RIBEIRO, João Crispim Moraes Lima. Avaliação do efeito do LASSBio-596, um análago da talidomida, na angiogênese inflamatória em córnea de coelho. 2011. 72 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-02-27T14:31:57Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_jcmlribeiro.pdf: 1224445 bytes, checksum: 0f6035c05cbdc2971d8b5f67e9c84c94 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-02-27T14:33:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_jcmlribeiro.pdf: 1224445 bytes, checksum: 0f6035c05cbdc2971d8b5f67e9c84c94 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-27T14:33:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_jcmlribeiro.pdf: 1224445 bytes, checksum: 0f6035c05cbdc2971d8b5f67e9c84c94 (MD5) Previous issue date: 2011 / There is exacerbation of the angiogenic process in various diseases, especially in corneal neovascularization. For the treatment of these diseases, several drugs were studied with antiangiogenic properties. The aim of this study was to evaluate the effect of LASSBio-596, structurally designed as a hybrid of thalidomide, sildenafil and arilsulfonamide, on inflammatory corneal angiogenesis. Eighteen rabbits were submitted to an alkaline cauterization in the right cornea. The animals were randomly allocated in three groups: vehicle, dexamethasone, and LASSBio-596 group. Drugs were administrated by eye drops three times per day for 21 days. Evaluations were performed on days 3, 6, 9, 12, 15, 18, and 21 post-cauterization. At these time points, digital images of the cornea were captured in a standard fashion. Angiogenic response was measured using software that was developed specifically for this purpose. It calculated the following parameters: neovascularization area (NA), total vascular length (TVL), and blood vessel number (BVN). It was observed that dexamethasone significantly decreased NA, TVL, and BVN during all assessments. From NA it was calculated the angiogenesis rate (AR) in each group. Therefore, dexamethasone completely inhibited the inflammatory corneal angiogenesis with angiogenesis rate (AR) of -0.001 ± 0.006 mm2/day, which was significantly lower (p < 0.001) than that observed after treatment with vehicle (0.078 ± 0.024 mm2/dia) and LASSBio-596 (0.054 ± 0.012 mm2/dia). Although LASSBio-596 reduced angiogenesis in relation to vehicle, according to NA, TVL and BVN values, this difference was not statistically significant. However, it was found that the AR as measured in the LASSBio-596 group was significantly lower (p < 0.05) than that seen in control animals, indicating a potential antiangiogenic effect. We conclude that topical application of LASSBio-596 at 1.0% has a partial inhibitory effect on inflammatory corneal angiogenesis in rabbits. / Observa-se exacerbação do processo angiogênico em diversas doenças, entre elas pode ser citada a neovascularização de córnea. Para o tratamento dessas doenças, são estudados diversos fármacos com propriedades antiangiogênicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do fármaco LASSBIO-596, estruturalmente designado como um híbrido da talidomida, sildenafil e arilsulfonamida, na angiogênese corneana inflamatória. Dezoito coelhos foram submetidos a uma cauterização alcalina pontual na região superior da córnea direita. Os animais foram randomicamente alocados em três grupos: veículo, dexametasona 4,0% e LASSBio-596 1,0%. Os tratamentos foram administrados em forma de colírio três vezes por dia durante 21 dias. Avaliações foram realizadas nos dias 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 pós-cauterização. Nesses momentos, imagens digitalizadas da córnea foram capturadas de uma forma padronizada. A resposta angiogênica foi mensurada utilizando-se um software que foi desenvolvido especificamente para esta finalidade. Foram calculados os seguintes parâmetros: área de neovascularização (AN), comprimento vascular total (CT) e número de vasos sanguíneos (NV). A partir da AN, calculou-se a taxa de angiogênese (TA) em cada grupo estudado. Observou-se que a dexametasona diminuiu significativamente AN, CT e NV durante todas as avaliações. Portanto, a dexametasona inibiu completamente a angiogênese inflamatória da córnea com uma TA de -0,001 ± 0,006 mm2/dia, que foi significativamente menor (p < 0,001) do que a observada após o tratamento com o veículo (0,078 ± 0,024 mm2/dia) e LASSBio-596 (0,054 ± 0,012 mm2/dia). Apesar de o LASSBio-596 ter reduzido o processo de angiogênese em relação ao veículo, conforme AN, CT e NV, essa diferença não foi estatisticamente significante. No entanto, verificou-se que a TA medida no grupo LASSBio-596 foi significativamente menor (p < 0,05) do que a observada nos animais controle, indicando um potencial efeito antiangiogênico. Concluímos que a aplicação tópica de LASSBio-596 a 1,0% tem um efeito inibitório parcial sobre a angiogênese corneana inflamatória em coelhos.

COSTA, Patrícia Marçal da. Avaliação do potencial antitumoral e antiangiogênico de novos análogos ftalimídicos da talidomida. 2011. 147 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-05T13:43:59Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_pmcosta.pdf: 6733805 bytes, checksum: 2df0bf508787f29942832caf4924eb1a (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-06T12:26:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_pmcosta.pdf: 6733805 bytes, checksum: 2df0bf508787f29942832caf4924eb1a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-06T12:26:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_pmcosta.pdf: 6733805 bytes, checksum: 2df0bf508787f29942832caf4924eb1a (MD5) Previous issue date: 2011 / The thalidomide was previously used to relieve gastric discomforts during pregnancy, and currently it is used for cancer treatment and inflammatory illnesses. Various phthalimides analogues of thalidomide have been researched for its antiangiogenic and immunemodulatory activity. In previous studies, these analogues showed absence of immunesuppressor activity. In this context, this work initially determined the cytotoxic activity of eight phthalimides analogues of thalidomide, in a series of cancer cell lines and of isolated peripheral mononuclear blood cells (PMBC) after 72h of incubation. None of compounds revealed cytotoxic activity in vitro in cancer cell lines and hemolytic activity towards of PBMC. They also showed no potential damage to the DNA strand, therefore they were not considered genotoxic towards human PMBC. The antitumor effect (in vivo) of thalidomide along with eight analogues was analyzed in mice transplanted with the Sarcoma 180 tumor and treated in a dose of 50mg/Kg/7 days, i.p. The inhibition of the tumor growth was only significant in mice treated with thalidomide (53.5%) and the analogues SC-10 and SC-11 (67.9% and 67.4%, respectively), p< 0,05. The histopathological analysis of the animals’ organs showed mainly that thalidomide and its analogues cause moderate toxic effects, mostly in the liver, but these can be considered reversible. The studies concerning the mechanism of action were deepened using isolated cells from the Sarcoma 180, after 72 hours of incubation, in the doses of 10, 50 and 100µg/mL. The following flow cytometry assays were carried out: 1- Evaluation of the membrane integrity, cellular viability and concentration of cells; 2- Determination of the nuclear DNA content. All the compounds led to the loss of membrane cell integrity and it was found internucleossomal DNA fragmentation in the higher concentrations, indicating the presence of cells with late stage apoptotic characteristics or in the process of secondary necrosis. The evaluation of the antiangiogenic potential, with the Wound Healing assay revealed that for the endothelial cell line (HUVEC) the analogue SC-10 caused a greater inhibition (65.28% ± 1,58), whereas in the tumor cell line the highest effect was of the analogue SC-11 (98.51% ± 0,25). The thalidomide was not capable of reducing cellular migration in none of the tested cell lines. In the chorioallantoic membrane assay (CAM), an antiangiogenic potential was observed with analogous SC-10 and SC-11 (5mg/mL), where there was an inhibition in the number of vessels (12, 88% ± 2,3 and 14.81% ± 3,3), the area of neovascularization (13.14% ± 1,7 and 14.26% ± 1,7) and the total length of vessels in mm2 (9.19% ± 1,5 and 9.86% ± 1,9). The thalidomide was not capable of inhibiting embryonic vascularization. The antitumor effect (in alive) of thalidomide and the analogues SC-10 and SC-11 was analyzed in mice transplanted with the Sarcoma 180 tumor, treated with the dose of 50mg/Kg/10 days, i.p. It was observed inhibition of the tumor growth in the thalidomide treatment (56,6%) and for analogues SC-10 and SC-11 (48.2% and 41.3%, respectively), p< 0,05. The immunostaining of intratumor endothelial cells with CD-31, showed, in the form of microvascular density, reduction in the groups treated with analogues SC-10 and SC-11 (64.59% and 46.51%), but not in the groups treated with thalidomide. These results, along with previous studies of immunemodulation suggest antitumor and antiangiogenic immunity, T cells dependent, for the phthalimides analogues. / A talidomida, anteriormente usada para aliviar desconfortos gástricos da gravidez, atualmente é usada para tratamento do câncer e de doenças inflamatórias. Vários análogos ftalimídicos da talidomida tem sido pesquisados quanto a sua atividade antiangiogênica e imunomodulatória. Em estudos prévios, estes análogos mostraram ausência de atividade imunossupressora. O trabalho determinou, inicialmente, a atividade citotóxica, de oito análogos ftalimídicos da talidomida, frente a linhagens tumorais e de células mononucleadas isoladas de sangue periférico (CMSP) após 72h de incubação. Nenhum dos compostos desencadeou atividade citotóxica in vitro, indução de hemólise em eritrócitos e potencial em induzir dano à fita de DNA, portanto não foram genotóxicos em CMSP humanas. O efeito antitumoral (in vivo) da talidomida e dos oito análogos foi analisado em camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180 e tratados na dose 50mg/Kg/7 dias, via i.p. A inibição do crescimento tumoral foi significante apenas para talidomida (53,5%) e análogos SC-10 e SC-11 (67,9% e 67,4%, respectivamente), p<0,05. A análise histopatológica dos órgãos dos animais mostrou que a talidomida e seus análogos provocam efeitos tóxicos moderados, principalmente no fígado, mas esses podem ser considerados como reversíveis. Os estudos acerca do mecanismo de ação foram aprofundados usando células isoladas do Sarcoma 180, após 72 horas de incubação, nas doses de 10, 50 e 100µg/mL, por citometria de fluxo, através dos seguintes ensaios: 1- Avaliação da integridade de membrana, viabilidade celular e concentração de células; 2- Determinação do conteúdo de DNA nuclear da célula. Todos os compostos induziram a perda de integridade de membrana celular e fragmentação internucleossomal do DNA nas maiores concentrações, indicando presença de células apoptóticas em estágios finais ou em processo de necrose secundária. A avaliação do potencial antiangiogênico, pelo ensaio do Wound Healing revelou que para a linhagem endotelial (HUVEC) o análogo SC-10 causou uma inibição maior (65,28% ± 1,58), enquanto que na linhagem tumoral o efeito maior foi do análogo SC-11 (98,51% ± 0,25). A talidomida não foi capaz de reduzir a migração celular em nenhuma das linhagens testadas. No ensaio da membrana corioalantóide (CAM), potencial antiangiogênico foi observado para os análogos SC-10 e SC-11(5mg/mL), que inibiram o número de vasos (12, 88% ± 2,3 e 14,81% ± 3,3), a área de neovascularização (13,14% ± 1,7 e 14,26% ± 1,7) e o comprimento total de vasos em mm2 (9,19% ± 1,5 e 9,86% ± 1,9). A talidomida, não foi capaz de inibir a vascularização embrionária. O efeito antitumoral (in vivo) da talidomida e análogos SC-10 e SC-11 foi analisado em camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, tratados na dose 50mg/Kg/10 dias, via i.p. A inibição do crescimento tumoral para a talidomida (56.6%) e para os análogos SC-10 e SC-11 (48,2% e 41,3%, respectivamente), p<0,05. A imunocoloração de células endoteliais intratumorais com CD-31, revelou-se, na forma de densidade microvascular, diminuída nos grupos tratados com análogos SC-10 e SC-11 (64,59% e 46,51%), mas não nos grupos tratados com a talidomida. Estes resultados, unidos a estudos prévios de imunomudulação sugerem imunidade antitumoral e antiangiogênica, dependente de células T, para os análogos ftalimídicos.

OBJETIVO: demonstrar as alterações histológicas secundárias ao uso de bevacizumabe na aorta descendente de suínos submetida à interrupção dos vasa vasorum. MATERIAIS E MÉTODOS: em doze suínos, divididos em grupos tratamento e controle (n=6 cada) foi realizada dissecção por 5 cm da aorta torácica, ligadura das artérias intercostais e cobertura com polivinil; o grupo tratamento recebeu uma dose endovenosa única de bevacizumabe. Após quinze dias, os animais foram sacrificados para retirada da artéria e preparo das lâminas histológicas dos grupos tratamento, controle e área não manipulada dos dois grupos. As lâminas foram analisadas com relação aos graus de angiogênese, injúria, inflamação e espessamento intimal. A análise estatística foi conduzida através da média e do desvio-padrão dos escores e as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. Para obtenção de intervalos de confiança de 95% para as médias das contagens dos escores utilizou-se a distribuição de Poisson, a fim de determinar o efeito estatístico. RESULTADOS: o bevacizumabe causou parefeitos em todos os suínos tratados, com um óbito. As variáveis analisadas através da Escala de Magnitude para Efeito Estatístico, demonstram tendência de redução da angiogênese e da injúria e de aumento da inflamação no limite do moderado. Não ocorreu modificação do espessamento intimal entre os grupos. CONCLUSÃO: a medicação utilizada na lesão da parede arterial induzindo hipóxia, mostrou tendência de redução da angiogênese e da injúria, mas não reduziu o processo inflamatório ou o espessamento intimal da parede arterial. O bevacizumabe mostrou toxicidade no modelo suíno. / OBJECTIVE: To demonstrate histological changes secondary to the use of bevacizumab in the descending aorta of pigs after interruption of vasa vasorum flow. METHODS: Twelve pigs were divided into control and treatment groups (n = 6 each). It was performed a 5-cm dissection of the thoracic aorta, ligation of the intercostal arteries and protection with polyvinyl chloride. Pigs in the treatment group received a single intravenous dose of bevacizumab. After 15 days, the animals were euthanized and the aorta removed. Histological slides were prepared for control and treatment groups and for the non-surgically manipulated part of the aorta in both groups. The slides were analyzed for the degree of angiogenesis, injury, inflammation, and intimal thickening. Data were expressed as mean (SD) of scores and groups were compared using the Mann-Whitney test. The Poisson distribution was used to calculate 95% confidence intervals for the mean scores in order to determine effect statistics. RESULTS: Bevacizumab had adverse effects on all treated pigs, leading to one death. The analysis using a scale of magnitudes for effect statistics showed a trend toward a decrease in angiogenesis and injury and an increase in inflammation for moderate effects. There was no change in intimal thickening in either group. CONCLUSION: The medication used for arterial wall injury inducing hypoxia showed a trend toward reduced angiogenesis and injury, but with no reduction in the inflammatory process or intimal thickening of the arterial wall. Bevacizumab showed toxicity in the porcine model.

OBJETIVO: demonstrar as alterações histológicas secundárias ao uso de bevacizumabe na aorta descendente de suínos submetida à interrupção dos vasa vasorum. MATERIAIS E MÉTODOS: em doze suínos, divididos em grupos tratamento e controle (n=6 cada) foi realizada dissecção por 5 cm da aorta torácica, ligadura das artérias intercostais e cobertura com polivinil; o grupo tratamento recebeu uma dose endovenosa única de bevacizumabe. Após quinze dias, os animais foram sacrificados para retirada da artéria e preparo das lâminas histológicas dos grupos tratamento, controle e área não manipulada dos dois grupos. As lâminas foram analisadas com relação aos graus de angiogênese, injúria, inflamação e espessamento intimal. A análise estatística foi conduzida através da média e do desvio-padrão dos escores e as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. Para obtenção de intervalos de confiança de 95% para as médias das contagens dos escores utilizou-se a distribuição de Poisson, a fim de determinar o efeito estatístico. RESULTADOS: o bevacizumabe causou parefeitos em todos os suínos tratados, com um óbito. As variáveis analisadas através da Escala de Magnitude para Efeito Estatístico, demonstram tendência de redução da angiogênese e da injúria e de aumento da inflamação no limite do moderado. Não ocorreu modificação do espessamento intimal entre os grupos. CONCLUSÃO: a medicação utilizada na lesão da parede arterial induzindo hipóxia, mostrou tendência de redução da angiogênese e da injúria, mas não reduziu o processo inflamatório ou o espessamento intimal da parede arterial. O bevacizumabe mostrou toxicidade no modelo suíno. / OBJECTIVE: To demonstrate histological changes secondary to the use of bevacizumab in the descending aorta of pigs after interruption of vasa vasorum flow. METHODS: Twelve pigs were divided into control and treatment groups (n = 6 each). It was performed a 5-cm dissection of the thoracic aorta, ligation of the intercostal arteries and protection with polyvinyl chloride. Pigs in the treatment group received a single intravenous dose of bevacizumab. After 15 days, the animals were euthanized and the aorta removed. Histological slides were prepared for control and treatment groups and for the non-surgically manipulated part of the aorta in both groups. The slides were analyzed for the degree of angiogenesis, injury, inflammation, and intimal thickening. Data were expressed as mean (SD) of scores and groups were compared using the Mann-Whitney test. The Poisson distribution was used to calculate 95% confidence intervals for the mean scores in order to determine effect statistics. RESULTS: Bevacizumab had adverse effects on all treated pigs, leading to one death. The analysis using a scale of magnitudes for effect statistics showed a trend toward a decrease in angiogenesis and injury and an increase in inflammation for moderate effects. There was no change in intimal thickening in either group. CONCLUSION: The medication used for arterial wall injury inducing hypoxia showed a trend toward reduced angiogenesis and injury, but with no reduction in the inflammatory process or intimal thickening of the arterial wall. Bevacizumab showed toxicity in the porcine model.

OBJETIVO: demonstrar as alterações histológicas secundárias ao uso de bevacizumabe na aorta descendente de suínos submetida à interrupção dos vasa vasorum. MATERIAIS E MÉTODOS: em doze suínos, divididos em grupos tratamento e controle (n=6 cada) foi realizada dissecção por 5 cm da aorta torácica, ligadura das artérias intercostais e cobertura com polivinil; o grupo tratamento recebeu uma dose endovenosa única de bevacizumabe. Após quinze dias, os animais foram sacrificados para retirada da artéria e preparo das lâminas histológicas dos grupos tratamento, controle e área não manipulada dos dois grupos. As lâminas foram analisadas com relação aos graus de angiogênese, injúria, inflamação e espessamento intimal. A análise estatística foi conduzida através da média e do desvio-padrão dos escores e as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. Para obtenção de intervalos de confiança de 95% para as médias das contagens dos escores utilizou-se a distribuição de Poisson, a fim de determinar o efeito estatístico. RESULTADOS: o bevacizumabe causou parefeitos em todos os suínos tratados, com um óbito. As variáveis analisadas através da Escala de Magnitude para Efeito Estatístico, demonstram tendência de redução da angiogênese e da injúria e de aumento da inflamação no limite do moderado. Não ocorreu modificação do espessamento intimal entre os grupos. CONCLUSÃO: a medicação utilizada na lesão da parede arterial induzindo hipóxia, mostrou tendência de redução da angiogênese e da injúria, mas não reduziu o processo inflamatório ou o espessamento intimal da parede arterial. O bevacizumabe mostrou toxicidade no modelo suíno. / OBJECTIVE: To demonstrate histological changes secondary to the use of bevacizumab in the descending aorta of pigs after interruption of vasa vasorum flow. METHODS: Twelve pigs were divided into control and treatment groups (n = 6 each). It was performed a 5-cm dissection of the thoracic aorta, ligation of the intercostal arteries and protection with polyvinyl chloride. Pigs in the treatment group received a single intravenous dose of bevacizumab. After 15 days, the animals were euthanized and the aorta removed. Histological slides were prepared for control and treatment groups and for the non-surgically manipulated part of the aorta in both groups. The slides were analyzed for the degree of angiogenesis, injury, inflammation, and intimal thickening. Data were expressed as mean (SD) of scores and groups were compared using the Mann-Whitney test. The Poisson distribution was used to calculate 95% confidence intervals for the mean scores in order to determine effect statistics. RESULTS: Bevacizumab had adverse effects on all treated pigs, leading to one death. The analysis using a scale of magnitudes for effect statistics showed a trend toward a decrease in angiogenesis and injury and an increase in inflammation for moderate effects. There was no change in intimal thickening in either group. CONCLUSION: The medication used for arterial wall injury inducing hypoxia showed a trend toward reduced angiogenesis and injury, but with no reduction in the inflammatory process or intimal thickening of the arterial wall. Bevacizumab showed toxicity in the porcine model.

Submitted by Suzana Dias (suzana.dias@famerp.br) on 2018-10-19T20:34:14Z No. of bitstreams: 1 CarlosHenriqueViésidoNascimentoFilho_tese.pdf: 4165435 bytes, checksum: e1126fdbe7f8fe5e5640b7a27f4c69e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-19T20:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosHenriqueViésidoNascimentoFilho_tese.pdf: 4165435 bytes, checksum: e1126fdbe7f8fe5e5640b7a27f4c69e2 (MD5) Previous issue date: 2018-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common malignancies worldwide. Antiangiogenic drugs are a conventional treatment, although it has been shown to stimulate hypoxic areas inside the tumor, and hypoxia has been associated with metastasis as well as accumulation of cancer stem cell (CSC) in breast cancer. Objective: To study the effects of hypoxia on HNSCC behavior and accumulation of cancer stem cell. Material and methods: Culture of HN6, HN12 and HN13 tumor cells under hypoxic conditions was carried out for 6hrs, 12hrs, and 24hrs under an O2 concentration of 1%. The content of cancer stem cell was determined using Aldefluor assay according to the manufacturer's (STEMCELL Technologies) to detect ALDH1A1Bright cells in combination with APC mouse anti-human CD44. Tumor invasion under hypoxic conditions was carried out using Millicell Cell Culture Inserts (Millipore, Billerica, MA, USA). Control tumor cells were maintained in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics at normoxia levels (~21% of O2), while hypoxia group was maintained at 1% of O2. We used a PTEN inhibitor (BPV) concentrations of 1nM, 5nM, and 10nM. Results: PTEN expression is downregulated under hypoxic conditions. Hypoxia-induced PTEN downregulation triggered an epithelial-mesenchyme transition (EMT) phenotype and accumulation of CSC. Plus, we showed antagonistic expression of PTEN and HIF-1α when targeted disruption of PTEN (shPTEN HN13 cell line) strongly suggesting that loss of PTEN activates the PI3K/mTOR pathway in association with HIF-1αupregulated. Validation of our results in xenograft animal models showed colocalization of ALDH1A1Bright cells and hypoxic areas along with the loss of nuclear localization of PTEN. Conclusion: Thus, we show that hypoxia-driven downregulation of PTEN plays a crucial role in tumor aggressiveness and that the potential use of CSC-targeted therapies should be considered during the administration of anti-angiogenic drugs to minimize tumor resistance. / O câncer de cabeça e pescoço (CCP) é a sexta neoplasia mais comum no mundo. Os fármacos antiangiogênicos constituem um tratamento efetivo na redução da massa tumoral, porém estimulam áreas de hipóxia no interior do tumor. O aumento de áreas em hipóxia tem sido associado às metástases e ao acúmulo de células-tronco tumorais (CTT) no câncer de mama. Objetivos: Com base nestas evidências, o presente estudo avaliou os efeitos da hipóxia no comportamento de células de CCP e verificou o acúmulo de CTT. Material e métodos: As linhagens celulares HN6, HN12 e HN13 foram cultivadas em condições de hipóxia por 6, 12 e 24 horas, sob uma concentração de O2 menor que 2%. As CTT foram identificadas por meio da determinação de elevados níveis do conteúdo enzimático aldehyde dehydrogenases (ALDH1A1Bright), utilizando o Kit Aldefluor, em combinação com elevados níveis de CD44, uma glicoproteína de superfície celular, conjugado com o fluoróforo allophycocyanin (APC). O ensaio de invasão tumoral sob condições de hipóxia foi realizado utilizando Millicell Cell Culture Inserts. Como controle foram utilizadas células tumorais mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB e 1% de antibiótico, em níveis de normóxia (~21% de O2). O composto bisperoxovanadium (BPV), um inibidor de tirosino fosfatase, foi utilizado nas concentrações de 1nM, 5nM e 10 nM para reduzir os níveis celulares de PTEN. Complementar ao tratamento com BVP foi realizado o silenciamento gênico utilizando segmentação direcionada de PTEN (linhagem celular shPTEN HN13 e como controle pGIPZ). Resultados: Os resultados apontam uma menor expressão do PTEN durante condições de hipóxia. Demonstrou-se a expressão antagonista de PTEN e HIF-1α por meio do silenciamento gênico com a segmentação direcionada, sugerindo, fortemente, que a perda de PTEN ativa a via PI3K/mTOR em associação com a alta expressão de HIF-1α. Além da regulação negativa do PTEN pela hipóxia, foi identificado o desencadeamento do processo epitélio-mesênquimal (EMT) em combinação com o acúmulo de CTT. A validação dos resultados em modelos animais de xenoenxerto evidenciou a co-localização de células ALDH1A1 positivas em áreas de hipóxia juntamente com a perda da expressão nuclear de PTEN. Conclusão: Este trabalho mostrou que a regulação negativa do PTEN durante períodos de hipóxia desempenha um papel fundamental no acúmulo de CTT e aumento da agressividade tumoral. Os resultados indicam que o tratamento para CCP utilizando agentes antiangiogênicos deve ser pareado com terapias voltadas à destruição de CTT, minimizando, assim, a aquisição de um fenótipo de resistência tumoral.

Submitted by Suzana Dias (suzana.dias@famerp.br) on 2018-11-09T18:31:25Z No. of bitstreams: 1 JessicaHelenaPires_dissert.pdf: 3617808 bytes, checksum: 1df14ad1ee40275580d520f969311d14 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-09T18:31:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JessicaHelenaPires_dissert.pdf: 3617808 bytes, checksum: 1df14ad1ee40275580d520f969311d14 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Breast cancer represents the second type of tumor that has the highest mortality rates, being the most common among women. The causes of these high mortality rates are related to high proliferation and metastasis, and for tumor progression, the growth of new blood vessels, angiogenesis is required. This event can be stimulated by several factors, such as insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R), hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Several molecules are involved in the control of angiogenesis such as melatonin and microRNAs (miRNAs). The miRNAs can induce the gene silencing of genes related to angiogenesis by pairing with certain specific messenger RNA (mRNA), resulting in the degradation of this molecule. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine), the main hormone produced and secreted by the pineal gland, has several physiological functions and a proven antiangiogenesis action. This hormone can regulate miRNAs and genes related to this process. Objective: To evaluate the ability of melatonin to modulate miR-152-3p and its targets in triple-negative breast cancer cells. Material and Method: After the determination of the melatonin concentration to be used, the differential expression of the miRNAs in the MDA-MB-468 strain after the melatonin treatment was evaluated using the plate RT² Profiler™ PCR Array Human Breast Cancer containing 84 miRNAs related to breast cancer. An in-silico analysis was performed to select a miRNA involved in angiogenesis and its potential target genes. Overexpression of miR-152-3p was performed on MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells by transient transfection and after relative quantification of their expression and their target genes IGF-1R, VEGF and HIF-1α was evaluated by real-time PCR. Quantification of the protein expression of the genes was verified by immunocytochemistry. Results: The cell viability assay in the MDA-MB-468 cell line demonstrated that cells treated with 1 mM melatonin had the lowest viability (p <0.05). Analysis of the miRNAs by PCR Array in the MDA-MB-468 cell line showed six positively regulated miRNAs and seven negatively regulated miRNAs after treatment with melatonin. Evaluation of gene expression demonstrated that miR-152-3p overexpression was influenced by melatonin, leading to increased expression of the genes IGF-1R, HIF-1α and VEGF in MDA-MB-468 cells. In the MDA-MB-231 cell line, melatonin did not influence the expression of miR-152-3p and decreased the expression of the target genes. Finally, immunocytochemistry revealed that melatonin and overexpression of miR-152-3p were able to decrease the protein expression of IGF-1R, HIF-1α and VEGF in the MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells. Conclusions: Melatonin was able to modulate the expression of miR-152-3p and its target genes involved in angiogenesis in triple-negative breast cancer. Therefore, this study confirms the action of melatonin on the important cellular event of angiogenesis, a determinant process for the progression of the disease and also indicates it as a potential therapeutic protocol for triple-negative breast cancer. / O câncer de mama representa o segundo tipo tumoral que possui os maiores índices de mortalidade, sendo o mais comum entre as mulheres. As causas desses altos índices de mortalidade têm relação com a alta proliferação e formação de metástases, e para a progressão tumoral, é necessário o crescimento de novos vasos sanguíneos, a angiogênese. Este evento pode ser estimulado por diversos fatores, como o receptor tipo 1 do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R), o fator induzido por hipóxia 1 alfa (HIF-1α) e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os miRNAs podem induzir o silenciamento de genes relacionados com a angiogênese pelo pareamento com determinado RNA mensageiro (RNAm) específico, resultando na degradação desta molécula. A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), principal hormônio produzido e secretado pela glândula pineal, possui diversas funções fisiológicas e comprovada ação antitumoral, inclusive ação antiangiogênica. Esse hormônio pode regular miRNAs e genes relacionados a esse processo. Objetivo: Avaliar a capacidade da melatonina em modular o miR-152-3p e seus alvos, em células de câncer de mama triplo-negativo. Material e Método: Após a definição da concentração de melatonina a ser utilizada pelo ensaio de viabilidade celular, foi avaliada a expressão diferencial dos miRNAs na linhagem MDA-MB-468, após o tratamento com melatonina, utilizando-se a placa RT² Profiler™ PCR Array Human Breast Cancer que contêm 84 miRNAs relacionados ao câncer de mama. Uma análise in silico foi realizada para seleção de um miRNA envolvido na angiogênese e seus potenciais genes-alvo. A superexpressão do miR-152-3p foi realizada nas células MDA-MB-468 e MDA-MB-231 por transfecção transiente e após, a quantificação relativa de sua expressão e de seus genes-alvo IGF-1R, VEGF e HIF-1α foram avaliadas por PCR em tempo real. A quantificação da expressão proteica dos genes foi verificada por imunocitoquímica. Resultados: O ensaio de viabilidade celular na linhagem MDA-MB-468, demonstrou que as células tratadas com 1 mM de melatonina tiveram os menores valores de viabilidade (p<0,05). A análise dos miRNAs por PCR Array na linhagem MDA-MB-468 apontou seis miRNAs regulados positivamente e sete miRNAs regulados negativamente, após o tratamento com a melatonina. A avaliação da expressão gênica demonstrou que a superexpressão do miR-152-3p foi influenciada pela melatonina, levando ao aumento da expressão dos genes IGF-1R, HIF-1α e VEGF na linhagem MDA-MB-468. Já na linhagem MDA-MB-231 a melatonina não influenciou a expressão do miR-152-3p e diminuiu a expressão dos genes-alvo. Por fim, a imunocitoquímica revelou que a melatonina e a superexpressão do miR-152-3p foram capazes de diminuir a expressão proteica de IGF-1R, HIF-1α e VEGF nas linhagens MDA-MB-468 e MDA-MB-231. Conclusões: A melatonina foi capaz de modular a expressão do miR-152-3p e de seus genes-alvo envolvidos com a angiogênese no câncer de mama triplo-negativo. Portanto, este estudo confirma a ação da melatonina no importante evento celular de angiogênese, processo determinante para a progressão da doença e ainda indicá-la como potencial protocolo terapêutico para o câncer de mama triplo-negativo.

As mutações no gene de supressão tumoral p53 estão entre as anormalidades genéticas mais comuns encontradas numa ampla variedade de tumores. Embora a função do gene p53 ainda não esteja completamente esclarecida, ele parece ser um fator de transcrição nuclear que controla a proliferação celular, a apoptose e a manutenção da estabilidade genética. A angiogênese é essencial para o crescimento e a metastatização de tumores sólidos. O Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), um fator de crescimento identificado recentemente com propriedades angiogênicas significativas, pode ser um importante regulador da angiogênese tumoral. A associação entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e o prognóstico tem sido pouco estudada. Foram estudadas peças cirúrgicas de 47 pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) submetidos à esofagectomia em estágios II e III, utilizando-se coloração imuno-histoquímica. As expressões da proteína p53 e do VEGF foram observadas em 53% e 40% dos tumores, respectivamente. As expressões da proteína p53 e do VEGF coincidiram em somente 21% dos casos, e não foi encontrada correlação entre elas. Nenhum dos fatores clinicopatológicos se correlacionaram significativamente com as expressões da proteína p53 ou do VEGF. Em relação ao prognóstico, não havia associação significativa entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e pior prognóstico. Os autores concluem que tanto a expressão da proteína p53 como a expressão do VEGF não se correlacionaram com o prognóstico em pacientes com CEE em estágios II e III. / p53 tumor suppressor gene mutations are the most common genetic alterations found in a wide variety of cancers. Although the function of the p53 gene has not been definitely established, p53 appears to be a nuclear transcription factor that plays a role in the control of cell proliferation, apoptosis, and the maintenance of genetic stability. Angiogenesis is a critical process in solid tumor growth and metastasis. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), a recently identified growth factor with significant angiogenic properties, may be a major tumor angiogenesis regulator. Few studies have investigated the association between p53 and VEGF expressions and prognosis in esophageal carcinoma. Forty-seven specimens resected from patients with stage II and III squamous cell carcinoma (SCC) of the esophagus were studied by means of immunohistochemical staining. p53 and VEGF expressions were observed in 53% and 40% of the tumors, respectively. p53 and VEGF staining statuses were coincident in only 21% of the tumors, and no significant correlation was found between p53 and VEGF statuses. No clinicopathologic factors were significantly correlated with p53 or VEGF expression. No significant association between p53 and VEGF expressions and poor prognosis was found. In conclusion, p53 and VEGF were not correlated with prognosis in patients with stage II and III SCC of the esophagus.

As mutações no gene de supressão tumoral p53 estão entre as anormalidades genéticas mais comuns encontradas numa ampla variedade de tumores. Embora a função do gene p53 ainda não esteja completamente esclarecida, ele parece ser um fator de transcrição nuclear que controla a proliferação celular, a apoptose e a manutenção da estabilidade genética. A angiogênese é essencial para o crescimento e a metastatização de tumores sólidos. O Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), um fator de crescimento identificado recentemente com propriedades angiogênicas significativas, pode ser um importante regulador da angiogênese tumoral. A associação entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e o prognóstico tem sido pouco estudada. Foram estudadas peças cirúrgicas de 47 pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) submetidos à esofagectomia em estágios II e III, utilizando-se coloração imuno-histoquímica. As expressões da proteína p53 e do VEGF foram observadas em 53% e 40% dos tumores, respectivamente. As expressões da proteína p53 e do VEGF coincidiram em somente 21% dos casos, e não foi encontrada correlação entre elas. Nenhum dos fatores clinicopatológicos se correlacionaram significativamente com as expressões da proteína p53 ou do VEGF. Em relação ao prognóstico, não havia associação significativa entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e pior prognóstico. Os autores concluem que tanto a expressão da proteína p53 como a expressão do VEGF não se correlacionaram com o prognóstico em pacientes com CEE em estágios II e III. / p53 tumor suppressor gene mutations are the most common genetic alterations found in a wide variety of cancers. Although the function of the p53 gene has not been definitely established, p53 appears to be a nuclear transcription factor that plays a role in the control of cell proliferation, apoptosis, and the maintenance of genetic stability. Angiogenesis is a critical process in solid tumor growth and metastasis. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), a recently identified growth factor with significant angiogenic properties, may be a major tumor angiogenesis regulator. Few studies have investigated the association between p53 and VEGF expressions and prognosis in esophageal carcinoma. Forty-seven specimens resected from patients with stage II and III squamous cell carcinoma (SCC) of the esophagus were studied by means of immunohistochemical staining. p53 and VEGF expressions were observed in 53% and 40% of the tumors, respectively. p53 and VEGF staining statuses were coincident in only 21% of the tumors, and no significant correlation was found between p53 and VEGF statuses. No clinicopathologic factors were significantly correlated with p53 or VEGF expression. No significant association between p53 and VEGF expressions and poor prognosis was found. In conclusion, p53 and VEGF were not correlated with prognosis in patients with stage II and III SCC of the esophagus.

As mutações no gene de supressão tumoral p53 estão entre as anormalidades genéticas mais comuns encontradas numa ampla variedade de tumores. Embora a função do gene p53 ainda não esteja completamente esclarecida, ele parece ser um fator de transcrição nuclear que controla a proliferação celular, a apoptose e a manutenção da estabilidade genética. A angiogênese é essencial para o crescimento e a metastatização de tumores sólidos. O Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), um fator de crescimento identificado recentemente com propriedades angiogênicas significativas, pode ser um importante regulador da angiogênese tumoral. A associação entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e o prognóstico tem sido pouco estudada. Foram estudadas peças cirúrgicas de 47 pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) submetidos à esofagectomia em estágios II e III, utilizando-se coloração imuno-histoquímica. As expressões da proteína p53 e do VEGF foram observadas em 53% e 40% dos tumores, respectivamente. As expressões da proteína p53 e do VEGF coincidiram em somente 21% dos casos, e não foi encontrada correlação entre elas. Nenhum dos fatores clinicopatológicos se correlacionaram significativamente com as expressões da proteína p53 ou do VEGF. Em relação ao prognóstico, não havia associação significativa entre as expressões da proteína p53 e do VEGF e pior prognóstico. Os autores concluem que tanto a expressão da proteína p53 como a expressão do VEGF não se correlacionaram com o prognóstico em pacientes com CEE em estágios II e III. / p53 tumor suppressor gene mutations are the most common genetic alterations found in a wide variety of cancers. Although the function of the p53 gene has not been definitely established, p53 appears to be a nuclear transcription factor that plays a role in the control of cell proliferation, apoptosis, and the maintenance of genetic stability. Angiogenesis is a critical process in solid tumor growth and metastasis. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), a recently identified growth factor with significant angiogenic properties, may be a major tumor angiogenesis regulator. Few studies have investigated the association between p53 and VEGF expressions and prognosis in esophageal carcinoma. Forty-seven specimens resected from patients with stage II and III squamous cell carcinoma (SCC) of the esophagus were studied by means of immunohistochemical staining. p53 and VEGF expressions were observed in 53% and 40% of the tumors, respectively. p53 and VEGF staining statuses were coincident in only 21% of the tumors, and no significant correlation was found between p53 and VEGF statuses. No clinicopathologic factors were significantly correlated with p53 or VEGF expression. No significant association between p53 and VEGF expressions and poor prognosis was found. In conclusion, p53 and VEGF were not correlated with prognosis in patients with stage II and III SCC of the esophagus.