Tesis por compendio / [ES] Resumen Como pez de gran valor económico, procedente de una de las líneas de teleósteos más antiguas, con un ciclo de vida misterioso, un potencial de acuicultura excepcional, y con importancia cultural y actividades de pesca en casi todos los países de Europa, la anguila europea posee un enorme valor socioeconómico. Este valor se suma a la desgraciada situación actual en peligro crítico de población natural de anguilas europeas. Como el ciclo de vida de la anguila aún no se ha conseguido cerrar en cautiverio, si la especie se extingue en la naturaleza, no seremos capaces de recuperarla. El cierre del ciclo de vida de la anguila europea ha sido, por lo tanto, el objetivo final de varios estudios. Sin embargo, a pesar de una investigación científica sustancial, desde la década de 1930, varios aspectos de la maduración de la anguila, como el mecanismo que bloquea la maduración de la anguila en la etapa prepúber en cautiverio, aún no se conocen bien. Por lo tanto, es necesario ampliar nuestro conocimiento sobre la reproducción de la anguila para inducir mejores hipótesis y lograr un progreso sustancial. Para profundizar en este campo, esta tesis se realizó con el objetivo específico de desarrollar métodos innovadores para la inducción de la maduración de la anguila y aumentar el conjunto de conocimientos sobre los procesos europeos de maduración de la anguila. Los procedimientos hormonales utilizados actualmente para la maduración sexual de la anguila artificial probablemente no induzcan el proceso natural de maduración. Por lo tanto, esta tesis ha evaluado el potencial de las hormonas recombinantes específicas de la anguila para inducir un proceso de maduración más natural. Este estudio específico mostró que la espermatogénesis completa y la espermiación se pueden inducir con gonadotropinas específicas de anguila recombinante; sin embargo, la calidad del gameto resultante es aún inferior a los resultados de los protocolos establecidos. Sin embargo, la utilización de hormonas recombinantes tiene un gran potencial para futuras implementaciones. Además, el experimento de gonadotropina recombinante ha generado nuevos detalles sobre el efecto de las gonadotropinas homólogas en el eje BPG de las anguilas europeas. Trabajos previos han llevado a la hipótesis de que un tratamiento térmico adecuado puede reducir o reemplazar parcialmente los tratamientos hormonales estándar para la maduración sexual de la anguila europea, o puede mejorar la calidad y / o cantidad de gametos. En esta tesis, se probó el efecto de varios regímenes térmicos en el eje BPG de machos de anguila europeos prepúberes, sin administración de hormonas. Los resultados muestran claramente que un tratamiento de agua de mar fría durante 2 semanas (10 ° C) afecta el eje BPG de los machos de anguila europeas. Los resultados específicos incluyeron un aumento en la sincronización de espermatogonias, niveles elevados de testosterona y 11-ketotestosterona en plasma, agrupamiento de muestras de transcriptomas del eje BPG del grupo tratado con agua de mar fría y posiblemente niveles aumentados de la proteína subunidad ß de la hormona luteinizante de la hipófisis. Los genes transcritos diferencialmente incluyeron varios genes, procesos y vías interesantes, que parecen estar involucrados en la maduración "natural" temprana de la anguila y que pueden ser biomarcadores adecuados para las distintas etapas de este proceso. Para un análisis adecuado de los datos transcriptómicos, se creó un transcriptoma de anguila europea de novo. Se demostró que este transcriptoma de novo posee una superior integridad al genoma de anguila europea disponible y, por lo tanto, es una herramienta útil para el análisis adicional de genes específicos. Un análisis de este transcriptoma reveló un gran número de pares de genes parálogos, que mostraron una baja divergencia entre secuencias sinónimas. Entre las hipótesis potenciales sobre e / [CA] Com a espècie de renom culinari que pertany a un dels llinatges teleostis més antics, amb un cicle vital misteriós, un potencial d'aqüicultura excepcional, i una tradició pesquera a gairebé tots els països d'Europa, l'anguila europea posseeix un enorme valor socioeconòmic. No obstant això, aquest valor només fa que augmentar la preocupació de la seva població, que actualment es troba catalogada com "en perill crític d'extinció". Atès que el cicle de vida de les anguiles encara no ha estat tancat en captivitat, l'espècie no serà salvable en el cas que s'extingeixi en estat natural, per la qual cosa tancar el cicle de vida d'aquesta espècie ha estat l'objectiu final de diversos grups d'investigació durant els últims anys.. No obstant això, i malgrat la investigació científica de qualitat duta a terme des de la dècada de 1930, encara hi han diversos aspectes de la maduració de les anguiles -com el mecanisme que bloqueja la maduració sexual de l'anguila a l'etapa pre-puberal en captivitat- que son poc coneguts en l'actualitat. Per tal d'ampliar els coneixements sobre la reproducció de les anguiles i aconseguir un progrés substancial, aquesta tesi es va dur a terme amb l'objectiu específic de desenvolupar mètodes innovadors per a la inducció de la maduració de l'anguila europea, a més de afegir-hi el coneixement en els processos de maduració bàsics d'aquesta espècie. Els procediments hormonals utilitzats actualment per a la maduració artificial de l'anguila europea no acaben d'induir el procés de maduració natural tal i com probablement es dóna a la natura. Doncs, en primer lloc, aquesta tesi va avaluar el potencial d'hormones recombinants específiques d'anguila europea per induir un procés de maduració molt més natural. Aquest estudi específic va mostrar que mitjançant estes gonadotropines específiques d'anguila europea és possible induir l'espermatogènesi i l'espermiació completes. Tot i que els resultats van mostrar que la qualitat dels gamets va ser inferior als resultats que generen els protocols establerts fins ara amb un altre tipus d'hormones (generalment d'origen humà), la utilització d'hormones recombinants específiques es presenta amb un gran potencial per a la seva implementació futura en la inducció de la maduració sexual de l'anguila europea, ja que l'estudi va generar noves idees sobre l'efecte de les gonadotropines l'eix BPG de l'anguila europea. En segon lloc, i treballant amb la hipòtesi que un tractament tèrmic adequat pot reduir o substituir parcialment els tractaments hormonals estàndards per a la maduració sexual de l'anguila europea, en aquesta tesi es va provar l'efecte de diversos règims tèrmics (sense administració d'hormones) en l'eix BPG dels mascles europeus pre-puberals amb l'objectiu de millorar la qualitat i / o quantitat dels gamets. Els resultats mostraren clarament que un tractament d'aigua de mar de 2 setmanes a baixa temperatura (10 °C) va afectar l'eix BPG dels mascles europeus d'anguila. Resultats més específics van mostrar un augment de la sincronització de les espermatogonies, elevats nivells plasmàtics de testosterona i 11-ketotestosterona, una agrupació de mostres de transcriptoma de l'eix BPG del grup tractat amb aigua de mar freda i, possiblement, un augment dels nivells de la proteïna de la subunitat ß de la hormona luteinitzant de la hipofisi. Els gens transcrits diferencials van al·ludir a diversos gens, processos i vies interessants, que semblen estar implicats en la maduració inicial de l'anguila "natural" i podrien resultar biomarcadors adequats per a les etapes d'aquest procés. No obstant això, es necessiten estudis addicionals per avaluar el potencial dels biomarcadors d'aquests gens i, de manera complementària, comprovar si un pre-tractament d'aigua de mar freda pot millorar la resposta de les anguiles europees a un tractament hormonal artificial, com suggereixen els resultats. Finalment, amb l'objectiu / [EN] As an expensive fish from one of the most ancient teleost lineages, with a mysterious life cycle, exceptional aquaculture potential, and cultural associations and fishing activity in almost every country in Europe, the European eel possess huge socioeconomic value. This value only adds to the misfortune of the current critically endangered state of the wild European eel population. As the eel lifecycle has not yet been closed in captivity, the species will not be salvable if it went extinct in the wild. Closing the life-cycle of the European eel has thus been the ultimate objective of several studies. However, despite the substantial scientific investigation, since the 1930s, several aspects of eel maturation, such as the mechanism which blocks eel sexual maturation at the pre-pubertal stage in captivity, is still poorly understood. Therefore, it is necessary to broaden our knowledge of eel reproduction to induce better hypotheses and therethrough achieve substantial progress. In order to further this field, this thesis was conducted with the specific objective of developing innovative methods for induction of eel maturation and add to the pool of knowledge of European eel maturation processes. The hormonal procedures currently used for artificial eel sexual maturation are probably not inducing the natural maturation process. Therefore, this thesis has evaluated the potential of eel specific recombinant hormones to induce a more natural maturation process. This specific study showed that full spermatogenesis and spermiation can be induced with recombinant eel specific gonadotropins; however, the resulting gamete quality is still inferior to the results of established protocols. Nevertheless, the utilization of recombinant hormones holds a large potential for future implementation. Furthermore, the recombinant gonadotropin experiment has generated novel insights into the effect of homologous gonadotropins on the BPG axis of European eels. Previous work has led to the hypothesis that the right thermal environmental treatment may reduce or partially replace the standard hormonal treatments for sexual maturation of European eel, or may improve gamete quality and/or quantity. In this thesis, the effect of various thermal regimes was tested on the BPG axis of pre-pubertal European eel males, without administration of hormones. The results clearly show that a 2 week cold (10 °C) seawater treatment effects the BPG-axis of European eel males. Specific results included an increase in the synchronization of spermatogonial cells, elevated testosterone and 11-ketotestosterone plasma levels, clustering of BPG-axis transcriptome samples from the cold seawater treated group and possibly increased levels of pituitary luteinizing hormone ß-subunit protein. Differentially transcribed genes alluded to several interesting genes, processes, and pathways, which appears to be involved in early "natural" eel maturation and may prove to be suitable biomarkers for the stages of this process. In order for proper analysis of the transcriptomic data, a de novo European eel transcriptome was assembled. This de novo transcriptome was proven to have superior completeness to the available European eel genome and is thus a useful tool for further analysis of specific genes. An analysis of this transcriptome revealed a large number of paralog gene pairs, which showed low synonymous sequence divergence. Among the potential hypothesis regarding the origin of these paralog gene pairs, the hypothesis of a 4R whole genome duplication is among the most parsimonious. Several of these duplicated genes were involved in reproduction and the onset of puberty. Regardless of the origin, further analysis of these genes may reveal eel specific adaptations, which could help to better understand the exceptional reproductive system of eels. / Rozenfeld, C. (2019). Development of innovative methods for induction of European eel (Anguilla anguilla) spermatogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/125697 / Compendio

The European eel, Anguilla anguilla, has a complex life-cycle involving migrations between the Sargasso Sea and the river systems of Europe and North Africa. The requirement to move across large salinity gradients presents a significant physiological challenge and the developmental stages of the eel are closely linked to these migrations. Microarrays were created to elucidate gene expression changes occurring during; i. The transition from juvenile yellow to the adult sexually maturing, migrating silver eel and; ii. Salinity adaptation during the migration from freshwater to seawater. Groups (n = 6) of freshwater-acclimated yellow or silver eels were transferred to seawater for between 6 hours and 5 months and complementary control groups were transferred to freshwater. Brain, kidney, intestine and gill cDNA libraries were constructed using suppression subtractive hybridisation (SSH) techniques and a novel protocol based on Invitrogen's Gateway cloning system. The latter technique produced a low redundancy (~4 %) EST bank with a wide range of insert sizes (0.5 – 10 kb). Two microarray types were produced; one comprised 5760 clones from the two brain libraries whilst the other was a multi-tissue microarray incorporating 6144 clones from the SSH libraries. Pooled RNA samples were probed against the microarrays to highlight differentially expressed genes. Real-time quantitative PCR (QPCR) was used to validate the observed expression changes of selected genes in the tissues of individual fish. Following yellow to silver transformation of freshwater-adapted eels, the expression of tyrosine 3-mono-oxygenase/tryptophan 5-mono-oxygenase activation protein (14-3-3) and vaccinia related kinase 3 was shown to be consistently elevated. Prolactin expression increased in the brains of silver eels following two-day seawater-acclimation but QPCR analysis revealed high variation amongst freshwater-adapted eels. This is the first eel microarray study and the expression profiles highlighted herein will provide new avenues for research into the sexual development and salinity acclimation of A. anguilla.

[ES] La selección de gametos de alta calidad es un requisito indispensable a tener en cuenta en los programas de reproduccion asistida. El desarrollo de herramientas biotecnológicas como la criopreservación de gametos, juega un papel importante en la producción acuicola y en la formación de bancos de germoplasma, que contribuiran luego en la mejora genética de las poblaciónes de peces, principalmente aquellas en peligro y que pudieran estar más afectadas ante futuros cambios climáticos. En la primera fase de esta tesis realizada en la Unesp, se trabajó con una especie neotropical de elevada importancia económica para la region Suramericana. La segunda fase realizada en la UPV se trabajó con la Anguila europea (Anguilla anguilla), una especie clasificada en la Lista Roja de la (UICN) como especie "en peligro crítico de extinción". En la primera fase se buscó caracterizar la composición bioquímica del plasma y las características seminales de la especie para evaluar las posibles relaciones entre estos parámetros. El plasma seminal estuvo principalmente compuesto por iones de sodio (Na+) y dentro de los componentes orgánicos sobresalieron las proteínas totales y la glucosa. A través del análisis de componentes principales (PCA) se observó que la motilidad tenía una fuerte correlación positiva con el tiempo de motilidad, la concentración de espermatozoides y las proteínas totales. Estos análisis sirvieron de base para la creación de una solución diluyente utilizada posteriormente en la sustancia crioprotectora. Luego se determinó la influencia del plasma seminal como constituyente de la solución crioprotectora en la criopreservación de semen de P. reticulatum. Se utilizaron tres tratamientos: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a este crioprotector se le agregó 30% de plasma seminal natural (T2) y 30% de plasma seminal artificial en base a los resultados de los componentes bioquímicos del plasma determinados para la especie en el experimento anterior (T3). Se evaluaron parámetros de motilidad espermática, capacidad fecundante del semen criopreservado, así como fragmentación del ADN. El tratamiento T1 resultó con los mejores valores de motilidad seguido del T2, y la capacidad fertilizante de estos dos tratamientos fue similar al control, sin embargo, el tratamiento T2 mostró menos daño en el ADN. Mediante el PCA se demostró que T1 tenía una mejor relación positiva con la fertilidad y la motilidad total y progresiva. Finalmente, evaluamos las estructuras de las subpoblaciones espermáticas en cada uno de los tratamientos utilizados. Mediante análisis multivariado en dos etapas, fue posible determinar tres subpoblaciones espermáticas en el semen crioconservado de la especie, SP1 (rápido-lineal), SP2 (rápido-no lineal) y SP3 (lento-lineal). T1 presentó el mayor porcentaje de SP1, siendo confirmado por la efectividad en la protección de las células de este tratamiento en el proceso de criopreservación de la especie. En la segunda fase que se está llevó a cabo en la UPV, el objetivo general fue determinar el efecto de la temperatura y el pH del agua de mar sobre la motilidad de los espermatozoides en la Anguila europea. Se determinó que el bajo pH del agua de mar (6.5-7.4) disminuyó la motilidad de los espermatozoides de anguila en comparación con el control (pH= 8.2). Cuando estudiamos el efecto combinado del pH del plasma seminal artificial y el pH de ASW (7.8 y 8.2), no encontramos diferencias estadísticas en la motilidad y cinética de los espermatozoides en relación con el pH del plasma seminal artificial, pero sí el pH del agua de mar. Se encontraron valores más altos de motilidad total (MOT), FA(rápidos) y ME (médios) con un pH de 8.2 que con un pH de 7.8. En contraste, la temperatura del agua de mar no afectó los parámetros de motilidad de los espermatozoides o la longevidad de los espermatozoides en el contexto del cambio climático. / [CA] La selecció de gàmetes d'alta qualitat és un requisit indispensable a tenir en compte en els programes de reproducció assistida. El desenvolupament d'eines biotecnològiques com la criopreservació de gàmetes, juga un paper important en la producció aqüicola i en la formació de bancs de germoplasma, que contribuiran després a la millora genètica de les població de peixos, principalment aquelles en perill i que poguessin estar més afectades davant de futurs canvis climàtics. A la primera fase d'aquesta tesi realitzada a la Unesp, es va treballar amb una espècie neotropical d'elevada importància econòmica per a la regió sud-americana. La segona fase realitzada a la UPV es va treballar amb l'Anguilla europea (Anguilla anguilla), una espècie classificada a la Llista Vermella de la (UICN) com a espècie "en perill crític d'extinció". A la primera fase es va buscar caracteritzar la composició bioquímica del plasma i les característiques seminals de l'espècie per avaluar les possibles relacions entre aquests paràmetres. El plasma seminal va estar principalment compost per ions de sodi (Na+) i dins dels components orgànics van sobresortir les proteïnes totals i la glucosa. A través de l'anàlisi de components principals (PCA), es va observar que la motilitat tenia una forta correlació positiva amb el temps de motilitat, la concentració d'espermatozoides i les proteïnes totals. Aquestes anàlisis van servir de base per a la creació d'una solució diluent utilitzada posteriorment a la substància crioprotectora. Després es va determinar la influència del plasma seminal com a constituent de la solució crioprotectora en la criopreservació de semen de P. reticulatum. Es van utilitzar tres tractaments: glucosa 5% + metanol 10% (T1), a aquest crioprotector se li va afegir 30% de plasma seminal natural (T2) i 30% de plasma seminal artificial sobre la base dels resultats dels components bioquímics del plasma determinats per a l'espècie a l'experiment anterior (T3). S'avaluaren paràmetres de motilitat espermàtica, capacitat fecundant del semen criopreservat, així com fragmentació de l'ADN. El tractament T1 va resultar amb els millors valors de motilitat seguit del T2, i la capacitat fertilitzant d'aquests dos tractaments va ser similar al control, però el tractament T2 va mostrar menys mal a l'ADN. Mitjançant el PCA es va demostrar que T1 tenia una millor relació positiva amb la fertilitat i la motilitat total i progressiva. Finalment, avaluem les estructures de les subpoblacions espermàtiques a cadascun dels tractaments utilitzats. Mitjançant anàlisi multivariada en dues etapes, va ser possible determinar tres subpoblacions espermàtiques en el semen crioconservat de l'espècie, SP1 (ràpid-lineal), SP2 (ràpid-no lineal) i SP3 (lent-lineal). T1 va presentar el percentatge més gran de SP1, i va ser confirmat per l'efectivitat en la protecció de les cèl·lules d'aquest tractament en el procés de criopreservació de l'espècie. A la segona fase que es va dur a terme a la UPV, l'objectiu general va ser determinar l'efecte de la temperatura i el pH de l'aigua de mar sobre la motilitat dels espermatozoides a l'Anguila europea. Es va determinar que el pH baix de l'aigua de mar (6.5-7.4) va disminuir la motilitat dels espermatozoides d'anguila en comparació del control (pH= 8.2). Quan estudiem l'efecte combinat del pH del plasma seminal artificial i el pH d'ASW (7.8 i 8.2), no trobem diferències estadístiques en la motilitat i la cinètica dels espermatozoides en relació amb el pH del plasma seminal artificial, però sí el pH de l'aigua de mar. Es van trobar valors més alts de motilitat total (MOT), FA(ràpids) i ME (metges) amb un pH de 8.2 que amb un pH de 7.8. En contrast, la temperatura de l'aigua de mar no va afectar els paràmetres de motilitat dels espermatozous o la longevitat dels espermatozous en el context del canvi climàtic. / [EN] The selection of high-quality gametes is an essential requirement to take into account in assisted reproduction programs. The development of biotechnological tools such as cryopreservation of gametes plays an important role in aquaculture production and in the formation of germplasm banks, which will later contribute to the genetic improvement of fish populations, mainly those in danger and that could be more affected by future climate changes. In the first phase of this thesis carried out at Unesp, we worked with a neotropical species of high economic importance for the South American region. The second phase carried out at the UPV worked with the European Eel (Anguilla anguilla), a species classified on the (IUCN) Red List as a "critically endangered" species. In the first phase, we sought to characterize the biochemical composition of the plasma and the seminal characteristics of the species to evaluate the possible relationships between these parameters. The seminal plasma was mainly composed of sodium ions (Na+) and within the organic components, total proteins and glucose stood out. Through principal component analysis (PCA) it was observed that motility had a strong positive correlation with motility time, sperm concentration and total proteins. These analyzes served as the basis for the creation of a diluent solution later used in the cryoprotective substance. Then the influence of seminal plasma as a constituent of the cryoprotectant solution in the cryopreservation of P. reticulatum semen was determined. Three treatments were used: 5% glucose + 10% methanol (T1), 30% natural seminal plasma (T2) and 30% artificial seminal plasma were added to this cryoprotectant based on the results of the determined biochemical components of the plasma. for the species in the previous experiment (T3). Parameters of sperm motility, fertilizing capacity of cryopreserved semen, as well as DNA fragmentation were evaluated. Treatment T1 resulted with the best motility values followed by T2, and the fertilizing capacity of these two treatments was similar to the control, however, treatment T2 showed less DNA damage. Using PCA, it was shown that T1 had a better positive relationship with fertility and total and progressive motility. Finally, we evaluated the structures of the sperm subpopulations in each of the treatments used. Through two-stage multivariate analysis, it was possible to determine three sperm subpopulations in the cryopreserved semen of the species, SP1 (fast-linear), SP2 (fast-nonlinear) and SP3 (slow-linear). T1 presented the highest percentage of SP1, being confirmed by the effectiveness in protecting the cells of this treatment in the cryopreservation process of the species. In the second phase that is being carried out at the UPV, the general objective was to determine the effect of temperature and pH of seawater on sperm motility in the European Eel. It was determined that the low pH of seawater (6.5-7.4) decreased the motility of eel sperm compared to the control (pH= 8.2). When we studied the combined effect of the pH of the artificial seminal plasma and the pH of ASW (7.8 and 8.2), we did not find statistical differences in the motility and kinetics of the sperm in relation to the pH of the artificial seminal plasma, but we did find the pH of the water of sea Higher values of total motility (MOT), FA (fast) and ME (medium) were found at a pH of 8.2 than at a pH of 7.8. In contrast, seawater temperature did not affect sperm motility parameters or sperm longevity in the context of climate change. / I also thank the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES/PROEX) (N° 88887.302629/2018-00), National Council for Scientific, Technological Development CNPq (N° 200452/2022-3) and the Brazilian fostering agencies Foundation for Research Support of the State of Sao Paulo FAPESP (N° 2020/15020-0), for its financial support in Brazil. In Spain, the ThinkInAzul programme, supported by the Spanish Ministry of Science and Innovation (MCIN) with funding from the European Union NextGenerationEU (PRTR-C17.I1) and the Generalitat Valenciana (THINKINAZUL/2021/012) to SEASPERM, which has made it possible the preparation of this work. To the AUIP (Ibero-American Postgraduate University Association) for the Academic Mobility scholarship between Institutions Associated with the AUIP 2022 / Padilla Sánchez, M. (2023). Sperm Quality and Cryopreservation in Teleost: Effect of Seminal Plasma Component and Climate Change [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201549