Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / A indústria sucroalcooleira do Brasil está desenvolvendo métodos para tornar os custos de produção e comercialização do etanol de segunda geração viáveis. A recalcitrância da fibra celulósica não permite sua conversão em açúcares de forma eficiente sem uma etapa adicional de pré-tratamento da biomassa. Tratamentos hidrotérmicos possibilitam a solubilização da hemicelulose e consequente recuperação de açúcares fermentescíveis com baixo impacto ambiental. Neste estudo, foi aplicado o tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-de-açúcar visando a produção de enzimas holocelulolítcas pelo fungo Aspergillus niger. O foco do trabalho foi otimizar a atividade de xilanases, analisando os efeitos dos parâmetros de pré-tratamento utilizados e alguns fatores que podem influenciar na eficiência da reação enzimática. Adicionalmente, propõe possíveis metodologias para a purificação das xilanases obtidas e analisa as diferenças encontradas entre as xilanases obtidas utilizando bagaço in natura (BNT) ou pré-tratado (Tr10 e Tr16). As atividades de celulase e hemicelulase variaram em função dos parâmetros do pré-tratamento e foi possível obter um aumento de até 470 % na atividade de xilanase quando comparada ao bagaço-não tratado, além de aumentos nas atividades de pectinase, mananase, CMCase, FPAse e avicelase. As xilanases obtidas apresentaram atividade num amplo gradiente de temperatura (35-70 ºC) e pH (3 – 9,0), termoestabilidade a 40 ºC, e estabilidade na presença de diversos íons e fenóis durante a reação enzimática. Após 4 etapas de separação de moléculas foi possível obter duas amostras semi-puras de xilanases, cada uma com 2 isoformas da enzima. Foram identificadas 42 proteínas no extrato bruto de BNT e 99 em Tr16; apenas 23 das proteínas identificadas estavam presentes em ambas as amostras. Em Tr16 foi obtida uma variedade de celulases 2,3 vezes maior do que em BNT, ressaltando o potencial do tratamento hidrotérmico como ferramenta para modular a produção de enzimas holocelulolíticas pelo fungo. / The sugar and alcohol industry of Brazil is developing methods to make viable costs for producing and commercializing second generation ethanol. The cellulosic fiber recalcitrance does not allow for an efficient conversion of sugars without adding a step for pretreatment of the biomass. Hydrothermal pretreatment can solubilize hemicellulose and recover fermentable sugars with low environmental impact. In this study, hydrothermal pretreatment of sugarcane bagasse was used for the production of holocellulolitic enzymes by Aspergillus niger. The focus of this work was optimizing the activity of xylanases, analyzing the effects of pretreatment parameters and other factors that could influence the efficiency of enzymatic reaction. Furthermore, it proposes methodologies for purifying the obtained xylanases and analyzes the differences found when using raw (BNT) and pretreated sugarcane bagasse (Tr10 and Tr16). Cellulase and hemicellulase activities were found to vary according to the parameters used for pretreatment and an increase of 470 % on xylanase activity was obtained when compared to raw SCB. Pectinase, mananase, CMCase, FPAse and avicelase activities were also increased. The xylanases presented activities in a wide range of temperature (35-70 ºC) and pH (3,0-9,0), thermoestability at 40 ºC, and stability in the presence of several ionic and phenolic compounds during enzymatic reactions. It was possible to recover two semi-pure samples of xylanase after 4 steps for the separation of molecules, and there were 2 isoforms of the enzyme in each sample. In BNT crude extract, 42 proteins were identified, while in Tr16 there were 99 proteins; only 23 of the identified proteins were found in both samples. In Tr16 it was obtained a variety of cellulases 2,3 times larger than BNT, thus highlighting the potential of this hydrothermal pretreatment for modulating holocellulolitc enzyme production by fungi.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:24:01Z No. of bitstreams: 1 2015_EltonCarlosGrossi_Parcial.pdf: 1033402 bytes, checksum: 240561874d013cfd008b8dfc120969ae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-08T20:24:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_EltonCarlosGrossi_Parcial.pdf: 1033402 bytes, checksum: 240561874d013cfd008b8dfc120969ae (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-08T20:24:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_EltonCarlosGrossi_Parcial.pdf: 1033402 bytes, checksum: 240561874d013cfd008b8dfc120969ae (MD5) / O mundo se depara atualmente com a perspectiva de um significativo aumento na demanda por etanol. Para evitar que haja o limite da oferta ou a competição pelo uso da terra para a geração de energia e produção de alimentos, especialmente em locais que não dispõem de clima favorável ou extensão territorial para cultivo, torna-se necessário investir no desenvolvimento de tecnologias de segunda geração de produção de etanol. A produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica envolve quatro etapas: pré-tratamento para a remoção da lignina e hemiceluloses, hidrólise da celulose, fermentação da glicose e destilação. Devido ineficiência dos pré-tratamentos e alto grau de cristalinidade da celulose, o rendimento líquido da conversão desse polímero em glicose tem sido um dos grandes desafios na busca por uma tecnologia que viabilize o processo de hidrólise para torná-lo mais competitivo. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi desenvolver tecnologia para a produção de etanol de segunda geração, utilizando como matéria-prima o filtro de cigarro, que é constituído essencialmente por um derivado de celulose obtido do descarte da indústria de cigarro, o acetato de celulose, e dessa forma verificar a influência da substituição dos grupos OH na melhoria do acesso e reatividade da celulose. Os materiais foram analisados pelas técnicas: CHN, DRX, TGA, DSC, FTIR. Os difratogramas de raios X dos materiais mostraram uma grande diferença entre as cristalinidades da celulose e acetato de celulose. As reações de hidrólise foram realizadas em autoclave, à temperatura de 120 °C, variando-se a concentração de H2SO4 e o tempo de reação. A quantificação da glicose foi feita a 505 nm no espectrofotômetro UV-vis, através de teste enzimático colorimétrico utilizando um reagente específico. A composição dos hidrolisados foi analisada por HPLC (high performance liquid chromatography). O rendimento máximo em glicose, 92,3%, foi alcançado para a hidrólise do acetato de celulose em solução de H2SO4, 5%, por 180 minutos. Os testes de fermentação do hidrolisado com o maior teor de glicose foram realizados em biorreator tipo INFORS HT Multifors 2 Cell utilizando YNB e hidrolisado na proporção de 1/1, os quais foram mantidos sob agitação de 200 rpm, temperatura de 30 °C e sem aeração por 25 horas. Como agente fermentador foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae. O consumo de glicose e a produção de etanol foram quantificados durante a fermentação a partir de coletas de amostras do meio em intervalos de 2 horas e posterior análise por HPLC. A taxa de conversão da glicose em etanol foi 0,50 g/g e a eficiência da fermentação atingiu valores próximos de 100%. Os resultados encontrados foram extremamente importantes e esse estudo apontou novos caminhos para a hidrólise ácida com base na modificação química da celulose. / The world is currently faced with the prospect of a significant increase in demand for ethanol. To avoid having the limit of the offer or competition for land use for energy generation and food production, especially in locations that lack the favorable climate or land area for cultivation, it is necessary to invest in the development of technologies second generation production of ethanol. The production of ethanol from lignocellulosic biomass involves four stages: pre-treatment for the removal of lignin and hemicellulose, hydrolysis of cellulose, glucose fermentation and distillation. Due inefficiency of pre-treatment and high degree of crystallinity of cellulose, the net income from the conversion of glucose polymer has been a major challenge in the search for a technology that enables the hydrolysis process to make it more competitive. Thus, the objective of this work was to develop technologie for second generation ethanol production, using as raw material the cigarette filter, which consists essentially of a derivative of cellulose obtained by discarding the cigarette industry, cellulose acetate, and thereby determine the influence of replacement of OH groups in improving access and reactivity of cellulose. The materials were analyzed by techniques: CHN, XRD, TGA, DSC, FTIR. The diffractograms ray-X of the materials showed a large difference between the crystallinities of cellulose and cellulose acetate. The hydrolysis reactions were performed in an autoclave at a temperature of 120 °C by varying the concentration of H2SO4 and the reaction time. Quantification of glucose was carried out at 505 nm UVvis spectrophotometer, using enzymatic colorimetric test using a specific reagent. The composition of the hydrolysates were analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography). The maximum yield of glucose, 92.3% was achieved for the hydrolysis of the cellulose acetate solution of H2SO4, 5%, for 180 minutes. The hydrolyzate fermentation tests with the highest glucose content were performed in a bioreactor type INFORS HT Multifors 2 Cell using YNB and hydrolyzed in the ratio of 1/1, were kept under stirring at 200 rpm, temperature of 30 °C and without aeration for 25 hours. As fermenting agent used was Saccharomyces cerevisiae. The glucose consumption and ethanol production were quantified during fermentation from the sample collection means at intervals of 2 hours and subsequent HPLC analysis. The rate of conversion of glucose into ethanol was 0.50 g / g and the efficiency fermentation eached values close to 100%. The results were extremely important and this study found new ways to acid hydrolysis based on the chemical modification of cellulose.

O mundo está passando por uma transformação profunda no setor energético. Ao que tudo indica estamos rumando para uma economia baseada em energias renováveis e de baixa emissão de carbono. O programa de bionenergia do Estado de São Paulo é o maior programa de bioenergia do mundo. Dentro desse programa produz-se etanol a partir da cana-de-açúcar, precisamente dos açúcares simples da cana-de-açúcar. O etanol produzido a partir dos açúcares simples da planta é denominado etanol de primeira geração. Entretanto, existe uma nova tecnologia para se produzir etanol a partir da celulose da cana-de-açúcar o etanol de segunda geração que possibilitará aumentar a eficiência energética do processo e fortalecer a competitividade do setor bioenergético nacional. O objetivo desse trabalho é prospectar cenários para o futuro do setor produtivo de etanol em São Paulo tendo em vista o etanol de segunda geração como elemento produtivo adjacente à produção atual de primeira geração. Para isso utilizou-se um modelo de construção de cenários que pressupõe uma detalhada consulta a especialistas, qualificação de variáveis quanto à sua importância e incerteza e identificação de variáveis-chaves. Por fim, foram criadas matrizes e roteiros para os cenários a partir das variáveis-chaves identificadas. Concluiu-se que dos quatro cenários construídos dois são favoráveis, um é desfavorável e um é pouco plausível. A metodologia de geração de variáveis-chaves foi aplicada com sucesso no setor produtivo de etanol. Os cenários criados podem lançar alguma luz possíveis futuros do setor estudado em relação ao etanol de segunda geração. / Nowadays the worlds energy sector is in a process of deep transformation. Apparently the world is going to a renewable energy based matrix, with low carbon emissions. The Sao Paulos bioenergetical program is the biggest renewable energy program in the world. In addition to that, it is also produced in that program ethanol from sugar cane. The ethanol that is produced in that program is made from the simple sugars of sugar cane. This ethanol is named first generation ethanol. However, there is a new technology to produce ethanol from sugar canes cellulose, named second generation ethanol. This important new technology could increase the energetic efficiency of process and make the Brazilians energetic production competitiveness stronger. The objective of this work was to prospect scenarios for the ethanols future in Sao Paulo looking at the second generation ethanol. For that it was used a model of scenario construction that presupposed an exhaustive inquire applied to specialists, qualifying trends related to their importance and uncertainty, and identifying the key parameters. At last, extracting the key parameters, matrices were made, and scripts too, both related to these scenarios. The conclusion was that the methodology for scenarios generation was applied with success on the ethanol industry, and those scenarios were able to illuminate with some light under plausible futures about the second generation ethanol.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Economia, Administração e Contabilidade, Programa de Pós-Graduação em Administração, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-10-05T13:04:24Z No. of bitstreams: 1 2016_MarceloFerreiraTete.pdf: 4068202 bytes, checksum: ba67396785009d3311323ce5ed3b6faf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-06T20:26:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarceloFerreiraTete.pdf: 4068202 bytes, checksum: ba67396785009d3311323ce5ed3b6faf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T20:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarceloFerreiraTete.pdf: 4068202 bytes, checksum: ba67396785009d3311323ce5ed3b6faf (MD5) / O objetivo deste trabalho é analisar os vínculos estabelecidos entre as instituições regulatórias, normativas e cultural-cognitivas e as funções do sistema tecnológico de inovação do etanol de segunda geração brasileiro (STI do etanol 2G) ao longo do processo de formação desse sistema. Para sua fundamentação teórica foram revisadas a teoria neo-institucional da sociologia organizacional, sistemas de inovação e seu caráter institucional e sistemas tecnológicos de inovação. O modelo teórico de pesquisa foi elaborado com base nos pilares institucionais de Scott (1995) – regulatório, normativo e cultural-cognitivo – e nas sete categorias da abordagem das funções de sistemas de inovação de Bergek et al. (2008) – experimentação empreendedora; desenvolvimento e difusão de conhecimento; influência sobre a direção da busca; mobilização de recursos; formação de mercado; desenvolvimento de externalidades positivas; legitimação. Os dados foram obtidos por meio de levantamento documental e de entrevistas semiestruturadas junto a vinte colaboradores de dezenove organizações, sendo analisados em períodos distintos: 1975-1986, 1987-2010 e 2011-2015. Os resultados encontrados mostram que, ao longo dos quarenta anos do processo formativo do STI do etanol 2G, além de um crescimento de seu quadro institucional, foram estabelecidos vínculos com todas as sete funções desse sistema de inovação, influenciando as ações e interações de seus atores, bem como as inovações tecnológicas produzidas. As instituições regulatórias formalizaram decisões – sobretudo governamentais – que direcionaram recursos para o desenvolvimento tecnológico relacionado ao etanol 2G. As instituições normativas definiram o que é considerado apropriado para o desenvolvimento do STI. As instituições cultural-cognitivas moldaram as expectativas dos atores do STI, direcionando suas ações e investimentos para o desenvolvimento de trajetórias tecnológicas específicas. O trabalho é finalizado com a apresentação de suas contribuições em termos teóricos, metodológicos, gerenciais e de formulação de política pública. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work aims to analyze ties established between regulative, normative and cultural-cognitive institutions and the functions of the Brazilian second generation ethanol technological innovation system (2G ethanol TIS) throughout the formation process of this system. For its theoretical the neo-institutional theory of organizational sociology, innovation systems and their institutional character and technological innovation systems were reviwed. The theoretical research model was developed based on Scott`s pillars of institutions – regulative, normative and cultural-cognitive – and on Bergek et al. (2008) seven categories of the functions of innvation systems approach – entrepreneurial experimentation, knowledge development and diffusion, influence on the direction of search, resource mobilization, market formation, development of positive externalities, and legitimation. Data was collected through documental research and semi-structured interviews with twenty executives from nineteen organizations, and were analyzed in distinct periods: 1975-1986, 1986-2010, and 2011-2015. The results found show that over the forty years of the 2G ethanol TIS formative process, in addition to a growth in its institutional framework, ties with all the seven functions of this innovation system were established, influencing its actors’s actions and interactions as well as the technological innovations developed. Regulatory institutions formalized decisions – especially governmental ones – that directed resources to technological developments related to 2G ethanol. Normative institutions defined what is considered appropriate for the TIS development. Cultural-cognitive institutions shaped TIS’s actors expectations directing their actions and investments to the development of specific technological trajectories. This work is finalized with the presentation of its contributions in theoretical, methodological, managerial and policy making terms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:55:25Z No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T13:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ChristianeGoncalvesCamposCavalcanti.pdf: 3510961 bytes, checksum: d524e70ab5294981db6303c5f8d98f3e (MD5) / O aumento na demanda por fontes de energia alternativa e as preocupações com os impactos ambientais tem incentivado o desenvolvimento de tecnologias para a produção de combustíveis a partir de biomassa lignocelulósica, como o etanol de segunda geração (2G). No entanto um dos açúcares mais abundante nas biomassas lignocelulósicas, a xilose, não pode ser convertida a etanol devido à incapacidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, microrganismo mundialmente utilizado na indústria para produção de etanol, de converter eficientemente esse substrato em xilulose. A tecnologia baseada em metabolômica mostra-se eficiente, como uma ferramenta para auxiliar na determinação das etapas limitantes na via metabólica de fermentação da xilose. Neste trabalho, foram desenvolvidos e otimizados dois protocolos para análise de metabolômica targeted, utilizando como plataforma analítica a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) com experimentos de MRM. Os métodos de separação foram baseados na cromatografia por pareamento iônico utilizando uma coluna de fase reversa (HSS-T3) e na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), utilizando uma coluna quimicamente modificada com o grupo amida. Catorze padrões de metabólitos presentes na via de fermentação da xilose puderam ser identificados através de dois métodos complementares. Estes protocolos foram aplicados qualitativamente durante a avaliação de duas leveduras, Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum. O preparo de amostra foi realizado em duas etapas: quenching e extração dos metabólitos. Os métodos de separação e detecção se mostraram promissores para a análise de rotina em processos de fermentação de xilose. / The increase in demand for alternative energy sources and concerns about the environmental impacts has encouraged the development of technologies for the production of fuels from lignocellulosic biomass, such as ethanol from second generation (2G). However one of the most abundant sugars in lignocellulosic biomass, xylose, can not be converted into ethanol due to the inability of yeast Saccharomyces cerevisiae, which is a microorganism used worldwide in the industry for the production of ethanol, to convert this substrate into xylulose efficiently. The technology based on metabolomics proves to be efficient as a tool to identify the crucial steps in the metabolic pathway of xylose fermentation. In this work, we developed and optimized two protocols for targeted metabolomics analysis, using as an analytical platform liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with MRM experiments. Separation methods were based on the ion pairing chromatography using a reverse phase column (HSS-T3) and hydrophilic interaction chromatography (HILIC) with a chemically modified column with amide group. Fourteen patterns of metabolites present in the xylose fermentation pathway could be identified using two complementary methods. These protocols were applied qualitatively during the evaluation of two yeast, Scheffersomyces stipitis and Spathaspora passalidarum. The sample preparation was performed in two stages: quenching and extraction of metabolites. The methods of separation and detection were promising for routine analysis in the xylose fermentation processes.

O mundo está passando por uma transformação profunda no setor energético. Ao que tudo indica estamos rumando para uma economia baseada em energias renováveis e de baixa emissão de carbono. O programa de bionenergia do Estado de São Paulo é o maior programa de bioenergia do mundo. Dentro desse programa produz-se etanol a partir da cana-de-açúcar, precisamente dos açúcares simples da cana-de-açúcar. O etanol produzido a partir dos açúcares simples da planta é denominado etanol de primeira geração. Entretanto, existe uma nova tecnologia para se produzir etanol a partir da celulose da cana-de-açúcar o etanol de segunda geração que possibilitará aumentar a eficiência energética do processo e fortalecer a competitividade do setor bioenergético nacional. O objetivo desse trabalho é prospectar cenários para o futuro do setor produtivo de etanol em São Paulo tendo em vista o etanol de segunda geração como elemento produtivo adjacente à produção atual de primeira geração. Para isso utilizou-se um modelo de construção de cenários que pressupõe uma detalhada consulta a especialistas, qualificação de variáveis quanto à sua importância e incerteza e identificação de variáveis-chaves. Por fim, foram criadas matrizes e roteiros para os cenários a partir das variáveis-chaves identificadas. Concluiu-se que dos quatro cenários construídos dois são favoráveis, um é desfavorável e um é pouco plausível. A metodologia de geração de variáveis-chaves foi aplicada com sucesso no setor produtivo de etanol. Os cenários criados podem lançar alguma luz possíveis futuros do setor estudado em relação ao etanol de segunda geração. / Nowadays the worlds energy sector is in a process of deep transformation. Apparently the world is going to a renewable energy based matrix, with low carbon emissions. The Sao Paulos bioenergetical program is the biggest renewable energy program in the world. In addition to that, it is also produced in that program ethanol from sugar cane. The ethanol that is produced in that program is made from the simple sugars of sugar cane. This ethanol is named first generation ethanol. However, there is a new technology to produce ethanol from sugar canes cellulose, named second generation ethanol. This important new technology could increase the energetic efficiency of process and make the Brazilians energetic production competitiveness stronger. The objective of this work was to prospect scenarios for the ethanols future in Sao Paulo looking at the second generation ethanol. For that it was used a model of scenario construction that presupposed an exhaustive inquire applied to specialists, qualifying trends related to their importance and uncertainty, and identifying the key parameters. At last, extracting the key parameters, matrices were made, and scripts too, both related to these scenarios. The conclusion was that the methodology for scenarios generation was applied with success on the ethanol industry, and those scenarios were able to illuminate with some light under plausible futures about the second generation ethanol.

Orientador: Lúcia Maria Carareto Alves / Resumo: A produção de etanol de segunda geração (2G) obtido a partir de material lignocelulósico para ser eficiente e economicamente viável necessita encontrar melhores opções no processo de transformar celulose e hemicelulose em hexoses e pentoses para que possam ser fermentadas. Com isto, o objetivo deste trabalho foi estudar organismos que compõem o consórcio bacteriano, com capacidade de desconstruir a biomassa lignocelulósica liberando açúcares. O cultivo foi realizado em meio BHB (Bushnell Haas Broth) com bagaço de cana-de-açúcar por 5 e 10 dias para 2a e 20a semana de cultivo. Foram realizadas análises de microscopia eletrônica de varredura avaliando aderência das bactérias à fibra. Além de avaliar composição das frações fibrosas residuais do cultivo e determinar açúcares, essas análises mostraram que com 5 dias para 2a semana houve maior degradação da lignocelulose e liberação de açúcares. As populações bacterianas presentes no consórcio foram estudadas pelo sequenciamento parcial do gene de 16S rRNA, mostrando que existem gêneros com capacidade de degradar a biomassa, como Caulobacter, Pseudoxanthomonas, Chryseobacterium, Sphingomonas, Rhizobium e Dokdonella. Através dos estudos realizados, se pode visualizar que o consórcio conseguiu degradar a biomassa e liberar glicose no meio de cultivo, constituindo assim, uma ferramenta que poderá ser aplicada em processos de obtenção de etanol de segunda geração / Abstract: The production of second generation (2G) ethanol obtained from lignocellulosic material to be efficient and economically viable needs to find better options in the process of turning cellulose and hemicellulose into hexoses and pentoses so that they can be fermented. Thus, the objective of this work was to study organisms that make up the bacterial consortium, with the ability to deconstruct lignocellulosic biomass releasing sugars. Cultivation was carried out in BHB (Bushnell Haas Broth) medium with sugarcane bagasse for 5 and 10 days for the 2nd and 20th week of cultivation. Scanning electron microscopy analyzes were performed to evaluate bacteria adherence to the fiber. In addition to evaluating the composition of the residual fibrous fractions of the crop and determining sugars, these analyzes showed that with 5 days to the 2nd week there was greater lignocellulose degradation and sugar release. The bacterial populations present in the consortium were studied by partial sequencing of the 16S rRNA gene, showing that there are genera with the ability to degrade biomass, such as Caulobacter, Pseudoxanthomonas, Chryseobacterium, Sphingomonas, Rhizobium and Dokdonella. Through the studies, it can be seen that the consortium managed to degrade the biomass and release glucose in the culture medium, thus constituting a tool that can be applied in processes of obtaining second generation ethanol. / Mestre

Fazemos parte de um cenário mundial em que o esgotamento das fontes de energias fósseis atrelado à poluição gerada por esse uso, preocupam os diferentes setores do comércio, da indústria, do governo e das instituições em defesa do meio ambiente. Nesse sentido, a busca por novas fontes energéticas renováveis tem dirigido diversas pesquisas, além de drenar bilhões de dólares em investimentos. Uma das linhas de pesquisa mais importantes é a da produção do etanol de segunda geração (2G), um etanol produzido a partir dos resíduos gerados na produção do etanol de primeira geração. No caso do Brasil, esses resíduos compreendem principalmente a palha e o bagaço de cana-de-açúcar; essa biomassa é formada majoritariamente por celulose (∼45%), hemicelulose (∼25%) e lignina (∼20), e sua hidrólise envolve pré-tratamentos adequados e uso de enzimas que agem especificamente em seus alvos. Dessa forma, a produtividade de etanol aumenta, sem necessariamente ampliar áreas de cultivo. Essa vertente é muito promissora, porém os custos ainda são relativamente altos e a aplicabilidade depende bastante de adaptações do setor industrial e aprimoramentos na produção em si (atividade específica das enzimas e sua ação sinérgica). O objetivo principal deste projeto é reconhecer e mapear as bases moleculares que comandam a atividade da enzima xilose isomerase (XI), que converte xilose (presença majoritária na hemicelulose) em xilulose, possibilitando a utilização desta por Saccharomyces cerevisiae (já que a xilose não é fermentescível), para obtenção do etanol de segunda geração como produto final. Para isso, foi realizada uma busca extensiva de genes de diversos microrganismos, que codifiquem para XI, e que essas ainda não possuam estruturas resolvidas publicadas. A maioria das ORFs (Open Reading Frame, do inglês), ou regiões codificadoras, foram amplificadas, clonadas em vetores específicos e transformadas em bactérias Escherichia coli Rosetta (DE3). Parte dessas cepas transformadas resultaram na produção da XI de interesse. Com isso, foi possível obter cristais e iniciar a resolução de estruturas cristalográficas. Esses resultados foram cruzados e correlacionados com os de atividade enzimática, cinética química e estabilidade térmica, fornecendo boa perspectiva para o entendimento das bases moleculares que regem a atividade xilose isomerásica. / We are part of a world scenario in which the depletion of fossil energy sources linked to the pollution generated by this use, concern the different sectors of commerce, industry, government and institutions in defense of the environment. In this regard, the search for new renewable energy sources has headed many researches, besides generating billions of dollars in investments. One of the most important research lines is the production of second generation ethanol (2G), an ethanol produced from the waste generated in the production of the first generation one. In the case of Brazil, these residues mainly include sugar cane straw and bagasse. This biomass is mostly composed of cellulose (∼45%), hemicellulose (∼25%) and lignin (∼20), and its hydrolysis involves adequate pre-treatments and the use of enzymes that specifically act on their targets. In this way, ethanol productivity increases without necessarily expanding growing areas. This aspect is very promising, but the costs are still relatively high and the applicability badly depends on adaptations of the industrial sector and improvements in the production itself (specific activity of the enzymes and their synergistic action with others). The main goal of this project is to recognize and map the molecular bases that control the activity of the enzyme xylose isomerase (XI), which converts xylose (the mostly present carbohydrate in hemicellulose) into xylulose, allowing its use by Saccharomyces cerevisiae (since xylose is not fermentable), to obtain the second generation ethanol as final product. To reach this, an extensive search of genes of several microorganisms, that code for XI, and still do not have solved high resolution structures published are carried out. Most ORFs (Open Reading Frames) were amplified, cloned into specific vectors and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) bacteria. Some of these transformed strains leaded to the production of XI of interest. Furthermore, it was possible to obtain protein crystals and to start trying to solve crystallographic structures. These results were cross - checked and correlated with those of enzymatic activity, chemical kinetics and thermal stability, providing a good perspective for understanding the molecular bases which govern isomerase activity.

O uso de resíduos agrícolas como fonte de carbono para a geração de energia renovável parece uma solução promissora para reduzir nossa dependência em combustíveis fósseis. Na natureza, como na compostagem, comunidades microbianas formam redes metabólicas complexas que degradam eficientemente a biomassa disponível através de um conjunto de enzimas sinérgicas. Entretanto, a desconstrução da lignocelulose continua uma desafio para a indústria devido a natureza recalcitrante do substrato e a baixa atividade das enzimas, aumentando o preço do biocombustível produzido. Estudos de metagenômica e metatranscriptômica de comunidades microbianas complexas tornam possível acessar as funções metabólicas empregadas por consórcios lignocelulolíticos e revelar novos biocatalisadores que podem melhorar a conversão industrial da lignocelulose. Aqui, através de uma abordagem metagenômica, foi examinada a diversidade de microrganismos obtidos em condições laboratoriais quando um meio definido ou um complexo foi usado no seu crescimento. Em seguida, a comunidade microbiana derivada de compostagem foi crescida em meio mínimo com bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono. A degradação do substrato foi monitorada e o metatranscriptoma da cultura resultante foi sequenciado, seguido pela seleção e caracterização funcional de vários alvos. Durante as cinco semanas de estudo, a comunidade microbiana crescida em meio mínimo mostrou maior diversidade e enriquecimento em microrganismos capazes de degradar a lignocelulose do que a comunidade microbiana crescida no meio complexo. A partir do metatranscriptoma foi descoberta a primeira hidrolase de glicosídeo da família 11 com atividade exoxilanase (C21). A estrutura cristalográfica da C21, refinada à 1,76 Å, revelou que a atividade exoxilanase observada se deve a presença de duas alças que não estão presentes nas demais estruturas dos membros da família 11 de hidrolase de glicosídeo depositadas até então. A adição da C21 a um coquetel comercial provocou um aumento na velocidade de hidrólise do Avicel quando na presença de xilooligômeros. As análises metagenômica e metatranscriptômica da comunidade microbiana proveniente da compostagem revelaram que o uso de um meio definido pode deslocar espécies generalistas, levando a uma fonte enriquecida para explorar enzimas com aplicação biotecnológica. Também demonstrou a diversidade de mecanismos envolvidos na degradação in situ da lignocelulose. / Using of the globally abundant crop residues as carbon source for energy generation seems a promising solution to reduce our dependency on fossil fuels. In nature, such as in compost habitats, microbial communities create complex metabolic networks that efficiently degrade the available plant biomass using a set of synergistic enzymes. However, deconstruction of lignocellulose remains a challenge for industry due to recalcitrant nature of the substrate and enzymes low activity, raising the price of the produced biofuel. Metagenomics and metatranscriptomics studies on complex microbial communities can assess the metabolic functions employed by the lignocellulolytic consortia and unveil novel biocatalysts that could improve industrial lignocellulose conversion. Here, using 16S rRNA amplicon metagenomic approach, we examined the diversity of microorganisms obtained in the laboratory setting when a nutrient-limited or nutrient-rich media are used. Then, a microbial community derived from compost was grown in minimal medium with sugarcane bagasse as a sole carbon source. The substrate degradation was monitored and the metatranscriptome from the resulting cultures was sequenced; several target genes were selected and functional characterized. During a five-week time course, the microbial community grown in minimal medium showed greater diversity and enrichment in lignocellulose-degrading microorganisms than the one grown in nutrient rich medium. Metatranscriptomics analysis revealed the first glycoside hydrolase from family 11 with exo-xylanase activity (C21). C21 crystal structure, refined at 1.76 Å, explained the molecular basis of exo-xylanase activity due to two extra loops previously unseen in the other reported structures from members from glycoside hydrolase family 11. A supplementation of commercial enzyme mix with C21 showed improvement in Avicel hydrolysis in the presence of inhibitory xylooligomers. The combination of metagenomic and metatranscriptomic analysis of compost-derived microbial community showed that nutrient-limited medium may displace bacterial generalist species, leading to an enriched source for mining novel enzymes for biotechnology applications. It also unveiled a diversity of mechanisms involved in lignocellulose degradation in situ.

Submitted by GIOVANA ROBERTA FRANCISCO BRONZATO null (giba_roberta@hotmail.com) on 2016-07-30T22:47:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação8.pdf: 3329976 bytes, checksum: 1e0d85f78fcf14b969e03a86c3ce4b3e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-02T14:18:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bronzato_grf_me_bot.pdf: 3329976 bytes, checksum: 1e0d85f78fcf14b969e03a86c3ce4b3e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:18:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bronzato_grf_me_bot.pdf: 3329976 bytes, checksum: 1e0d85f78fcf14b969e03a86c3ce4b3e (MD5) Previous issue date: 2016-07-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Eichhornia crassipes, conhecida popularmente como aguapé, é uma macrófita aquática nativa no Brasil que tem um grande poder de adaptação e uma taxa de crescimento muito elevada, chegando a cobrir o leito de um rio em poucas semanas. Por esses motivos, atualmente, esse vegetal é considerado uma praga, pois sua grande quantidade causa danos ambientais a corpos hídricos, como a eutrofização desses habitats e no setor econômico prejudica a navegação e a produção de energia, pois se prendem aos motores e as turbinas, respectivamente. Uma alternativa para resolver o problema do excesso de aguapé é utilizar a sua biomassa para a produção de etanol de segunda geração, uma tecnologia que utiliza a celulose dos vegetais como matéria-prima. Nesta dissertação foram estudadas algumas rotas de produção, com a intenção de encontrar uma metodologia eficiente para a produção de etanol 2G a partir do aguapé. Para isso foram utilizados quatro diferentes processos químicos de pré-tratamento, auto-hidrólise, hidrólise com peróxido de hidrogênio, e hidrólise com os ácidos sulfúrico e acético, e duas formas de hidrólise enzimática, simultânea ou separada do processo de fermentação alcoólica. Pela caracterização química e pelas análises de TG-DTA, XRD e FTIR, foi possível determinar que a hidrólise com ácido sulfúrico é o pré-tratamento mais eficiente e que os processos de hidrólise enzimática e fermentação alcoólica simultâneas apresentam uma maior produtividade. Em um ano, com apenas um hectare, em corpos hídricos, de aguapé, é possível produzir 265 litros de etanol. / Water hyacinth, Eichhornia crassipes, is a native macrophyte from Brazil that has a great ability to adapt and a very high growth rate, reaching to cover the riverbed in a few weeks. For these reasons, currently, water hyacinth is considered a pest because its large amount causes environmental damage to the rivers and lakes, such as eutrophication of these habitats, and economic sector, affecting navigation and energy production because they are arrested to engines and turbines respectively. An alternative to resolve the excess water hyacinth problem is to use its biomass to second generation ethanol production, which technology use cellulose like feedstock. In this work were studied some ways to optimize the production of 2G ethanol from water hyacinth. For this were used different chemical pre-treatment processes (hydrolysis with water, peroxide, sulfuric and acetic acids), and two way to enzymatic hydrolysis (SSF and SHF). Through the chemical characterization and TG-DTA, XRD and FTIR analyses, was possible to determine that sulfuric acid hydrolysis is the pretreatment more effective and that SSF has the bigger productivity. In one year, from one hectare covered by water hyacinth, it's possible to produce 265 liters of ethanol.