L’eutrophisation et le réchauffement climatique sont reconnus comme des forçages majeurs du fonctionnement des lacs. Toutefois les connaissances concernant la réponse des communautés microbiennes eucaryotes à ces forçages sont encore très lacunaires, alors même que les microbes eucaryotes, porteurs d’une vaste diversité taxonomique et fonctionnelle, sont des acteurs clés des réseaux trophiques lacustres. La pertinence des approches paléolimnologiques pour comprendre les impacts de ces forçages sur les communautés lacustres n’est plus à démontrer, mais aujourd’hui l’intégration des outils moléculaires pour analyser l’ADN archivé dans les sédiments offre des opportunités nouvelles pour reconstituer la dynamique passée de la biodiversité lacustre. Dans ce cadre, en s’appuyant sur le couplage entre paléolimnologie et outils de séquençage massif appliqués à l’ADN sédimentaire, ces travaux ont pour but (i) d’apporter des connaissances concernant la préservation de l’ADN des microbes eucaryotes dans les sédiments lacustres (ii) d’appliquer l’approche de paléogénétique sur des carottes sédimentaires issues de 3 lacs pour révéler la dynamique à long terme (de la décennie au millénaire) des microbes eucaryotes en lien avec l’évolution des conditions climatiques et anthropiques. Les résultats acquis sur le lac du Bourget ont permis de mettre en évidence l’efficacité d’archivage de l’ADN planctonique dans les sédiments récents pour la plupart des groupes eucaryotes (notamment chrysophycées, chytrides, chlorophytes, cercozoaires, ciliés, dinophycées). A partir d’une collection de carottes (issues du lac suédois Nylandssjön), l’effet de la diagénèse s’opérant au cours des premières années d’enfouissement a été évalué, permettant de démontrer que si la richesse taxonomique n’est pas impactée, des variations peuvent être détectées dans la structure de la communauté au cours des 10 premières années d’archivage avec une stabilisation du signal au-delà de cette période. L’approche paléogénétique a, en parallèle, été déployée d’une part à l’échelle du siècle sur deux lacs de même typologie mais ayant subi des niveaux d’eutrophisation contrastés, et d’autre part à une échelle temporelle plus longue (2200 ans) pour deux lacs de typologie contrastée (lac du Bourget, France et Igaliku, Groenland). Les résultats acquis démontrent que des réarrangements des communautés s’opèrent de manière concomitante aux périodes climatiques (réchauffement médiéval, petit âge glaciaire, réchauffement récent), et que le réchauffement climatique au cours des 30 dernières années a plus particulièrement favorisé certains groupes, notamment la richesse et l’abondance des dinophycées (en condition non eutrophe ; lac d’Annecy et du Bourget). Toutefois l’effet de l’eutrophisation est identifié comme le facteur le plus structurant, notamment dans le lac du Bourget (cas d’eutrophisation marquée, ~120 µgP.L-1). La forte influence du niveau d’eutrophisation est détectée sur la communauté eucaryote totale et plus particulièrement sur des groupes spécifiques tels que les chlorophytes et les ciliés. Les réarrangements majeurs de la communauté sont par ailleurs marqués par la mobilisation de taxons rares dans l’assemblage microbien eucaryote suggérant le rôle de la biosphère rare dans la capacité tampon des écosystèmes. Ces travaux pluridisciplinaires comptent parmi les premières études paléogénétiques appliquées aux microbes eucaryotes lacustres, contribuant de manière inédite aux connaissances de leur dynamique temporelle à long terme. Ces études tendent à confirmer le potentiel de ces approches pour reconstituer une vaste diversité de communautés lacustres. Les perspectives qui se dessinent dans la continuité de ces travaux concernent à la fois des aspects méthodologiques autour de la calibration du signal ADN archivé et la nécessité de déployer cette approche pour des lacs (sélectionnés) de typologies et histoires écologiques variées. / Eutrophication and climate warming are key factors governing lake functioning. However, there is a lack of knowledge about the response of microbial eukaryotic communities to these forcing factors even though microbial eukaryotes represent a huge taxonomic and functional diversity within lacustrine trophic networks. Paleolimnology has a well-established reputation for providing valuable insights into the drivers of biological assemblages over long time scales. The emergence of DNA analyses of lake sediments opens up many new opportunities for the reconstruction of past lacustrine biodiversity, including taxa that do not leave distinct morphological fossils. The present work aimed (i) to gain knowledge about the preservation of microbial eukaryotes DNA in lacustrine sediments (ii) to apply DNA-based methods to dated sediments in order to reveal the long-term dynamics (centennial to millennial) of microbial eukaryotes related to climatic and anthropogenic changes. The results obtained for Lake Bourget demonstrated the good efficiency of planktonic DNA archiving in recent sediments for most of microbial groups (chrysophyceae, chytrids, chlorophytes, cercozoa, ciliates, dinophyceae …). In complement, the use of a unique collection of freeze cores of varved sediment (Lake Nylandssjön, Sweden) allowed to assess the effects of diagenetic processes on microbial eukaryotes DNA occurring during the first years of burying. While the richness of the microbial eukaryotic community was not impacted, modifications were detected on the community structure during the first 15 years after deposition, then the DNA signal became stable. The paleoecological approach was applied to quantify centennial to millennial-scale dynamics on two deep peri-alpine lakes selected for their contrasted trophic history (lakes Bourget and Annecy, France) and two lakes with contrasted typologies (Lake Bourget, France and Lake Igaliku, Greenland). The results showed that some community rearrangements were concomitant with climate events (i.e. medieval warming, little ice age, recent warming) and that the recent climatic warming (over the last 30 years) favored more particularly some microbial groups including the dinophyceae (in terms of richness and relative abundance, in lakes Annecy and Bourget). However, the eutrophication seemed to prevail as a driver of these biological assemblages, in particular for Lake Bourget submitted to a marked eutrophication (up to 120 µg P. L-1 in the 1970s). The strong impact of the eutrophication was detected both at the whole community level and for specific groups such as chlorophytes and ciliates. Major rearrangements within eukaryotes community were also marked by the mobilization of rare taxa suggesting an important role of the rare biosphere as a reservoir of diversity to buffer the impacts of environmental stress. This multidisciplinary work thus provide new insights into the long-term dynamics of microbial eukaryotes communities. Our results confirm the potential of the application of high-throughput sequencing to sedimentary DNA for the lacustrine biodiversity reconstruction. Although these approaches are promising for further revolutionizing our understanding of long-term ecological dynamics, careful calibration studies are still to be conducted, as with any paleolimnological proxy. The generalization of our results is also to be tested using a sufficient number of lakes selected for their specific typologies and ecological histories (multi-lakes approach).

Les complexes multi-protéiques jouent un rôle crucial dans les cellules vivantes en catalysant et servant d'intermédiaires entre pratiquement toutes les activités cellulaires essentielles. Cependant, un grand nombre de ces machines se trouvent en très faibles quantités dans les cellules en particulier en ce qui concernent les complexes eucaryotes. Ceci est réfractaire à leur extraction à grande échelle et empêche sévèrement l'élucidation de leur structure et fonction. Dans le but de rendre les complexes multi protéiques accessibles par la voie de production recombinante, le groupe Berger a mis au point un ensemble de systèmes d'expression sur mesure pour la surproduction de complexes multi protéiques dans différents organismes hôtes incluant E. coli, les cellules d'insectes et les cellules de mammifères. Ces systèmes et en particulier le système MultiBac baculovirus/cellules d'insecte ont d'ors et déjà grandement contribués à l'étude de l'assemblage structural et fonctionnel à l'échelle moléculaire et atomique de nombreux complexes multi protéiques importants. Cela inclut en particulier le facteur général humain de transcription TFIID, un complexe de ~1.5 MDa qui constitue le sujet de recherche du laboratoire Berger. Mes contributions dans le développement de la technologie pour la production et dans l'élucidation des complexes TFIID humains sont discutées en détails dans cette thèse. / Multiprotein complexes play a crucial role in living cells by catalyzing and mediating virtually all essential cellular activities. However, many of these essential machines exist in very low endogenous amount in cells, in particular for eukaryotic complexes. This is refractory to large-scale extraction from native source material, severely impeding the elucidation of their structure and function. In order to make multiprotein complexes accessible by means of recombinant production, the Berger laboratory has developed an array of advanced expression systems tailor-made for overproducing multiprotein complexes in various host organisms including E. coli, insect cells and mammalian cells. Those systems, in particular the MultiBac baculovirus/insect cell system have already greatly contributed to studying the structural and functional assemblies of numerous important multiprotein complexes in molecular and atomic detail. Notably, this includes also the human general transcription factor TFIID, a ~1.5 MDa complex, which is the research focus of the Berger laboratory. My contributions to the expression technology development and to the structural elucidation of human TFIID complexes are discussed in details in this thesis.

The cytoplasm of eukaryotic cells contains several membrane-delimited compartments of specific molecular compositions and functions. Among those, the vacuole of fungal cells is often described as an organelle equivalent to the lysosomes of animal cells and the vacuoles of plant cells. These compartments indeed share two similar features: they contain a wide variety of hydrolases and are the most acidic compartments of the cell, which accounts for their key role in the intracellular degradation of macromolecules. In humans, dysfunctions of the lysosomes often give rise to lysosomal related diseases, such as lysosomal storage disorders. These are a class of metabolic disorders caused by the accumulation of non-degraded macromolecules or impaired export of hydrolytic degradation products. Cystinosis is an autosomal recessive disorder (1/200 000 incidence) generally associated with renal dysfunctions. It is caused by the accumulation and crystallization of cystine, the disulfide of cysteine, into the lumen of lysosomes. Cystinosin, the causative gene product of cystinosis, is present at the lysosomal membrane and catalyses the export of cystine from this compartment. The human cystinosin is a member of the Lysosomal Cystine Transporter (LCT) family. LCT proteins are conserved in all eukaryotic species and are defined by the presence of highly conserved PQ-loop motifs. <p>During this thesis work, we have studied three LCT proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae, named Ypq1, Ypq2 and Ypq3 (Yeast PQ-loop proteins 1, 2 and 3). We first showed that these proteins localize to the vacuolar membrane. We next studied the roles of these proteins, the regulation of their genes and the mechanisms and signals implicated in their delivery to the vacuolar membrane. We also contributed to the functional characterization of a mammalian homologue of yeast Ypq proteins, named rPqlc2. <p>In the first part of this work, we report that the Ypq proteins are most probably implicated in the export of basic amino acids from the vacuole to the cytosol. More precisely, Ypq2 and Ypq3 behave like vacuolar arginine and lysine exporters, respectively. Interestingly, the mammalian rPqlc2 protein expressed in yeast reaches the vacuolar membrane and functions as an orthologue of the Ypq proteins. Our results also reveal that the expression of the YPQ3 gene is regulated by the Lys14 transcription factor, responsible for the transcriptional activation of the LYS genes encoding enzymes implicated in the biosynthesis of lysine. We have also noted that, in general, the expression of the expression of the YPQ genes is regulated according to the quality of the nitrogen source available in the extracellular medium, eg. YPQ3 is sensitive to the nitrogen catabolite repression regulatory mechanism. <p>In the last part of this thesis work, we investigated the intracellular trafficking of the Ypq proteins and show that these predominantly reach the vacuolar membrane via the ALP (alkaline phosphatase) pathway due to the presence of a dileucine-based sorting signal in their sequences. Interestingly, a similar mechanism seems responsible for targeting to the yeast vacuole of the mammalian rPqlc2 protein.<p><p><p>Une caractéristique des cellules eucaryotes est leur organisation en compartiment internes délimité par une membrane lipidique, appelé organelles. Ces compartiments intracellulaires présentent une composition lipidique et protéique particulaire conforme à leur identité et fonction. Les lysosomes de cellules de mammifères et la vacuole fongique jouent un rôle clé dans la digestion intracellulaire de macromolécules et de ce fait leurs lumières sont enrichis d’enzymes hydrolytiques nécessaires à cette action. Des disfonctionnements du lysosome peuvent être la conséquence de pathologie chez l’homme, regroupé sous le nom de maladie lysosomale, lié à un à une accumulation de macromolécules non digéré ou un default d’export des produits d’hydrolysé depuis la lumière du lysosome. La cystinose est une maladie autosomale récessive avec une faible fréquence d’incidence (1/200 000) qui regroupe trois formes cliniques :deux formes rénales graves et une forme extra-rénale. Cette maladie est due à une accumulation et cristallisation de cystine dans la lumière du lysosome qui est corrélé à des mutations ponctuelles dans le gène CTNS qui code pour l’exporteur de cystine, la cystinosine. Cette protéine est un membre de la famille LCT (Lysosomal Cystine Transporter) qui possède des représentants chez les cellules animales, végétales et fongiques. Les protéines de la famille possèdent une taille et une topologie prédite similaire (7 segments transmembranaires) et on retrouve aussi au sein de ces protéines deux exemplaires de motifs PQ. Lors de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à trois membres de la famille LCT chez Saccharomyces cerevisiae que nous avons nommé Ypq1, Ypq2 et Ypq3 pour Yeast PQ-loop proteins. Ces protéines n’ayant pas fait l’objet de nombreuses études, nous nous sommes orientés vers une analyse fonctionnelle et transcriptionnelle. De plus, nous avons également étudié les mécanismes et signaux impliqué dans leur adressage vers la vacuole. Finalement, nous avons également inclus dans notre étude un homologue mammalien de ces protéines, rPqlc2. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Parmi les différents types de canaux ioniques, les canaux potassium (K+) sont très largement exprimés au niveau des cellules eucaryotes. Ils se répartissent en plusieurs familles et sous-familles. Parmi celles-ci, les canaux K+ ATP-dépendants (KATP) représentent une classe tout à fait particulière. En effet, ils ont la particularité d’être sensibles à la concentration cytosolique d’ATP et permettent ainsi de coupler le potentiel membranaire de la cellule à son statut métabolique.<p>Le canal KATP est un complexe hétéro-octamérique constitué de 2 sous-unités :une sous-unité Kir6.x (Kir6.1 ou Kir6.2) formant le pore du canal et appartenant à la famille des canaux potassiques de type « inward rectifier », et une sous-unité régulatrice SURx (SUR 1 ou SUR2A/B) faisant partie des protéines ABC (ATP-binding cassette). L’expression hétérologue des sous-unités Kir6.x et SURx suivant différentes combinaisons conduit à la formation de plusieurs types de canaux KATP possédant des propriétés électro-physiologiques et des sensibilités aux nucléotides et aux agents pharmacologiques distinctes. \ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Eukaryotic ribosome synthesis is a complex process that consumes a lot of energy and involves several hundreds of trans-acting factors that transiently associate with nascent ribosomes. Biogenesis of ribosomal subunits (the small 40S and the large 60S) starts with transcription of a long precursor ribosomal RNA (pre-rRNA) by RNA polymerase I (Pol I) in the nucleolus. This is a key step that globally controls yeast ribosome synthesis. The pre-rRNA, ‘the 35S transcript’, encodes the mature sequence (18S, 5.8S, and 25S) rRNA constituents of both the 40S and 60S subunits. The 35S transcript is subsequently modified, cleaved (processed) and assembled with numerous structural ribosomal proteins and ribosome synthesis factors (trans-acting factors) to form various ribosomal particles (pre-ribosomes, precursors to the 40S and 60S subunits) along ribosome assembly pathway. <p>In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, it has been reported recently that the processing of the 35S nascent transcript and the assembly of pre-ribosomes occur concomitantly with Pol I transcription in the nucleolus. In this process, the growing Pol I transcript gradually assembles with pre-40S structural ribosomal proteins and ribosomal synthesis factors to form the so-called ‘SSU-processome’ or ‘90S pre-ribosome’, the earliest precursor of the 40S subunit. The SSU-processome/90S pre-ribosome localizes to the nucleolus and consists of the 35S pre-rRNA, the U3 small nucleolar (sno) RNA, about a dozen of 40S ribosomal proteins and more than forty ribosome synthesis factors. The U3 snoRNA and pre-40S ribosome synthesis factors are all implicated in the processing of the 35S precursor (at sites A0, A1 and A2) and therefore in the synthesis of the 18S rRNA component of the 40S subunit. Significantly, the association of the U3 snoRNA with the growing 35S transcript is important for pre-40S assembly, whereas its dissociation from the processed transcript (following cleavage at sites A0-A2) is crucial for the overall structural remodeling of the 18S rRNA and for the formation of pre-40S ribosomes from the earliest precursor 90S particles. <p>This thesis mostly addresses the identification and functional characterization of Esf2 and Bfr2, two novel 40S synthesis factors, components of the SSU-processome/90S pre-ribosome in yeast. Both proteins localize to the nucleolus and their genetic depletions lead to failure in the production of 40S subunits. In the absence of either factor, the 35S pre-rRNA is not processed at sites A0-A2 and the 18S rRNA is not synthesized. Also, pre-ribosome assembly is affected and pre-40S ribosomes fail to mature properly. Strikingly, in the absence of either factor, the U3 snoRNA remains associated with unprocessed 35S transcript within pre-ribosomes indicating that Esf2 and Bfr2 are required to dissociate U3 from pre-ribosomes. This process also involves RNP (ribonucleoprotein particle) unwinding activities of the putative RNA helicase Dbp8. <p>La biogenèse du ribosome eucaryote est un processus complexe qui consomme beaucoup d’énergie et implique plusieurs centaines de facteurs trans qui s’associent de manière transitoire avec les pré-ribosomes en cours de formation. La biogenèse des sous-unités ribosomiques (la petite sous-unité 40S et la grande sous-unité 60S) débute dans le nucléole par la synthèse d’un long précurseur d’ARN ribosomique (le pré-ARNr, dit 35S chez la levure Saccharomyces cerevisiae) par l’ARN Polymérase I (Pol I). Ceci constitue une étape clé dans le contrôle global de la synthèse du ribosome chez la levure. Le pré-ARNr 35S renferme les séquences des ARNr matures 18S (ARNr de la sous-unité 40S) et 5.8S et 25S (deux des trois ARNr de la sous-unité 60S). Le pré-ARNr 35S subit un long processus de maturation et d’assemblage au cours duquel il est modifié, clivé (on parle du « processing » du pré-ARNr) et s’assemble avec des protéines ribosomiques (« RP », composants structuraux des sous-unités ribosomiques matures) et de nombreux facteurs de synthèse (facteurs trans) pour former différentes particules pré-ribosomiques (précurseurs des sous-unités 40S et 60S).<p><p>Chez la levure S. cerevisiae, il a récemment été montré que le processing du pré-ARNr 35S et l’assemblage des pré-ribosomes se produisent de manière concomminante avec la transcription Pol I dans le nucléole. Ainsi, le transcrit Pol I en cours de synthèse s’assemble progressivement avec des facteurs de synthèse ainsi que des RP pour former le « SSU processome » ou « pré-ribosome 90S », tout premier précurseur de la petite sous-unité 40S. Le SSU processome/pré-ribosome 90S est localisé dans le nucléole et est consisté du pré-ARNr 35S naissant, du petit ARN nucléolaire (snoRNA) U3, d’une douzaine de RP de la petite sous-unité 40S et de plus de 40 facteurs de synthèse. Le snoRNA U3 et ces facteurs de synthèse sont tous impliqués dans les clivages du pré-ARNr 35S aux sites A0, A1 et A2, et donc dans la biogenèse de l’ARNr 18S. L’association du snoRNA U3 avec le pré-ARNr 35S naissant est importante pour l’assemblage du SSU processome/pré-ribosome 90S. Par ailleurs, sa dissociation après les clivages aux sites A0-A2 permet un remodelage structural général de l’ARNr 18S et la formation du « pré-ribosome 40S » à partir de la particule précoce 90S.<p><p>Au cours de cette thèse, nous avons identifié et caractérisé fonctionnelement chez la levure deux nouveaux facteurs de synthèse de la petite sous-unité 40S et composants du SSU processome/pré-ribosome 90S: Esf2 et Bfr2. Ces deux protéines sont localisées dans le nucléole. Leur déplétion entraîne une incapacité à produire la sous-unité ribosomique 40S. En l’absence d’Esf2 ou Bfr2, le pré-ARNr 35S n’est plus clivé aux sites A0-A2 et l’ARNr 18S mature n’est plus produit. L’assemblage des pré-ribosomes est aussi affecté, notamment la formation du pré-ribosome 40S. De manière importante, en l’absence de l’un ou l’autre de ces facteurs, le snoRNA U3 reste associé au pré-ARNr 35S non clivé au sein des pré-ribosomes, indiquant qu’Esf2 et Bfr2 sont requises pour la dissociation d’U3 des pré-ribosomes. Ce processus implique aussi Dbp8, une hélicase à ARN présumée.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le sol est essentiel à toute société humaine notamment pour la production d'aliments. Son fonctionnement repose sur des réseaux d'interactions entre les éléments qui le composent et toute perturbation modifie ces réseaux. Les microorganismes eucaryotes représentent une composante importante de l'écosystème édaphique car ils sont impliqués dans des processus essentiels comme la régulation de populations de procaryotes. Mais paradoxalement, ils restent peu étudiés comparés aux bactéries notamment lorsqu'on s'intéresse aux cycles biogéochimiques autres que celui du carbone comme par exemple ceux des métaux. Suite à une pollution par des métaux, certains de ces microorganismes eucaryotes développent des mécanismes « de résistance » cellulaires. Dans ce contexte, le laboratoire d'accueil a isolé, directement à partir d'extraits d'ARN de sol, des gènes eucaryotes impliqués dans la résistance cellulaire au Cd. Ces nouveaux gènes forment une famille codant des protéines riches en cystéines dont les positions sont conservées au sein de cette famille. Mon projet de thèse a eu pour but de caractériser l'origine taxonomique et la fonction de cette famille de gènes. Dans un premier temps, la purification de cinq de ces protéines produites dans Escherichia coli et leurs caractérisations biochimiques par des méthodes spectrométriques ont permis de montrer que cette famille génique constitue une nouvelle famille de métallothionéines capables de chélater in vitro le Zn, le Cu et le Cd. Dans un second temps, une méthode de quantification par PCR quantitative de l'expression de ces gènes, extraits à partir de sol provenant de microcosmes, a été mise au point. Dans un troisième temps, nous avons tenté d'obtenir les régions génomiques bordant ces gènes environnementaux afin d'affilier les organismes qui les portent à un groupe taxonomique et d'analyser les régions promotrices de ces gènes par capture ciblée de gènes / Soil is essential to human societies, especially for food production. Its functioning relies on interaction networks sensitive to environmental alterations. Eukaryotic microorganisms are an important component of the soil ecosystem where they are involved in essential processes such as the regulation of prokaryotic populations. However, they remain poorly studied compared to bacteria, especially concerning their roles in biogeochemical cycles other than the carbon one such as metal cycles. In response to soil metal contamination, some of these eukaryotic microorganisms develop cellular "resistance" mechanisms. In this context, the host laboratory has previously isolated, directly from soils, eukaryotic genes able to confer Cd resistance. These genes form a family coding for cysteine-rich proteins whose cysteine positions are conserved within this sequences. My thesis project aimed at characterizing the function and taxonomic origin of this gene family. First, the purification of five of these proteins produced in Escherichia coli and their biochemical characterizations by spectrometric methods demonstrated that this gene family constitutes a new family of metallothioneins capable of chelating in vitro Zn, Cu and Cd. Some of these proteins are also able to confer Zn resistance when expressed in a sensitive yeast strain. In a second step, quantitative PCR methods for measuring expression levels of these genes in soil microcosms were developed. This will allow to evaluate the level of expression of these genes as a function of an increasing supply of exogenous metal. In a third step, we tried to obtain the genomic regions flanking these environmental genes in order to be able to associate the organisms from which they originate to a taxonomic group and to analyze the promoter regions of these genes using targeted capture

Les zones littorales à macrophytes ont un rôle fonctionnel important dans les hydrosystèmes fluviaux. Outre leur forte productivité, ces milieux se caractérisent également par une forte biodiversité. Cependant, les liens pouvant exister entre hétérogénéité spatiale, biodiversité et flux de matière restent encore peu connus. En milieu aquatique, les microcrustacés représentent un maillon clef entre les microorganismes eucaryotes, qui sont les principaux producteurs d’acide gras polyinsaturés (AGPI), et le compartiment piscicole. Dans ce travail de thèse, nous avons donc cherché à savoir comment la diversité des cladocères rencontrée dans une zone littorale à macrophytes pouvait affecter le transfert des AGPI dans les réseaux trophiques. L’approche vers laquelle s’est orienté ce travail combine à la fois des études menées en milieu contrôlé, permettant des expériences de nutrition, ainsi que des études menées en milieu naturel. Cette double approche permet de faciliter l’interprétation des résultats issus des analyses lipidiques, isotopiques et isotopiques de composés spécifiques. Nos résultats montrent ainsi qu’il n’existe pas de variabilité dans les capacités d’accumulation et de bioconversion des AGPI chez les cladocères coexistant dans une zone littorale à macrophytes. D’après ces résultats, il semble donc que le principal facteur influençant la variabilité des transferts d’AGPI vers le compartiment piscicole soit la stratégie alimentaire et le compartiment trophique exploité par les différentes espèces de microcrustacés. En effet, outre le seston, notre étude montre que certaines espèces de cladocères rencontrées en zone littorale sont capables d’exploiter l’épiphyton et le neuston. Les analyses lipidiques mettent de plus en évidence, que la diversité des compartiments trophiques exploités s’accompagne d’une variabilité d’apports en AGPI. Dans notre étude, l’épiphyton est ainsi significativement plus concentré en AGPI que le seston. A l’interface air-eau, le neuston se caractérise de plus, par une forte accumulation de matière organique d’origine allochtone qui, dans le cas d’une pluie de pollen, représente une source de carbone et d’AGPI non négligeable pour certaines espèces de microcrustacés. Dans les zones littorales à macrophytes, la complémentarité des espèces de cladocères entraine donc une utilisation plus complète des ressources. La diversité des compartiments trophiques, associée à la diversité des microcrustacés, permet donc probablement une optimisation du transfert des AGPI vers les niveaux trophiques supérieurs. / Areas with littoral macrophytes play an important functional role in freshwater systems. In addition to the high productivity recorded in such areas, they also shelter a high diversity of organisms. However, possible links between spatial heterogeneity, biodiversity and energy pathways are still poorly known. As they constitute the major link between microorganisms and species higher in the food web, microcrustaceans play a key role in the transfer of polyunsaturated fatty acids (PUFA) to organisms at higher trophic levels. In this study, we wanted to assess if microcrustaceans diversity encountered in macrophytes littoral zones would lead to a variability of PUFA transfer in the food web. This work combined controlled conditions experiment and studies run in natural environments in order to help the interpretation of results from lipid analysis, isotopic analysis and fatty acid isotope analysis. Our results indicate that there are no differences of PUFA concentrations between cladocerans from a macrophyte littoral zone when they were exposed to the same pool of dietary PUFA. Hence, in heterogeneous feeding habitats such as macrophytes zones where these cladocerans often co-exist, foraging behavior of cladoceran species more than differences of metabolism may be crucial for determining PUFA transfer to upper trophic levels. In addition to seston, our study shows indeed that some cladoceran species are able to forage on the epiphytic and neustonic compartments. Lipid analyses highlight moreover that the diversity of trophic compartments lead to a variability of PUFA inputs to primary consumers. In our study, the epiphytic compartment is indeed significantly more concentrated in PUFA than seston. At the air-water interface, neuston is moreover characterized by important allochthonous organic matter accumulation. During a pollen rain, this organic matter represents an important source of carbon and PUFA for some microcrustacean species. In macrophytes littoral zones, cladocerans complementarity leads to a more complete use of PUFA sources. The association of trophic compartment diversity and microcrustacean diversity probably allows an optimization of PUFA transfer to higher trophic levels.

L’objectif de ce projet de thèse est d’étudier et caractériser les mécanismes impliqués dans la bascule respiro-fermentaire chez des cellules eucaryotes dotées d’un métabolisme mitochondrial. Les cellules eucaryotes ont des besoins différents en oxygène pour la production d’énergie et leur survie dans un environnement donnée. Elles sont qualifiées de type aérobie stricte lorsque la présence d’oxygène leur est nécessaire ou aéro-anaérobie facultatif dans le cas où l’oxygène n’est pas indispensable à la production d’énergie. La levure Yarrowia lipolytica a été choisie comme modèle d’étude de par sa particularité à être un micro-organisme aérobie strict avec une grande capacité d’accumuler de lipides et de production d’acides organiques. Les études expérimentales et analytiques, par l’emploi de méthodes mathématiques de modélisation du métabolisme, ont permis d’identifier des contraintes métaboliques impliquées dans la transition respiro-fermentaire chez cette levure au métabolisme énergétique oxydatif. La production de l’acide citrique par Y. lipolytica, déjà rapportée dans la littérature, a été choisi comme un marqueur de cette transition respiro-fermentaire. Nous avons découvert que l’inhibition de la protéine oxydase alternative (AOX), impliquée dans la respiration mitochondriale, par la molécule n-propyl gallate (nPG) permet d’améliorer le rendement de production d’acide citrique par fermentation du glucose dans une culture de Y. lipolytica. Ces résultats montrent que la nPG, déjà utilisée dans l’industrie agro-alimentaire et pharmaceutique en tant que conservateur joue sur la bascule respiro-fermentaire par inhibition de la consommation d’oxygène et stimule ainsi la production d’acide citrique. La modélisation du réseau métabolique de Y. lipolytica, décrit à l’échelle du genome, par dynamic Flux Balance Analysis (dFBA) a permis d’identifier l’accumulation des espèces oxydantes dites ROS (Reactive Oxygen Species) comme un levier majeur de la bascule respiro-fermentaire et donc de la production d’acide citrique chez la levure Y. lipolytica. De plus, nos résultats préliminaires montrent que l’oxydation des lipides accumulés par Y. lipolytica pourrait être à l’origine de la génération des ROS. Cette étude doit être approfondie expérimentalement et constitue un apport important pour l’industrie agro-alimentaire et pharmaceutique.Mots clés : Bascule respiro-fermentaire, Acide citrique, lipides, Yarrowia lipolytica, n-propyl gallate, Reactive Oxygen Species, modélisation, dynamic Flux Balance Analysis / The main goal of this thesis project is to study and characterize mechanisms involved in respiratory to fermentative shift in eukaryotic cells endowed with mitochondrial metabolism. Eukaryotic cells have different oxygen requirements for energy production and survival in a given environment. They are described as strict aerobic when the presence of oxygen is necessary or optional aero-anaerobic in when oxygen is not essential for energy production. The yeast Yarrowia lipolytica was chosen as our study model thanks to its particularity since it is a strict aerobic microorganism with a high capacity to accumulate lipids and to produce organic acids. Experimental and analytical studies, using mathematical methods for modeling cell metabolism, allowed us to identify metabolic constraints involved in respiratory to fermentative transition in this yeast showing oxidative energy metabolism. Production of citric acid by Y. lipolytica, already reported in the literature, has been chosen as a marker for this in respiratory to fermentative shift. We found that the inhibition of the alternative oxidase protein (AOX) involved in mitochondrial respiration, by adding n-Propyl gallate (nPG) molecule improves the yield of citric acid production by fermentation of glucose in a Y. lipolytica culture. These results show that nPG, already used in food and pharmaceutical industry as a preservative, plays on respiratory to fermentative balance by inhibition of oxygen consumption and thus stimulates the production of citric acid. Modeling of the metabolic network of Y. lipolytica, described at genome-scale, by dynamic Flux Balance Analysis (FBA) has identified the accumulation of intracellular ROS (Reactive Oxygen Species) species as major levers for respiratory to fermentative shift and therefore the production of citric acid by Y. lipolytica. Therefore, our preliminary results show that oxidation of lipids accumulated by Y. lipolytica could be involved in generation of ROS species. This study must be experimentally deepened and constitutes an important contribution for the agri-food and pharmaceutical industry.Key words: Respiratory to fermentative shift, Citric acid, lipids, Yarrowia lipolytica, n-Propyl gallate, Reactive Oxygen Species, modeling, dynamic Flux Balance Analysis

Les eucaryotes sont des organismes chimériques issus de l’endosymbiose entre une archéobactérie et une α-protéobactérie. Au cours de ce processus, ces organismes ont évolué de sorte à obtenir un grand nombre de caractéristiques observées chez les eucaryotes modernes, notamment une mitochondrie, un noyau, un système endomembranaire, un système d’épissage ou encore des chromosomes linéaires terminés par un télomère. Bien que les caractéristiques du dernier ancêtre commun des eucaryotes aient majoritairement été identifié, la suite des évènements évolutifs ayant mené à l’apparition de cet organisme demeure peu compris. Afin de mieux reconstruire cette suite d’évènements, l’analyse des génomes d’organismes basals aux eucaryotes sera nécessaire pour identifier des traces de cette évolution. Ainsi, nous proposons que l’analyse d’une collection de génomes d’eucaryotes « primitifs », les jakobides et malawimonades, des eucaryotes unicellulaires flagellés se nourrissant de bactéries, pourrait permettre une meilleure compréhension de ce processus. De plus, il a été supposé que le génome d’un de ces organismes, Andalucia godoyi, pourrait posséder des chromosomes circulaires, une caractéristique atypique chez les eucaryotes, une caractéristique qui pourra être confirmée par la production d’assemblage génomique de haute contigüité. Afin d’obtenir des assemblages génomiques de haute qualité, les jakobides A. godoyi, Jakoba bahamiensis, Seculamonas ecuadoriensis, Stygiella incarcerata et le malawimonades Malawimonas californiana ont été séquencés par nanopore. Le séquençage nanopore a présenté des résultats mitigés et les organismes J. bahamiensis et M. californiana ont présentés un faible rendement de séquençage, possiblement dû à la contamination par des polysaccharides. Pour les autres organismes, nous avons développé un pipeline d’assemblage utilisant les assembleurs Flye et Shasta qui nous a permis de produire des assemblages génomiques. L’analyse du génome de A. godoyi a permis d’identifier la présence de quatre chromosomes circulaires, possiblement localisés dans le noyau, contenant plusieurs gènes liés au métabolisme, au transport et à la signalisation et qui constituent possiblement un type de chromosome circulaire différent de ceux observés précédemment chez les eucaryotes. Dans l’ensemble, ces travaux ont permis la mise en place d’une collection de génome d’eucaryotes « primitifs » qui pourront être utilisés pour des analyse de génomique comparative afin de mieux comprendre l’évolution des eucaryotes. / Eucaryotes are chimeric organisms that are the product of an endosymbiotic event between an archaebacteria and an α-proteobacteria. During the eukaryogenesis, these organisms have gained many characteristics that defines modern eucaryotes such as a mitochondrion, a nucleus, an endomembrane system, the splicing machinery, and linear chromosome with telomeres. While most characteristics of the last common eukaryote ancestor have mostly been identified, most of the evolutionary process that led to this organism is still unknown. To reconstruct this string of event, we must analyse the genome of “primitive” basal eukaryotes with a slow evolutionary rate and a lifestyle like that of the last common eukaryotes ancestor, and thus are most likely to contain remains of ancestral mechanisms that have been lost in most known eukaryotes. We propose that this analysis of the genome of the jakobids and malawimonads, two groups are free-living flagellate that feeds on bacteria, could provide such clues on the evolution of eukaryotes. Using nanopore sequencing, a collection of high-quality genomes has been built to help in this analysis. Furthermore, it has been supposed that the genome of the jakobid Andalucia godoyi could be composed to both linear and circular chromosomes, a genomic structure that have not been identified in other eukaryotes, which was investigated using the high quality nanopore assembly. To generate a collection of high-quality genome assemblies, we have sequenced the genomes of the jakobids A. godoyi, Jakoba bahamiensis, Seculamonas ecuadoriensis and Stygiella incarcerata as well as the malawimonad Malawimonas californiana by nanopore. While the yields were too low for J. bahamiensis and M. californiana, probably due to a contamination by polysaccharides, we were able to assemble chromosome level genome for A. godoyi and S. incarcerata and high-quality draft genome for S. ecuadoriensis et R. americana. Using this assembly, we were able to identify four circular chromosomes in the genome of A. godoyi. The circular chromosomes are likely to be located in the nucleus and encodes genes with functions related to the metabolism, ions and macromolecules transport as well as signaling. Furthermore, these molecules differ from known circular chromosome in eukaryotes as they are unlikely to be selfish DNA elements, such as known eucaryotes plasmids, or circular by-product of replication identified in other eukaryotes. Overall, this work sets the bases for larger scale comparative genomics of the jakobids and malawimonads, by generating a small collection of genomes that will be used in future studies to better understand the origin of the eukaryotes.

Les mycobactéries sont classées parmi les bactéries contenant des acides mycoliques dans leur paroi et un haut GC% dans leur génome. Elles peuvent être isolées à partir du sol ou d'environnement d'eau douce où vivent aussi les protozoaires libres. Plusieurs études ont montré une possibilité de co-isolement des mycobactéries et des amibes à partir de ces sources environnementales. Il a été montré également que la plupart des mycobactéries de l'environnement ont la capacité à survivre dans les trophozoites et les kystes d'amibes et dans certaines cellules eucaryotes, y compris les macrophages. Les manipulations génétiques des mycobactéries en général et des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis en particulier sont compliquées et aucune étude de modification génétique des mycobactéries (pathogènes ou non pathogènes) n'avait été réalisée dans notre laboratoire avant notre travail de thèse. Dans notre travail de thèse, nous avons montré que les amibes ou d'autres organismes phagocytaires peuvent servir comme sources et lieu de transfert des gènes chez les mycobactéries. Ce transfert des gènes peut avoir contribué à l'adaptation des mycobactéries à un mode de vie intracellulaire. Nous avons développé ensuite deux systèmes de coculture: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga et Mycobacterium gilvum-A. polyphaga et nous avons clarifié le spectre des interactions des mycobactéries à croissance rapide avec les amibes. Ce modèle d'interaction mycobactéries-amibes a été utilisé pour tester l'hypothèse contraire au paradigme dominant que l'addition des gènes réduit la virulence des bactéries. / Mycobacteria are mycolic-acid containing, high GC% bacterial organisms which can be recovered from soil and fresh water environments where free-living protozoa also live. Co-isolation of mycobacteria and amoeba collected from such environmental sources has been reported. Several experiments further demonstrated the ability of most environmental mycobacteria to survive in the amoebal trophozoites and cysts and in some eukaryotic cells including macrophages. Genetic modification of mycobacteria in general and mycobacteria belonging to Mycobacterium tuberculosis complex in particular are complicated and no studies using genetic modification of mycobacteria (pathogenic or non-pathogenic) had been performed in our laboratory prior to our work. In our thesis work, we showed that amoebae or other phagocytic organisms can serve as sources and places for gene transfers in mycobacteria. Gene transfers may have contributed to the adaptation of mycobacteria to an intracellular lifestyle. In addition, we developed two co-culture systems: Mycobacterium smegmatis-Acanthamoeba polyphaga and Mycobacterium gilvum-A. polyphaga and we clarified the spectrum of rapid-growing mycobacteria and amoeba interactions. This model of mycobacteria-amoeba interactions was then used to test another hypothesis according to which unlike the prevailing paradigm, the addition of genes does not reduce the virulence of bacteria. For the first time in our laboratory we modified two species of the M. tuberculosis complex, M. tuberculosis H37Rv and Mycobacterium bovis BCG to observe the effect of these changes on their pathogenicity and survival.