Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Wilson Savino / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:13:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francelin_Carolina_D.pdf: 110859425 bytes, checksum: e99991048374fbaee764c7b0f509643f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O timo é o órgão linfoide primário responsável pela geração de linfócitos T maduros. Para que isso ocorra, células precursoras de linfócitos T, provenientes da medula óssea, entram no timo e migram constantemente através do microambiente tímico ¿ o qual é composto por componentes linfoides e não linfoides. Esta migração intratímica é fundamental para que os precursores das células T encontrem os sinais necessários para sobrevivência, proliferação, diferenciação e geração de diversidade de repertório. Assim como os outros órgãos linfoides, o timo está sujeito a um rígido controle neuroendócrino, o qual impõe consequências diretas sobre o funcionamento do sistema imunológico através de neurotransmissores, hormônios e citocinas. Entretanto, ainda é pouco o que se sabe sobre as interações entre os componentes do timo e hormônios do eixo HPA. Neste trabalho, foram avaliados os compartimentos linfoide e estromal na atrofia tímica observada no modelo experimental da diabetes tipo I. Nesse estudo foi observado que camundongos diabéticos apresentaram redução nos níveis séricos e intratímicos de leptina e elevados níveis séricos e intratímicos de corticosteroide, acompanhando a queda dos níveis séricos de insulina. Diante das alterações hormonais, nós observamos: modificações nos componentes linfoides e estromais do timo, caracterizadas por redução no número de timócitos, aumento na secreção de elementos de matriz extracelular, contração da porção cortical do timo acompanhada por acúmulo de linfócitos no estágio pré - seleção positiva, aumento da apoptose de células epiteliais tímicas e timócitos e aumento na exportação de células T imaturas para os órgãos linfoides secundários. Sucintamente, após o estabelecimento da hiperglicemia e ausência de insulina circulante, o timo de animais diabéticos apresentou alterações morfológicas e em todos os tipos celulares e fatores solúveis que compõe o estroma tímico, culminando em alterações nas células presentes na periferia do sistema imune. Acreditamos que os dados gerados nesse estudo contribuem, s.m.j., para um melhor entendimento da deficiência na resposta imune em indivíduos diabéticos e do desenvolvimento do linfócito T na ausência de insulina / Abstract: Thymus is the primary lymphoid organ responsible for the generation of T lymphocytes. For this to occur, precursor cells of T lymphocytes from bone marrow enter the thymus and migrate continuously through the thymic microenvironment - which consists of lymphoid and non-lymphoid components. This intrathymic migration is essential for T cell precursors get contact with signs that promote survival, proliferation, differentiation and generation of diversity of repertoire. Like other lymphoid organs, the thymus is subject to a rigid neuro-endocrine control, which requires direct consequences on the functioning of the immune system through neurotransmitters, hormones and cytokines. However, it is still little known about the interactions between the components of thymus hormones and the HPA axis. In this study, we evaluated the alterations in lymphoid and stromal thymic compartiments in thymic atrophy during experimental model of diabetes type I. Here in, we found that diabetic mice exhibit a reduction in serum aand intrathymic levels of leptin yet, intrathymic and serum corticosteroid levels were high, followed by a drop in serum insulin levels. Given the hormonal changes, we observed: changes in lymphoid and non-lymphoid component of the thymus, characterized by reduction in the number of thymocytes, increased secretion of extracellular matrix elements, contraction of the cortical portion of the thymus accompanied by accumulation of lymphocytes in the pre stage - positive selection, increased apoptosis of thymic epithelial cells and thymocytes and increase in export of immature T cells to secondary lymphoid organs. Briefly, after the onset of hyperglycemia and lack of circulating insulin, thymus in diabetic animals showed alterations in all cell types that comprise the thymic microenvironment, resulting in abnormal cells present in the periphery of the immune system. We believe that the data generated in this study will contribute to a better understanding of the immune deficiency in diabetic individuals and the development of T lymphocytes in the absence of insulin response / Doutorado / Imunologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

O linfonodo é um órgão linfoide secundário que apresenta uma arquitetura altamente organizada com diferentes compartimentos para tipos celulares específicos. Dentre as células estruturais que compõem este órgão, as células estromais como células fibroblásticas reticulares (FRCs) e células duplo negativas (DNCs) parecem ter papel importante na modulação da resposta imunológica e na tolerância periférica. As FRCs são caracterizadas pela expressão de podoplanina (gp38, PDPN) e localizam-se principalmente na zona de células T, enquanto as DNCs (gp38-) apresentam fenótipo, localização e função pouco descritos. Embora estas células tenham sido muito estudadas em modelos murinos os estudos sobre FRCs e DNCs humanas são escassos e, portanto nosso estudo deve contribuir para a compreensão da biologia e a função dessas células, podendo favorecer o conhecimento sobre a eficiência e as disfunções da resposta imune no linfonodo. Com esse intuito, isolamos e caracterizamos fenotípica e funcionalmente as FRCs e DNCs de linfonodos de pacientes com câncer, diverticulite e doadores de fígado. Nossos resultados mostraram a integridade e a distribuição celular no linfonodo. As células aderentes derivadas dos linfonodos estudados preecheram todos os critérios internacionais de caracterização de estroma, e, portanto, foram consideradas células estromais. Através da expressão de gp38 identificamos duas subpopulações de celulas estromais: FRCs (gp38+ e CD31-) e DNCs (gp38- e CD31-) e verificamos que as frequências destas células variam entre as amostras, sugerindo que a doença pode interferir na composição celular estromal dos linfonodos. As duas populações celulares foram estimuladas com citocinas inflamatórias como IFN-y ou TNF-alfa + IL-1beta por 24 e 48 horas e avaliadas quanto à expressão gênica e proteica. Em condições homeostáticas, genes relacionados com a indução e controle da proliferação foram diferencialmente expressos nas FRCs e DNCs, este dado foi confirmado in vitro, uma vez que as FRCs apresentaram maior potencial proliferativo em relação às DNCs. O estímulo com IFN-y induziu aumento de expressão nas DNCs e FRCs para citocinas, quimiocinas, moléculas de histocompatibilidade e moléculas envolvidas na regulação da resposta imunológica. Em resposta ao estímulo com TNF-alfa +IL-1beta, observamos aumento na expressão de moléculas comuns ao estímulo com IFN-?, entretanto, também observamos expressão de moléculas de citocinas, quimiocinas inflamatórias e moléculas de histocmpatibilidade especificamente relacionados a este sinal em ambas as populações. Em conjunto, nossos dados sugerem que DNCs e FRCs apresentam diferenças no perfil de resposta segundo os estímulos inflamatórios aos quais estão expostas, aumentando a expressão diferencial de moléculas envolvidas na regulação positiva e negativa da resposta imune / The lymph node is a secondary lymphoid organ that has a highly organized architecture with different compartments for specific cell types. Among the structural cells that comprise this organ, stromal fibroblastic reticular cells (FRCs) and double negative cells (DNCs) seems to play an important role in modulating the immune response and peripheral tolerance. FRCs are characterized by podoplanin (gp38, PDPN) expression and are located mainly in the T cell zone, while DNCs (gp38-) present phenotype, location and function not well described. Although these cells have been studied in murine models, studies on human FRCs and DNCs are limited and therefore our study should contribute to the understanding of biology and function of these cells and should promote knowledge of efficiency and disorders in the lymph node immune response. For this purpose, we have isolated and characterized phenotypic and functionally lymph nodes derived FRCs and DNCs from patients with cancer, diverticulitis and liver donors. Our results showed lymph node integrity and its cellular distribution. Adherent cells lymph nodes-derived fullfill the international criteria for stroma characterization, and therefore, they have been considered stromal cells. Using gp38 expression we were able to identify two stromal cells subpopulations: FRCs (gp38 + and CD31-) and DNCs (gp38- and CD31-) and found that this cells frequency varies among samples, suggesting that the disease may interfere with lymph nodes stromal cell composition. These two cells populations were stimulated with inflammatory cytokines such as IFN-y or TNF-alfa + IL-1beta for 24 and 48 hours and evaluated for gene and protein expression. In homeostatic conditions, genes involved in the induction and control of proliferation were differentially expressed by FRCs and DNCs, this data has been confirmed in vitro, since the FRCs showed higher proliferative potential compared to DNCs. IFN-y stimulation induced increase DNCs and FRCs expression for cytokines, chemokines, histocompatibility molecules and molecules involved in regulating the immune response.In response to TNF-alfa + IL-1beta stimulation, we observed common molecules expressed by the IFN-? stimulation, however, we also observed expression of cytokines, chemokines and histocompatibility molecules specifically related to this signal in both cells populations. Together, our data suggest that DNCs and FRCs differ in the response profile according to inflammatory stimuli to which they are exposed, increasing the differential expression of molecules involved in the positive and negative regulation of immune response

Orientador: Morgana Rodrigues Guimarães Stabili / Resumo: Curcumin é um composto ativo derivado da planta Curcuma longa que exibe uma variedade de atividades biológicas, potencial anti-inflamatório e imunomodulatório, que pode ser associado ao tratamento de uma série de condições, como doenças inflamatórias intestinais, artrite reumatoide, câncer, diabetes e periodontite. Recentemente, a literatura também tem demonstrado o potencial do composto sobre o reparo ósseo, entretanto, os dados ainda são contraditórios. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da administração tópica do curcumin veiculado em nanopartículas de PLGA sobre a formação/reparo ósseo de defeitos críticos in vivo, e investigar seu potencial biológico in vivo e in vitro. Defeitos ósseos confeccionados na calvária de ratos machos foram preenchidos com solução salina (controle), curcumin nanoparticulado 0,05mg/ml ou veículo utilizado na diluição do composto (nanopartícula vazia) por 7, 14 e 28 dias. A fração de volume ósseo no interior do defeito nos diferentes grupos foram avaliados por microtomografia óssea (μCT); expressão e imunolocalização dos marcadores do turnover tecidual (RANKL, OPG, PCNA e RUNX2) foram investigados por imuno-histoquímica, enquanto as características teciduais do tecido neoformado foram observadas através da análise histológica descritiva e estereometria. In vitro, o potencial do curcumin nanoparticulado em estimular a diferenciação osteogênica de células estromais derivadas da medula óssea (BMSCs) de ratos foi avaliado determinando-se a at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Curcumin is an active compound derived from the Curcuma longa plant that exhibits a variety of biological activities, anti-inflammatory and immunomodulatory potential, which can be associated with the treatment of a number of conditions, such as inflammatory bowel diseases, rheumatoid arthritis, cancer, diabetes and periodontitis. Recently, the literature has also demonstrated the potential of the compound on bone repair, however, the data are still contradictory. The aim of this study is to evaluate the effect of topical administration of curcumin-loaded PLGA nanoparticles on bone formation / repair of critical defects in vivo, and to investigate its biological potential in vivo and in vitro. Bone defects made in the calvaria of rats were filled with saline solution (control), nanoparticulate curcumin 0,05mg/ml, or vehicle used in the dilution of the compound (empty nanoparticle) for 7, 14 and 28 days. The fraction of bone volume within the defect in the different groups was assessed by microcomputed tomography (μCT); expression and immunolocation of tissue turnover markers (RANKL, OPG, PCNA and RUNX2) were investigated by immunohistochemistry, while the tissue characteristics of the newly formed tissue were observed through descriptive histological analysis and stereometry. In vitro, the potential of nanoparticulate curcumin in stimulating osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived stromal cells (BMSCs) was assessed by determining the activity of alkaline phospha... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rogério Martins Amorim / Coorientador: Ana Liz Garcia Alves / Banca: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: Estudos demonstram o grande potencial do uso das células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) como terapia celular. Seu uso em lesões neurológicas, que usualmente apresentam difícil regeneração, tem sido estudado pelo fato das MSCs apresentarem baixa imunogenicidade efeitos imunomoduladores e neuroregenerativos. Nesse contexto, o presente estudo avaliou a viabilidade e a segurança do transplante de MSCs alogênicas provenientes do tecido adiposo, medula óssea e cordão umbilical de equinos, pela via intratecal através do espaço intervertebral C1-C2, por meio de exame neurológico seriado, análises hematológicas e determinação dos níveis séricos de proteínas de fase aguda. Foram utilizados 16 equinos saudáveis, divididos em quatro grupos: grupo SHAM (SHAM) que recebeu o transplante de salina tamponada com fosfato (PBS); grupo tecido adiposo (GTA), recebeu MSCs de origem do tecido adiposo; grupo medula óssea (GMO), recebeu MSCs de origem da medula óssea; e grupo cordão umbilical (GCU), recebeu células de origem da matriz do cordão umbilical. Foram realizadas três aplicações com intervalo de 30 dias em cada grupo, e coletou-se amostras de sangue, nos momentos que antecederam os transplantes, M0, M30 e M60 e 24 horas, após o transplante, M1, M31, M61. E por último foi realizada uma coleta 30 dias após M60, caracterizando M90. Não foram observadas alterações do exame clinico, hematológico e nas proteínas de fase aguda relacionadas aos sucessivos transplantes intratecais de MSC... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Studies demonstrate the great potential of using multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) as cell therapy. Its use in neurological lesions, which usually present difficult regeneration, has been studied because MSCs have low immunogenicity and immunoregulatory and neuroregenerative effects. In this context, the present study evaluated the viability and safety of transplantation of allogeneic MSCs from the adipose tissue, bone marrow and umbilical cord of horses, through the intrathecal route through the C1-C2 intervertebral space, through serial neurological examination, hematological analyzes and determination of serum levels of acute phase proteins. Sixteen healthy horses were used, divided into four groups: SHAM group (SHAM) that received phosphate buffered saline (PBS) transplantation; adipose tissue group (GTA), received adipose tissue MSCs; bone marrow group (GMO), received MSCs from bone marrow origin; and umbilical cord (UGC) group, received cells from the umbilical cord array. M0, M30 and M60 were collected at the time of the transplantation, M1, M31 and M61 and 24 hours after transplantation. And finally a collection was performed 30 days after M60, characterizing M90. There were no changes in the clinical, hematological and acute phase-related proteins related to successive intrathecal transplantations of MSCs, nor were there alterations that contra indicated the use of any of the cellular sources, demonstrating that the protocol used, as well as any of cellula... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Júlio Lopes Sequeira / Resumo: O carcinoma mamário em gatas apresenta comportamento clínico agressivo, com fatores biológicos semelhantes aos tipos triplo-negativo e basal do câncer de mama nas mulheres. O aumento na deposição de fibras colágenas com o passar do tempo representa um fator de risco ao seu desenvolvimento. Existe uma interação dinâmica e mútua entre as células neoplásicas e o estroma do microambiente dos tumores glandulares, com alta atividade biológica na periferia em relação ao centro. Este trabalho objetiva identificar a relação entre a densidade estromal das fibras colágenas (tipo I e III) e a agressividade do carcinoma mamário de gatas, nas regiões periférica e central do tecido, e compará-las segundo classificação histopatológica. Grupo controle representa o tecido saudável, e as 31 amostras de carcinoma mamário foram agrupadas segundo tipos histopatológicos (túbulo-papilífero; sólido; cribriforme), graduações (I, II, e III), e baixo e alto grau. As imagens dos cortes histológicos tratados pelo Picrossirius Red, foram avaliadas pelo Image.J® para obter valor médio de curtose, e pelo MatLab®, para entropia. Analisados estatísticamente pelo GraphPad 5 (GraphPad Software Inc®, La Jolla, CA) ANOVA com variância uniderecional, seguida teste de Bonferroni (p < 0,01). As fibras colágenas formam tipificadas e analisadas de forma descritiva. Houve diferença significativa entre os carcinomas e o tecido saudável em ambas regiões, com aumento da forma madura de colágeno III na porção central. Concl... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Feline mammary carcinoma Breast presents aggressive clinical behavior, with biological factors similar to the triple-negative and baseline types of breast cancer in women. The increase in the deposition of collagen fibers over time represents a risk factor for its development. There is a dynamic and mutual interaction between neoplastic cells and the stroma of the microenvironment of glandular tumors, with high biological activity on the periphery in relation to the center. This work aims to identify the relationship between the stromal density of collagen fibers (types I and III) and the aggressiveness of mammary carcinoma in cats, in the peripheral and central regions of the tissue, and to compare them according to histopathological classification. Control group represents healthy tissue, and the 31 breast cancer samples were grouped according to histopathological types (tubule-papillary; solid; cribriform), gradations (I, II, and III), and low and high grade. The images of the histological sections treated by Picrossirius Red, were evaluated by Image.J® to obtain an average kurtosis value, and by MatLab®, for entropy. Statistically analyzed by GraphPad 5 (GraphPad Software Inc®, La Jolla, CA) ANOVA with one-way variance, followed by Bonferroni test (p< 0.01). Collagen fibers are typified and analyzed in a descriptive way. There was a significant difference between carcinomas and healthy tissue in both regions, with an increase in the mature form of collagen III in the cent... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais são capazes de regenerar diferentes tipos de tecidos, no entanto, a maioria dos métodos para sua obtenção são invasivos. Recentemente, foi descoberta a existência destas células no sangue menstrual. OBJETIVO: Padronizar as técnicas de coleta e transporte do fluido menstrual, bem como a caracterização, isolamento, expansão e criopreservação de células-tronco do fluido menstrual e avaliar a disponibilidade de células tronco mesenquimais no fluido menstrual. MÉTODOS: No período de agosto de 2011 a março de 2012 foram selecionadas 20 voluntárias com ciclo menstrual regular, sem doença ginecológica. O fluido menstrual foi coletado no dia de maior fluxo e submetido a imunofenotipagem e cultivo celular. Foram realizadas duas passagens em meio de cultura até atingir semi-confluência das células-tronco, as quais foram, em seguida, criopreservadas. RESULTADOS: Os parâmetros analisados apresentaram os seguintes valores médios: volume de fluido menstrual 6,90±5,60mL; tempo de transporte 17,20±5,50h; número de células totais 3,95 x106±3,88 x106 com 76,05%±24,57 de células viáveis. Após a cultura, as células mesenquimais aumentaram de 0,14%±0,26 para 96,19%±2,14. Na primeira passagem de cultura, após 15 a 21 dias, as colônias formaram grupos que atingiram a confluência, que a partir da segunda passagem ocorreu em cerca de 3 dias. As células-tronco mesenquimais criopreservadas eram viáveis. CONCLUSÃO: As células-tronco do fluido menstrual podem ser obtidas sem métodos invasivos. O fluido menstrual pode ser transportado em condições ideais de temperatura até 24 horas após a coleta. As células tronco mesenquimais podem ser caracterizadas por imunofenotipagem, isoladas, cultivadas e expandidas e, em seguida, criopreservadas. O fluido menstrual contém células tronco mesenquimais viáveis e apropriadas para cultivo / INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells may renovate different tissues, but techniques to obtain these cells are invasive. Recently, those cells were detected in menstrual blood. OBJECTIVE: Patterning techniques of collection, transportation, characterization, isolation, expansion and cryopreservation of stem cells in menstrual fluid. METHODS: From August 2011 to March 2012 twenty volunteers were selected with regular menstrual cycle without gynecological diseases. They collected menstrual fluid on the most intense flux day to analysis by immunophenotyping and cellular culture. Culture was made in 2 stages until reached semi-confluence of stem cells and these cells were cryopreserved. RESULTS: Average of menstrual fluid volume was 6,90±5,60mL, transportation time was 17,20±5,50h, and total number of cells was 3,95 x106±3,88 x106 witch 76,05%±24,57 were viables. After culture, mesenchymal stem cells increased from 0,14%±0,26 to 96,19%±2,14. After 15 to 21 days of culture in first passage, colonies formed clusters that reached confluence. In second passage, it happens after 3 days of culture and stem cells were cryopreserved. CONCLUSION: Stem cells of menstrual fluid may be easily obtained without invasive methods. Menstrual fluid can be transported in good conditions of temperature up to 24 hours of collection. Mesenchymal stem cells of menstrual fluid may be characterized by immunophenotyping, as well as it is possible to isolated, cultivate and cryopreserved them. Menstrual fluid has viable and proper for culture mesenchymal stem cells

A heterogeneidade entre as células tumorais e o suporte a elas proporcionado pelos componentes do microambiente tumoral (TME) são os dois principais responsáveis pela progressão do câncer e por tornar essas doenças essencialmente incuráveis. Assim, identificar as principais dependências das células malignas, sejam elas internas ou advindas do meio extracelular, é fundamental para entender seu comportamento e propor terapias mais eficientes. Nesta tese, abordamos aspectos destas duas questões separadamente. Em um primeiro trabalho, investigamos as interações de células tumorais com células-tronco mesenquimais (MSCs), um dos principais componentes do TME. MSCs participam ativamente do nicho tumoral, especialmente por serem capazes de liberar uma vasta gama de moléculas que, via sinalização parácrina, podem modular as células ao seu redor. No entanto, os principais mediadores e respectivos efeitos do secretoma dessas células nos tumores ainda precisam ser melhor elucidados. Ao investigar esses efeitos em glioblastomas (GBM), um dos tumores primários mais agressivos em adultos, mostramos que o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) foi capaz de bloquear a autofagia das células malignas. Nossos dados revelaram que o secretoma de hADSCs ativou a via de sinalização de mTORC1 e reduziu a translocação nuclear de TFEB, um fator de transcrição chave que regula a autofagia e a a função lisossomal, nas células de GBM, impedindo que o fluxo autofágico fosse completado. Já em um segundo trabalho, no contexto da heterogeneidade celular em tumores, propusemos uma abordagem para análise de dados de céulas únicas focada em outliers. Minorias celulares com níveis anormalmente elevados, ou reduzidos, de expressão de determinados genes ou proteínas são em muitos casos responsáveis por resistir aos tratamentos e levar à recidiva da doença, ao mesmo tempo que, por serem outliers, são muitas vezes ignoradas ou excluídas das análises de dados. Assim, decidimos utilizar métodos estatísticos em dados de expressão de células únicas para detectar e analisar células outliers, comparando o seu comportamento com as demais células não-outliers. Denominamos essa abordagem de Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) e a testamos em dados de células tumorais avaliadas por citometria de massas e por sequenciamento de RNA de células únicas (sc-RNA-seq). Como resultado, pudemos confirmar que, especialmente diante de determinados tratamentos, células outliers podem se comportar de maneira distinta de não-outliers, revelando informações potencialmente relevantes ao desenvolvimento de estretégias terapêuticas. Por fim, desenvolvemos uma ferramenta para automatizar a detecção e seleção de outliers em dados de célula única a fim de facilitar o estudo dessas células em diversos aspectos na pesquisa do câncer. / Intratumoral heterogeneity and the support provided by components of the tumor microenvironment (TME) to malignant cells are major contributors to cancer progression, and the two main factors that make this disease essentially incurable. Thus, identifying malignant cells dependencies, either in the intra- or extracellular environment, is fundamental to understand their behavior and propose more efficient therapies. In this thesis, we approached aspects of these two issues separately. In a first work, we investigated interactions between tumors and mesenchymal stem cells (MSCs), one of the main components in the TME. MSCs actively participate in the tumor niche, especially due to their capacity of releasing a wide range of molecules that can modulate cells in their surroundings. However, little is known about the effects of MSCs-derived molecules in tumor cells behavior. In investigating these effects on glioblastomas (GBM), one of the most aggressive primary tumors in adults, we found out that the secretome of human adipose-derived stromal cells (hADSCs) was able to block autophagy in malignant cells. Our data revealed that hADSCs secretome activated mTORC1 signaling pathway and reduced nuclear translocation of TFEB, a master transcription factor that regulates autophagy and lysosomal function, in GBM cells, preventing autophagic flux from being completed. In a second work, we addressed intratumoral heterogeneity by proposing an approach to analyze outliers in single cell data. Cellular minorities with abnormally high, or low, expression levels of certain genes or proteins are in many cases responsible for resisting treatments and lead to disease relapse, while for being outliers they are also frequently ignored or excluded from data analysis. Thus, we decided to apply statistical methods on single cell expression data to detect outliers and analyze them, comparing their behavior with the remaining non-outlier cells. We called this approach Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) and tested it on tumor cell datasets obtained from mass cytometry and single cell RNA sequencing (scRNA-seq) experiments. Using SCOUT we were able to confirm that, especially upon specific treatments, outlier cells may behave differently from non-outliers, revealing potentially relevant information to aid in the development of novel therapeutic strategies. Finally, we developed a tool to automate detection and selection of outliers in single cell data with the aim to facilitate the study of these cells under different contexts in cancer research.

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

Orientador: Rui Seabra Ferreira Júnior / Resumo: Terapias efetivas de lesões na dura-máter representam um enorme desafio à medicina, devido à dificuldade de suturas com êxito e de vedação das meninges, aumentando os índices de mortalidade e morbidade destes pacientes. Biomateriais que possam favorecer a regeneração e impedir o extravasamento de líquido cefalorraquidiano sem produzir efeitos adversos são alvos da indústria farmacêutica. Este estudo avaliou a biocompatibilidade do Biopolimero de Fibrina (BPF) derivado de peçonha de serpente como arcabouço tridimensional para células-tronco mesenquimais (CTMs) em lesões na dura-máter de ratos wistar (Rattus norvegicus). As CTMs foram caracterizadas na quinta passagem por citometria de fluxo (ICAM, CD90, CD34, CD45, CD11b) e diferenciadas em linhagens osteogênica e adipogênica. Foram utilizados 4 grupos (n=20) de ratos Wistar machos adultos. O grupo C (controle) foi submetido à durotomia. Os grupos tratados foram submetidos à durotomia seguido de: Tratamento com Biopolimero de fibrina (BPF); células-tronco mesenquimais (CTMs); e BPF+CTMs, formado pela associação do Biopolimero de fibrina e células-tronco mesenquimais. As CTMs marcadas e associadas ao BPF foram avaliadas por imageamento da fluorescência in vivo. Os animais foram avaliados neurológica e clinicamente quanto à sensibilidade dolorosa, deiscência de pontos, infecção da ferida, consumo de alimento e água e habilidades motoras. Foram realizadas eutanásias dos animais aos 7 e 28 dias após cirurgia e coletado material pa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Effective therapies to treat dura mater injuries represents a major challenge to medicine due to its lack of sutures with high seal properties upon meninges, increasing the rate of mortality and morbidity among these patients. Biomaterials that promotes regeneration and prevent extravasation of cerebrospinal fluid, without producing adverse effects, are targets of the pharmaceutical industry. The present study aimed to evaluate the biocompatibility of the use on Fibrin Biopolymer (FBP) derived from snake venom as tridimensional scaffold to mesenchymal stem cells (MSC) on rat’s dura mater injury. Mesenchymal stem cells characterization was performed at fifth passage by flow cytometry (ICAM, CD90, CD34, CD45, CD11b) and differentiated into osteogenic and adipogenic lineages. Four groups (n=20) os male Wistar rats were used. Group C (control) animals were submitted to durotomy only. Treatment groups were submitted to durotomy followed by: Fibrin Biopolymer (FBP); mesenchymal stem cells (MSC); and FBP+MSCs, consisting on the association between fibrin biopolymer and mesenchymal stem cells. Marked MSCs associated to FBP were evaluated through in vivo fluorescence imaging. Animals were evaluated neurologically and clinically regarding pain sensitivity, dehiscence of suture, wound infection, feeding e motor capacity parameters. Animals were euthanized at seven and 28 days after surgical procedure, and biological material was collected to histological and proteomic analysis. Protein ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Leonardo Perez Faverani / Coorientadora: Roberta Okamoto / Banca: Daniela Ponzoni / Banca: Ellen Cristina Gaetti Jardim / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar um novo método de texturização por PEO com incorporação de Ca e P na superfície do Ti-6Al-4V em ossos de baixa densidade, por meio de avaliação in vitro, ex-in vivo e in vivo, em função de parâmetros topográficos e reparacionais. 57 ratas Wistar (Rattus novergicus), sendo 38 ratas com 6 meses de idade (Grupos OXV - submetidas à ovariectomia e SHAM - cirurgia fictícia) e 19 ratas senis (18 meses de idade: Grupo SENIL), foram divididas para realização do estudo ex-in vivo (n=9) e in vivo (n=48). Os grupos para análise ex-in vivo foram submetidos à eutanásia e os fêmures foram removidos e transportados em meio de cultura contendo meio essencial mínimo modificação alfa (α- MEM) suplementado com 500 µg/mL de gentamicina e 3 µg/mL de fungisona. As células-tronco mesenquimais de medula óssea (CTMs-MO) dos fêmures, foram isoladas e cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas em 3 superfícies de discos de Ti-6Al-4V, grupo CONTROLE (superfície usinada) grupo AC (superfície tratada por Ataque Ácido e Jateamento) e grupo PEO (superfície tratada por Oxidação de Plasma Eletrolítico com associação de Cálcio e Fosforo). Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteina óssea (BSP) e osteopontina (OPN), atividade da fosfatase alcalina (ALP) e formação de matriz mi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate a new PEO texturing method with Ca and P incorporation on the Ti-6Al-4V surface in low bone density, by means of in vitro, ex vivo and in vivo evaluation through topographic and repairment parameters. 57 Wistar rats (Rattus novergicus), being 38 at 6 months of age (OXV Groups - submitted to ovariectomy and SHAM surgery) and 19 senile rats (18 months of age: SENIL Group) were divided into three subgroups: ex-in vivo (n = 9) and in vivo (n = 48). The Groups for ex-in vivo analysis were euthanized and femurs were removed and transported in culture medium containing minimal alpha modification (α- MEM) medium supplemented with 500 μg / ml gentamicin and 3 μg / ml fungizone. The mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC-M) of the femur were isolated and cultured in growth medium to remain as MSCs. After reaching the subconfluence, the cells were grown on 3 surfaces of Ti-6Al-4V discs, CONTROL group (machined surface) group AC (surface treated by etched-acid) and PEO group (surface treated by Electrolytic Plasma Oxidation with the association of Calcium and Phosphorus). Cell viability assays, gene expression of osteoblastic markers, bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), alkaline phosphatase (ALP) activity, and mineralized matrix formation were performed to evaluate cellular responses. Data were submitted to ANOVA 1 factor test or Kruskal-Wallis test (P <0.05). In the groups for the in vivo study, after 90 days, an implant was i... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre