labeled, after 21 days. On the other hand, the bipolar morphology cells showed cytoplasmatic and nuclear S100b+. These findings agree with Deloume et al. (Mol. Cell. Neurosci. 27:453-465, 2004) about the S100b immunolabelling during the differentiation of glial progenitor cells into oligodendrocytes. Our results suggest that molecules present in CM are capable of inducing phenotypes changes related with the S100b expression and it roles on differentiation of BMMSC into SC. Moreover, 2DE electrophoresis shown a extent similarity between SC and BMMSC. This result suggests that the BMMSC cultivated in CM could be in a differentiation process / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Rejane Maira Goes, Sebastião Roberto Taboga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_DanieleLisboa_D.pdf: 4151708 bytes, checksum: bbb2c893cf2f2f9dbfd24f8e30c01cd2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O diabetes mellitus leva a complicações em diversos órgãos, incluindo as glândulas acessórias do sistema genital masculino. Na próstata, é bem estabelecido que essa doença acarreta atrofia epitelial, mas ainda não é claro o seu efeito sobre os componentes estromais e sua associação com alterações patológicas. Esse estudo visa esclarecer três aspectos controversos referentes ao impacto do diabetes sobre a próstata: 1) como as condições metabólicas do diabetes crônico não tratado afeta o compartimento estromal, em especial os componentes da matriz extracelular; 2) as possíveis associações entre essa doença e a incidência de alterações neoplásicas e 3) examinar as alterações prostáticas causadas pela resistência à insulina em comparação com o diabetes. A resistência à insulina, induzida pela administração do glicocorticóide dexametasona (1mg mg/Kg pc, durante 5 dias) causa, em curto prazo, efeitos semelhantes aos do diabetes, tais como a atrofia epitelial e alteração fenotípica das células musculares lisas (cml). Contudo, esta situação difere do diabetes pela atrofia das cml e ativação dos fibroblastos. Os efeitos do diabetes (90 dias), induzido experimentalmente pela administração de aloxana (45 mg/Kg pc), foram examinados com microscopia de luz, imunocitoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. Nesta situação experimental observou-se uma incidência de 64% de neoplasia intraepitelial (NIP) e 35% de adenocarcinoma. Também se verificou uma ampla variação da resposta histológica da próstata entre os indivíduos diabéticos. Assim, três grupos foram diferenciados segundo a gravidade das alterações teciduais: 1) modificações leves; 2) intensa atrofia e 3) ocorrência de lesões pré-malignas (NIP e atrofia inflamatória proliferativa- PIA) e malignas (adenocarcinomas). Nos dois primeiros grupos, a remodelação estromal caracteriza-se por um aumento da espessura da membrana basal acinar, maior ocorrência de colágeno e de grandes proteoglicanos de condroitim sulfato. Esses dados em conjunto indicam que o diabetes induzido experimentalmente modifica o ambiente estromal de maneira a favorecer o desenvolvimento de lesões patológicas na próstata. Devido a complexidade das interações metabólicas relacionadas ao diabetes, torna-se difícil definir os principais fatores responsáveis pelas alterações acima mencionadas. Entretanto, é possível afirmar os efeitos prejudiciais da resistência à insulina e do diabetes para a morfofisiológica prostática / Abstract: Diabetes mellitus leads to complications in several organs including acessory glands of the male genital system. In the prostate, it is well established that diabetes causes epithelial atrophy, but its effects on the stromal components is not defined, as well as its relation with pathological alterations in the prostate. This study aims to elucidate three controversial aspects decurrent from the impact of diabetes in the prostate:1) How the metabolic conditions of chronic diabetes affects the stromal compartiment, specially extracellular matriz components; 2) the possible association between diabetes and prostatic neoplasic alterations and 3) Evaluate prostatic changes caused by insulin resistence in comparison to diabetes. Insulin resistence, induced by administration of the glucocorticoid dexamethasone (1mg mg/Kg bw, 5 days) causes, in short term, similar effects to diabetes, such as epithelial atrophy and phenotypical alteration in the smooth muscle cells (smc). However, this situation is different from diabetes regarding the smc atrophy and fibroblast activation. The effects of chronic diabetes (90 days), induced experimentally by alloxan (45 mg/Kg bw), were examined by light microscopy, imunohistochemistry and transmission electron microscopy. In this experimental situation, it was observed the incidence of 64% of prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) and 35% of adenocarcinoma. It was also analysed a wide variation in the histological answer between diabetic individuals. Thus, three groups was determined according to the severity of their tissue alterations: 1) light modifications; 2) intense atrophy and 3) occurency of pre-malignant (PIN and proliferative inflammaotry atrophy- PIA) and malignant lesions (adenocarcinoma). In the first two groups, the stromal remodelation characterize for thickning of acini basement membrane, higher distribution of collagen and large proteoglycans of chondroitin sulphate. Together these data indicates that induced diabetes changes the stromal environment and consequently promotes the development of pathological lesions in the prostate. Due to the complexity of metabolic interactions related to diabetes, it is not possible to define the main factors responsible for those changes above mentioned. However, it is possible to confirm the injurious effects of insulin resistence and diabetes for the prostatic morfophisiology / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

Orientador: Valéria Helena Alves Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montico_Fabio_D.pdf: 8683742 bytes, checksum: b24bef7642e19dd250ce77f07cca65c4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A senescência está associada a modificações hormonais na próstata, resultando em microambiente favorável ao desenvolvimento de lesões neoplásicas. A angiogênese é fundamental para o crescimento tumoral e, na próstata, está sujeita à regulação por andrógenos, sendo sua estimulação um importante evento no estroma reativo associado ao câncer. Assim, a inibição da angiogênese representa terapia promissora no tratamento de neoplasias da próstata. O objetivo deste estudo foi caracterizar aspectos do estroma prostático na senescência e frente a terapias antiangiogênicas e de ablação hormonal, comparando-os com a reação estromal associada a lesões glandulares no modelo TRAMP. Camundongos FVB machos senis (52 semanas) foram submetidos a tratamentos antiangiogênicos com SU5416 (6 mg/kg; i.p.) e/ou TNP-470 (15 mg/kg; s.c.). O bloqueio hormonal foi obtido com finasterida (20 mg/kg; s.c.), isoladamente ou associada a ambos os inibidores. Após 21 dias de tratamento, amostras da próstata dorsolateral foram coletadas para análises morfológicas, imunohistoquímicas e de Western Blotting. A senescência levou à ocorrência de inflamação e de lesões proliferativas na próstata, bem como à maior frequência de células positivas para CD34/VIM e CD34/?SMA e ao aumento de MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1?, FGF-2, CD31, VIM e ?SMA, caracterizando semelhança com o microambiente prostático de camundongos TRAMP. Por outro lado, a endostatina e o TGF-? apresentaram-se elevados somente na senescência, mas não ao longo da progressão tumoral no modelo TRAMP. O tratamento com inibidores angiogênicos levou à recuperação e/ou interrupção das alterações glandulares associadas à senescência, mas efeitos diferenciais foram registrados para as drogas. Enquanto o SU5416 atuou principalmente sobre a remodelação tecidual prostática, reduzindo os níveis de MMP-9, VIM e ?SMA bem como a frequência de células positivas para CD34/VIM e CD34/?SMA, o TNP-470 influenciou sobretudo o IGFR-1, o VEGF e o HIF-1?, promovendo inibição de maior amplitude sobre esses fatores. A associação destes inibidores levou à combinação de tais efeitos diferenciais. A finasterida, isoladamente ou associada aos agentes antiangiogênicos, resultou em diminuição dos níveis de MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1? e FGF-2 em relação aos controles, embora tenha demonstrado tendência em regular positivamente a expressão de fatores pró-angiogênicos. Todavia, ao contrário da inibição da angiogênese, a ablação hormonal não resultou em diminuição do TGF-?. Assim, concluiu-se que a senescência gerou um microambiente de estroma reativo similar ao do modelo TRAMP, com estímulo aos à proliferação celular, remodelação tecidual, angiogênese e transição endotélio-mesenquimal, certamente propiciando condições favoráveis para o desenvolvimento de lesões prostáticas pré-malignas e malignas. Entretanto, a ausência de adenocarcinoma pouco diferenciado e a menor distribuição das lesões neoplásicas em relação a camundongos TRAMP sugeriram um possível papel protetor da endostatina sobre a próstata na senescência. A terapia antiangiogênica foi eficaz em promover efeitos antitumorais e a inibição da neovascularização, sobretudo frente à combinação dos inibidores, sugerindo que a ação diferencial desses agentes nos processos tumorigênicos resulta em espectro de ação mais amplo para o tratamento. Por fim, ressalta-se que os efeitos benéficos do tratamento com finasterida merecem especial atenção, considerando o potencial desta droga em promover o estroma reativo facilitador do desenvolvimento de desordens glandulares / Abstract: Senescence is associated with hormonal changes in the prostate, leading to a permissive microenvironment for the development of neoplastic lesions. Prostatic angiogenesis is an androgen-regulated process which is fundamental for tumor growth and represents an important event in cancer-associated reactive stroma. Thus, angiogenesis inhibition emerges as a promising therapy in the treatment of prostate neoplasms. The aim herewith was to characterize prostatic stroma during senescence and following antiangiogenic and hormonal ablation therapies, comparing the findings with the reactive stroma phenotype associated to TRAMP model glandular lesions. Elderly male FVB mice (52 week-old) were submitted to antiangiogenic treatments with SU5416 (6 mg/kg; i.p.) and/or TNP-470 (15 mg/kg; s.c.). Hormonal blockage was achieved with finasteride administration (20mg/kg; s.c.), either alone or combined to both inhibitors. After 21 days of treatment, dorsolateral prostate samples were collected for morphological, immunohistochemical and Western Blotting analysis. Senescence led to the occurrence of inflammatory foci and proliferative lesions in the prostate, apart from increased frequency of CD34/VIM and CD34/?SMA positive cells and raised levels of MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1?, FGF-2, CD31, VIM and ?SMA, resembling TRAMP mice prostatic microenvironment. On the other hand, endostatin and TGF-? showed higher expression in senescence but not during tumor progression in the TRAMP model. Antiangiogenic treatment resulted in recovery and/or interruption of the senescence-associated glandular changes, showing differential effects for each drug. SU5416 acted mainly on prostatic tissue remodeling, reducing MMP-9, VIM and ?SMA levels as well as the frequency of CD34/VIM and CD34/?SMA positive cells, whereas TNP-470 influenced specially IGFR-1, VEGF and HIF-1?, promoting greater inhibition over these factors. The association between the inhibitors led to synergistic differential effects. Despite presenting a trend to regulate positively pro-angiogenic factor expression, finasteride resulted in decreased MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1? and FGF-2 levels relatively to controls, either in isolation or combined to antiangiogenic agents. However, unlike angiogenesis inhibition, hormonal ablation did not lead to decreased TGF-? expression. Thus, it was concluded that senescence created a reactive stroma microenvironment which resembles that verified in the TRAMP model and is characterized by stimulated cell proliferation, tissue remodeling, angiogenesis and endothelial-to-mesenchymal transition. This scenario certainly provided favorable conditions for the development of pre-malignant and malignant prostatic lesions. However, the absence of poor-differentiated adenocarcinoma and the lesser distribution of neoplastic lesions in relation to TRAMP mice suggested a possible protective role of endostatin on the prostate during aging. Antiangiogenic therapy was efficient in promoting antitumor effects and neovascularization inhibition, especially following the combination of inhibitors, suggesting that the differential action of these agents on tumorigenic processes results in a broader spectrum of effects for the treatment. Finally, it is noteworthy that beneficial effects from finasteride treatment must be looked carefully, considering the capacity of this drug to promote a reactive stroma microenvironment favorable to the development of glandular disorders / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cartarozzi_LucianaPolitti_M.pdf: 5081962 bytes, checksum: 794c493e497a269465a5b035175dfbcb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A regeneração nervosa periférica é um processo complexo dependente do rearranjo e ativação das células de Schwann. O estímulo das células de Schwann pode ser alcançado através do enxerto de células tronco exógenas. Com o intuito de entender a importância do enxerto de células tronco mesenquimais (MSC) no processo regenerativo periférico, utilizamos o modelo de tubulização do nervo isquiático. As próteses tubulares foram preparadas a partir de membranas de poli-caprolactona (PCL) e preenchidas com selante de fibrina (FG), utilizado, neste caso, como substrato para as MSC. A técnica de tubulização foi feita em ratas fêmeas Lewis adultas, divididas em 4 grupos (n = 5 por grupo): normal, PCL (tubo vazio); FG (tubo preenchido com selante de fibrina) e FG+MSC (tubo preenchido com selante de fibrina e enxertado com MSC). Sessenta dias após lesão, os nervos regenerados foram processados para imunoistoquímica e microscopia de luz. A presença de MSC GFP-positivas foi detectada nos nervos dos animais que receberam enxerto de MSC, indicando que a sobrevivência, a longo prazo, das células tronco no tecido. A regeneração axonal, analisada por imunoistoquímica, revelou expressão de elementos básicos do nervo periférico, ou seja, componentes dos axônios e da lâmina basal tiveram a expressão equivalente em todos os grupos experimentais. A organização axonal foi observada através da marcação anti-neurofilamento. A presença das células de Schwann foi analisada através da marcação anti-S100 e o anticorpo anti-colágeno IV foi utilizado para detecção da lâmina basal. A imunomarcação anti-p75NTR, o receptor de baixa afinidade para neurotrofinas, foi utilizada para investigar a reatividade das células de Schwann. A marcação basal deste, em nervos não lesionados, foi aumentada pelo processo regenerativo, sendo estatisticamente maior no grupo FG+MSC (77% em relação ao nervo contralateral; p<0.001). Além disso, houve colocalização de MSC GFP-positivas e imunomarcação anti-BDNF, evidenciando uma possível via de atuação das células sobre o comportamento das células de Schwann. A partir da análise das secções semi-finas dos nervos pudemos avaliar que a área dos nervos regenerados no interior das próteses tubulares foi estatisticamente igual nos diferentes grupos experimentais. Quando quantificamos o número de axônios mielinizados por uma área fixa, o grupo FG+MSC apresentou maior densidade de axônios em relação ao grupo controle (25%, p<0,05). Da mesma maneira, quando analisamos os parâmetros morfométricos nos diferentes grupos experimentais, o grupo FG+MSC apresentou uma tendência a apresentar axônios de maior calibre e bainha de mielina mais espessa, em relação aos demais grupos, sendo que, a EBM, no intervalo de 1,46 a 2,25?m, foi significantemente maior em relação aos grupos PCL e FG (p<0,05). Como consequência, os animais do grupo FG+MSC mostraram recuperação motora significativamente maior na sétima e oitava semana de análise do índice funcional do nervo fibular. Os achados deste estudo mostram que as MSC enxertadas conjuntamente com selante de fibrina influenciam positivamente o processo regenerativo, modulando a reatividade das células de Schwann / Abstract: Peripheral nerve regeneration is a complex process that is dependent on the rearrangement and activation of Schwann Cells (SC). Such stimulation of SCs may be achieved by the use of exogenous stem cells. In order to better understand the importance of mesenchymal stem cell (MSC) grafting in the peripheral regeneration process we have used the model of sciatic nerve tubulization. Tubular prostheses were prepared from polycaprolactone (PCL) membranes and filled with fibrin sealant (FS), which was used as a substrate for the MSC. The technique of tubulization was applied in adult Lewis female rats that were divided into four groups (n = 5 per group): normal, PCL (empty tube), FS (tube filled with fibrin sealant) and FS + MSC (tube filled with fibrin sealant and grafted with MSC). Sixty days after injury, the regenerated nerves were processed for imunohistochemistry and observed under fluorescence microscopy. The presence of GFP positive stem cells was detected in the nerves of the animals that received MSC grafts, indicating the long term survival of such cells. The axonal regeneration process was studied by immunohistochemistry and revealed the presence of the basic elements of the peripheral nerve, namely axons and basal lamina components that were equivalent in all experimental groups. The axonal organization was observed with anti-neurofilament immunostaining. The presence of SCs was analyzed with anti-S100 immunostaining and anti-type IV collagen was used to detect the basal lamina. Anti-p75NTR, the low affinity receptor for neurotrophins, was used to investigate the reactivity of the SCs. A basal positive labeling in uninjured nerves was detected, which was upregulated by the regenerative process, being statistically higher in FS + MSC group (77% relative to uninjured nerve; p<0.001). Moreover there was colocalization between GFP-positive MSC and anti-BNDF immunolabeling, showing a possible pathway that these cells induce the reactivity of SCs. From sciatic nerve semi-thin sections we were able to evaluate that the areas of regenerated nerves were statistically the same in the different experimental groups. When we quantified the number of myelinated axons in 50.000?m2, the FG+MSC group showed higher density of axons when compared with PCL group (25%, p<0,05). In the same way, the analysis of morphometric parameters showed that the FG+MSC group have a tendency to present higher caliber axons and ticker myelin sheath when compared with other groups, being that the myelin sheath thickness, in the interval between 1,46 to 2,25?m, was significantly higher in FG+MSC group when compared to PCL and FG (p<0,05). As the functional result of the findings above, the FG+MSC animals showed higher motor function recovery, analyzed by FFI, at seventh and eighth weeks after lesion. The findings herein show that MSC associated with the FS scaffold improve the regeneration process by positively modulating the reactivity of SCs / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337734.pdf: 3377384 bytes, checksum: 41c3085f595d79158f356834905b6bcd (MD5) Previous issue date: 2015 / Neste estudo, foi avaliado o potencial de um novo tratamento para lesões cutâneas baseado em dois componentes da engenharia de tecidos: células e arcabouço. Foi utilizado como arcabouço o hidrogel de carragenana, um polímero termo reversível de origem natural, associado a células estromais multipotentes (CEM) humanas no tratamento de lesões cutâneas em modelo murino. Inicialmente foi realizada a caracterização química da carragenana teste, obtida da alga Kappaphycus alvarezii cultivada em Florianópolis e da carragenana comercial (Sigma®). Os resultados mostraram que a carragenana teste é da classe kappa e apresenta porcentagem de sulfato semelhante à encontrada na carragenana comercial (Sigma®). Em seguida, foi avaliada a regeneração cutânea após 3, 7 e 14 dias de pós-operatório. Os resultados mostraram que o tratamento com CEM encapsuladas no hidrogel de carragenana teste (HCT) não altera a densidade do infiltrado leucocitário, a vascularização e a espessura da epiderme, além de aumentar o tecido de granulação e o depósito de colágeno quando comparado ao grupo sem tratamento (S/T). Além disso, o tratamento com CEM + HCT apresenta um menor infiltrado leucocitário, não altera a espessura do tecido de granulação e a vascularização, aumenta o depósito de colágeno quando comparado aos grupos HCT e CEM. Os resultados mostraram também que as células humanas permanecem no tecido cicatricial murino após 3 dias de pós-operatório. Em conclusão, este estudo mostrou que a carragenana obtida da alga K. alvarezii cultivada em Florianópolis representa um material de baixo custo com potencial para aplicações terapêuticas. Apesar da associação do hidrogel de carragenana teste com as CEM humanas não apresentar melhora quando comparado ao grupo sem tratamento, demostrou bons resultados quando comparado aos tratamentos isoladamente (grupos HCT e CEM) e representa uma abordagem nova, barata e potencialmente aplicável na engenharia de tecidos.<br> / Abstract : This study evaluated the potential of a new treatment for cutaneous wound based on two components of tissue engineering: cells and scaffold. Carrageenan hydrogel, a thermo reversible polymer of natural origin was used as a scaffold for the delivery of human multipotent stromal cells (MSC) for treatment of cutaneous wound in mice. At first the chemical characterization of native carrageenan obtained from seaweed Kappaphycus alvarezii grown in Florianopolis and commercial carrageenan (Sigma®) was carried out. The results showed that the native carrageenan belongs to the kappa class and shows a percentage of sulphate similar to that found in commercial sample. Evaluation of mouse skin wound healing was carried out by three steps: excisional wound in the dorsal region, treatment application and coating with Tegaderm® dressing. The results after 3, 7 and 14 days post-wounding showed that treatment with MSC encapsulated in native carrageenan hydrogel (NCH) does not change the density of the leukocyte infiltrate, vascularity and the thickness of the epidermis, and increase granulation tissue and collagen deposition when compared to the control untreated group. Furthermore, treatment with MSC encapsulated in NCH has a lower leukocyte infiltration, does not change the thickness of the granulation tissue, epidermis and vascularity, and increase collagen deposition when compared with MSC and NCH groups. In addition, human cells were detected in the scar tissue within 72 h post-wounding. In conclusion, this study showed that the carrageenan obtained of seaweed K. alvarezii cultivated in Florianopolis is a low cost material with potential therapeutic applications. The carrageenan hydrogel association with human MSC did not showed improvement compared to untreated group, but showed good results when compared to NCH and MSC groups. Thus, MSC encapsulated NCH represents a new approach applicable in tissue engineering.