En estos últimos años, muchos nuevos materiales han sido involucrados en los campos de las nanotecnologías, y especialmente en nanomedicina. Las nanoparticulas formadas por proteínas son un ejemplo de bio-material que está atrayendo cada vez más la atención debido a sus características tanto biológicas como estructurales, como por ekjemplo su baja toxicidad, baja inmunogenicidad y su biodegradabilidad. Además, a través de la ingeniería genética, estas proteínas se pueden diseñar para que formen multímeros estructuras con la capacidad de auto-ensamblarse en una estructura similar a las capsides virales. Estas propiedades permiten el utilizo de estas nanoparticulas proteicas en el diseño de vectores para la entrega de fármacos o genes terapéuticos, el diseño de vacunas y kits de diagnósticos. La entrega de moléculas terapéuticas supones la superación de barreras tanto extracelulares como intracelulares. Gracias a la exposición de ligandos en la superficie externa y a su tamaño reducido, las nanopartículas pueden superar estas barreras como, por ejemplo, la Barrera Hematoencefalica (BBB). En este contexto, hemos desarrollado unas nanopartículas proteicas auto-ensamblables con especificidad para los receptores LDLR, con el propósito de utilizarlas como vehículos para el tratamiento de enfermedades en el Sistema Nervioso Central (SNC). Cuatro diferentes ligandos específicos para los LDLR se fusionaron a la proteína GFP -His; entre ellos, solamente el ligando ApoB fue capaz de promover la formación de nanopartículas proteicas por interacciones intermoleculares entre el mismo ApoB, la cola de histidinas y los monómeros vecinos. Estas nanoparticula han demostrado una buena internalización en líneas celulares LRDR+, en experimentos in vitro. Sin embargo, cuando se probó en un modelo in vivo, solamente dos proteínas ligandos que no forman nano-particulas se han detectado en puntos de tiempo post-administración cortos. Esto indicaría que la formación de nano-estructuras no favorece la acumulación en el SNC. Paralelamente, se estudiaron nano-partículas proteicas dirigidas hacia el receptor CXCR4, un receptor de superficie celular expuesto en la superficie celular de las células metástaticas de cáncer colorrectal. En este estudio la proteína T22-IRFP-HIS fue elegida para sustituir a la ApoB-GFP-HIS y también se observó la formación de nanoparticulas autoensamblables que además poseen una alta internalización en las células CXCR4+. Esto indica que la proteína andamio no afecta a la formación de nanopartículas, ni afecta a la especificidad del ligando de direccionamiento. La fuerza que guía a la formación de nanopartículas se basa principalmente en las interacciones electrostáticas entre monómeros de proteínas. Además este fenómeno puede ser interrumpido y revertido por la presencia de alta concentración de sal. De hecho, cuando las nanoparticulas de T22-IRFP-HIS se dializan a un tampón con alta concentración de sal, las estructuras se desensamblan en monómeros y además reducen su eficiencia de penetrabilidad celular. Esto demostraría que el tamaño y tal vez la multivalencia de la nanopartículas proteicas frente a la monovalencia de los monómeros es un factor clave para el reconocimiento celular especifico y la internalización de las proteínas. / With the development of nanotechnology and nanomedicine, more and more materials have been involved in these fields, protein based nanoparticles have become another biomaterial that is developing fast and attracts growing attention. They are non-toxic, low-antigenic, biodegradable, metabolizable, and with genetic engineering, it is easy to modify their structure, surface charge, to allow heterologous ligand display, to improve stability and more importantly, proteins can be designed to form multimeric structures with the ability to self-assemble in a similar way as viral capsid proteins do. These properties enable protein particles to be widely used in targeting and delivery of therapeutic drugs, vaccine designing, diagnosis, and gene therapy.Nanoparticle-mediated targeting delivery is also widely used when overcoming barriers in human body, especially in the BBB. Nanoparticles could help drugs to cross the BBB because they have suitable size and could exhibit targeting ligands on the surface. These ligands could interact with receptors at the BBB and then transport nanoparticles across BBB by receptor mediated transcytosis. Based on that, the first part of this context is aim to construct self-assembled protein nanoparticles targeting on LDLR (which is a high affinity binding site in brain capillaries), with the purpose of using nanostructured materials as vehicles for the systemic treatment of CNS diseases. Four different LDLR specific ligands were fused to GFP protein and His tag; among those, only ApoB ligand, was able to promote the formation of protein nanoparticles by intermolecular interactions involving the ApoB ligand and the His tag of a neighboring monomer. This ApoB empowered protein nanoparticle showed higher internalization ability on LDLR+ cells, and higher permeability in BBB in vitro model. However, when tested those proteins displaying LDLR ligands in an in vivo model, two proteins which were not able to form nanoparticle accumulated in at short post-administration time points, indicating that the nanoparticulate form is not favoring the accumulation apart from preventing the transient accumulation. This work brings up new concepts of BBB crossing properties by using functional protein nanoparticles. The second part of this context is aimed to produce size-controllable protein nanoparticles towards CXCR4 receptor (CXCR4, a cell surface receptor marker associated with metastasis-forming colorectal cancer cells and other human pathologies) expressing cells. In this part, a new scaffold protein iRFP was chosen to replace GFP, we determined that it could also self-assemble into nanoparticles, showing high penetration into CXCR4+ cells. This indicates that the o scaffold protein has neither affect on the formation of nanoparticles, nor on the ligand targeting ability. The force which drives nanoparticle formation mainly is based on electrostatic interactions between protein monomers, and this can be interrupted by the presence of high salt concentration. Moreover, when this T22 empowered nanoparticle is transferred to a high salt concentration buffer, protein naaparticles disassemble into monomers reducing its cell penetrability efficiency, proving again that size and perhaps the multivalency of the protein nanoparticle versus the monovalency of protein monomers is a key factor in receptor mediated cell targeting and penetration.

Proteins that bind to DNA or RNA are both known to influence alternative splicing. However, there has not been so far a systematic experimental exploration of the relationship between these factors in their effect on splicing. In this thesis, we make use of the large amounts of publicly available high throughput sequencing data that now make it possible to explore this question on a genome-wide scale. We made exhaustive use of a method known as profiling to address this question. As most profiling methods in common use are merely qualitative, the first task of the thesis was to generate a quantitative profiling method and bioinformatics tool, ProfileSeq, which we validated by reproducing previous results from the literature. ProfileSeq and other methods were combined to mine for relationships between DNA and RNA binding factors with potential relevance to splicing. We found significant associations between the transcription factor CTCF and the RNA binding protein LIN28A, and similarly between SPI1 and RNA-binding proteins that bind to AC-rich motifs, such as hnRNPL. These represent putative relationships relevant to splicing, as these results were reached by more than one independent method with independent datasets. We also show evidence that CTCF acts as a barrier between regions of H3K4me3 marking inside genes. A number of other results of potential interest to both the bioinformatics and molecular biology communities are also described / Las proteínas que se unen al DNA o al RNA pueden influir el splicing alternativo. Sin embargo, no ha habido aún una exploración sistemática de la relación entre estos dos tipos de factores en su acción sobre el splicing. En esta tesis hacemos uso de datos públicos de secuenciación de alto rendimiento para explorar esta cuestión a escala de todo el genoma. Hemos hecho un uso sistemático de la construcción de perfiles de información genómica para abordar esta cuestión. Debido a que los métodos i comúnmente utilizados para construir perfiles hace sólo comparaciones cualitativas, la primera tarea de esta tesis consistió en desarrollar un método para cuantificar perfiles e implementarlo en una herramienta bioinformática, ProfileSeq, la cual hemos validado mediante la reproducción de resultados previamente descritos en la literatura. Posteriormente, ProfileSeq se usó con datos de actividad de unión al DNA o al RNA de distintas proteínas para estudiar la relevancia en el splicing. Se encontraron varias asociaciones significativas. Entre ellas, la del factor de transcripción CTCF y la proteína de unión a RNA LIN28A. De manera similar, se encontró una relación entre SPI1 y proteínas de unión a RNA que se unen a motivos ricos en AC, como hnRNPL. Estos resultados representan relaciones putativas relevantes para el splicing, ya que se alcanzaron por más de un método diferente y usando datos independientes, También mostramos evidencia de que CTCF actúa como una barrera entre las regiones intragénicas de marcaje diferencial con H3K4me3. También se describen otros resultados de interés potencial tanto para la bioinformática como para la biología molecular.

Rheumatoid Arthritis (RA) is one of the most prevalent autoimmune diseases in the world and is characterized by the chronic in ammation of the synovial joints. The origin of the disease is unknown but it is actually accepted that it is caused by the complex interaction of a genetic susceptibility background and environmental factors. To date, the characterization of the genetic architecture of RA is far from complete. In the present work we will use the power of two distinct genomic approaches to identify new candidate genes for the susceptibility to RA. In the rst genomic approach, we have used gene expression microarrays to characterize the in vitro transcriptional response of the synovial broblast (SF) to the stimulation with RA synovial uid. Using a reverse engineering approach, we have inferred the main transcriptional regulatory network that governs the response to this complex proin ammatory stimulus. We have then studied the genes in this regulatory network as risk factors for RA susceptibility using a casecontrol approach. We have analyzed the association of each gene with disease independently, but we have also analyzed the presence of higher order interactions associated with disease risk (i.e. epistasis) using the Multifactor Dimensionality Reduction method. In the second genomic approach, we have used whole genome genotyping microarrays targeting more than 300,000 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) markers to perform a Genome-wide Association Study (GWAS) in RA. In order to increase the statistical power of our study we have implemented a liability-based design. We have subsequently validated those loci showing highest evidence of association using an independent replication cohort. Also, in order to integrate our ndings with the evidence of previous GWAS in RA, we have determined those genomic loci showing increased clustering of signals between studies. Finally, we have performed an exhaustive genome-wide analysis of the two-way epistatic interactions associated with RA applying parallel computation. Using the SF in vitro stimulation model we have identi ed n = 157 genes signi cantly associated with the response to RA proin ammatory stimulus. Within this set of di erentially expressed genes there are genes that have been clearly associated to RA pathophisiology but also new genes not previously linked to this disease. From the di erential expression data we have been able to identify a 13 gene Nuclear Factor kappa-Beta (NF-kB) transcriptional regulatory network, as the key transcriptional regulatory force in this RA SF model. Whilst several of the genes in the network showed nominal association to disease, we have identi ed a signi cant epistatic interaction between interleukin 6 (IL6 ) and interleukin 4 induced 1 (IL4I1 ) genes. In the GWAS approach we have identi ed several candidate genes for RA, advanced RA and chronic arthritis risk. Using an independent replication dataset we have found an intronic SNP in Kruppel-Like Factor 12 (KLF12) gene as the most strongly associated SNP with RA. The meta-analysis with previous GWAS results has also identi- ed several genomic regions -including KLF12 locus- that are likely to harbour new risk variants for RA. In the genome-wide epistasis analysis we have found a number of SNP pairs associated with RA with a signi cance close to the conservative multiple test correction threshold. Also, we have found that two-way interactions including the HLA region, the strongest main e ect in RA, are ranked secondarily to many other potentially interacting loci, thus suggesting a minor role for this locus in the epistatic susceptibility to disease. The two alternative genomic approaches we present in this work have identi ed a group of new loci which are likely to be associated with the risk to RA. This group of candidate loci should be now validated in independent populations to con rm their implication in RA susceptibility.

El objetivo principal de este trabajo es mostrar como se puede explicar la evolución cultural en un marco darwinista naturalisticamente aceptable. Para hacer esto, he considerado en primer lugar las principales teorías que se proponen el mismo objetivo: la sociobiología y la memética. En relación a la primera, he mantenido la idea de que los fenómenos culturales dependen a largo plazo de un condicionamiento biológico. En relación a la segunda, he aceptado que existe un sentido en el que la adaptación no es simple incremento de fitness. Mi segundo objetivo es explicar por qué ciertos fenómenos culturales, las maladaptaciones, no son adaptativas como "incremento de fitness", y presentar y aplicar un esquema explicativo que justifique los fenómenos culturales en un nuevo sentido adaptativo. Para articular estas tesis, he utilizado los trabajos de Boyd y Richerson y he introducido la distinción propia entre adaptaciones de primer y de segundo orden. / The main objective of this work is to show how can we explain culture within a general Darwinian, naturalistically acceptable framework. To do so, I first reconsider the two main theories that have been proposed with a similar goal: sociobiology and memetics. Concerning the first one, I preserve the idea that every cultural event depends in the long run on a pure biological conditioning. Regarding the latter, I accept that there is a sense of adaptation different from simple development of fitness. My second task is to explain why certain cultural phenomena, maladaptations, are not adaptive in the "increase of fitness" sense, and present and apply an explanatory scheme that accounts for cultural phenomena in a new adaptative manner. In order to articulate these theses in a new proposal, I make use of some work by Boyd and Richerson and introduce the main distinction between first and second order adaptations.

L'agricultura i la industrialització han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presència de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqüència, la nitrificació s'ha convertit en un procés global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) són els responsables de l'oxidació de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen.Els primers oxidadors d'amoni foren aïllats a finals del segle XIX, però la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assolís un coneixement complert d'aquest grup bacterià. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb seqüències corresponents a AOB.L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines útils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals.En aquest treball primer descrivim la utilització de la hibridació in situ amb fluorescència (FISH), mitjançant l'aplicació de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacterià; no obstant, aquest mètode no permetia la detecció de noves seqüències, pel que es necessitava una nova eina.Amb aquesta intenció vam aplicar la seqüència de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar específicament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presència i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqüències pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren també obtingudes amb aquesta tècnica. Així mateix, un dels inconvenients de l'ús del 16SrDNA com a marcador és la impossibilitat de detectar simultàniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris.El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores àmpliament utilitzat com a marcador per a la detecció dels AOB. En aquest treball també descrivim la utilització d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqüències de AOB en la mostra, però la necessitat de detectar amoA mitjançant clonatge fa que l'ús d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilització com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtenció de seqüències de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE.Amb la finalitat d'obtenir una eina ràpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucleòtids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenètiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat.En aquest treball també presentem una anàlisi de RT-PCR basada en la detecció del gen amoB per a la quantificació del gènere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucleòtids dissenyat permet una enumeració altament específica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts.Finalment, vam realitzar un estudi poligènic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vàrem construir un arbre filogenètic combinat.Com a resultat concloem que amoB és un marcador adequat per a la detecció i identificació dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferències filogenètiques. Per altra banda, la seqüència sencera del gen 16S rDNA és indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonòmiques i filogenètiques en treballar amb cultius purs de AOB. / Human activities such as farming and industrialization have produced a significant increase in the number of ammonium-rich environments. The presence of nitrogenated compounds reduces water quality causing toxicity problems, deteriorating the environment and even affecting human health. Consequently, nitrification has recently become a widespread process involving the cycling of nitrogen in the biosphere, which is mainly due to microbial activities. Ammonia oxidizing bacteria (AOB) are an essential component of the global cycling of nitrogen, being responsible for the aerobic oxidation of ammonium to nitrite.Although the first ammonia oxidizers were isolated by the end of the XIX century, the slowness of their growth and the difficulties in culturing hindered achieving a full knowledge of this bacterial group until the 80s, when the first studies based on the gene 16S rDNA where performed. Nowadays, the databases contain huge numbers of entries of 16SrDNA sequences belonging to AOB.The aim of this work was to find, develop, and evaluate useful and reliable tools for the study of ammonia oxidizers in environmental samples.In this work we describe the use of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), based on the use of DNA probes specifically targeting the ammonia-oxidizers 16SrRNA molecule. AOB were detected and enumerated by using this technique. However, unknown sequences are hardly detectable by using this method, and therefore, new tools were needed.For this purpose we tried applying the sequence of the probe Nso1225 in a PCR reaction. The possibility of specifically amplifying a 16S rDNA gene fragment resulted in a new fingerprinting tool to assess the presence and diversity of ammonia-oxidizers in natural environments. Even so, some β-Proteobacterial non-AOB sequences were also retrieved by using this technique. Moreover, one of the main disadvantages of using 16S rDNA as a molecular marker is the impossibility of simultaneously detecting both the β and the γ-Proteobacterial ammonia oxidizers.The gene amoA, which encodes for the subunit A of the enzyme ammonia monooxygenase, was then being extensively used as a marker for the detection of AOB in environmental samples. We describe the use of this marker for the identification of several ammonia oxidizing sequences in sludge samples from a sequencing batch reactor (SBR). Although useful, the use of amoA as a marker requires cloning, which is a tedious and time-consuming technique when dealing with large number of samples in microbial ecology studies. Besides, detection of non-AOB sequences has been reported by other authors when using amoA in a PCR-DGGE approach.Aiming at obtaining a fast and rigorous analytical tool allowing AOB detection and identification, we developed a new set of primers targeting the gene amoB, which encodes for the transmembrane domain of the enzyme ammonia monooxygenase. This gene has been shown to be a good molecular marker for AOB, since it can be used for easy detection and identification of ammonia oxidizers, providing high specificity, sensitivity and reliability regardless of phylogenetic affiliations.A real-time PCR assay for the detection and quantification of the γ-proteobacterial genus Nitrosococcus based on the amoB gene sequence is also presented. This newly designed primer set allows a highly sensitive and specific enumeration of all known Nitrosococci.We finally performed a comparison and evaluation of the markers amoA, amoB and 16S rDNA, and built a polygenic based tree.As a result we conclude that amoB is a suitable molecular tool for detecting and identifying AOB in environmental samples, yielding consistent grouping when performing phylogenetic inferences. In turn, the whole sequence of the gene 16S rDNA is indicated for taxonomical and phylogenetic purposes when working with ammonia oxidizing isolates.

La presente tesis se ha centrado en la evaluación a través de diferentes aproximaciones de la implicación del gen FOXP2, gen sometido a selección positiva en el linaje humano y relacionado directamente con una alteración de uno de los rasgos más característicos de la especie humana, el lenguaje, en la vulnerabilidad a la esquizofrenia. El estudio de asociación caso-control no ha permitido establecer una implicación consistente entre las variantes estructurales analizadas (SNPs y posibles expansiones de trinucleótidos) con las alucinaciones auditivas como fenotipo alternativo a la esquizofrenia. No obstante, la participación del gen FOXP2 en la vulnerabilidad a las alucinaciones auditivas, como componente referido al lenguaje no puede descartarse por completo, ya que el SNP rs2396753 mostró una tendencia hacia la significación y el SNP rs2253478 mostró diferencias significativas para el ítem de Pobreza del Lenguaje de la Escala Manchester.El análisis de la región promotora nos ha permitido valorar que la regulación de la expresión del gen debe ser más compleja de lo que inicialmente se esperaba. El análisis evolutivo muestra que diferentes tramos de la región promotora analizada han evolucionado diferencialmente, encontrándose una región altamente conservada, que curiosamente no parece contener una elevada concentración de sitios de unión a factores de transcripción, como sería lo esperado dada su posible importancia funcional. Esta secuencia se localiza inmediatamente aguas arriba del potencial promotor extraído de las bases de datos mediante herramientas bioinformáticas. Bajo la hipótesis de su pertenencia al núcleo central del promotor, la evaluación funcional de esta región conservada indica que posiblemente contenga elementos represores de la transcripción, al menos en el tipo celular testado, esto es, células procedentes del pulmón, ya que se obtienen mayores niveles de expresión en su ausencia.Dentro de la hipótesis epigenética de la esquizofrenia se llevó a cabo un análisis de los patrones de metilación en dos fragmentos incluidos en una isla CG adyacente al primer exón, no traducido, del gen en tejidos postmorten de pacientes esquizofrénicos y controles. En primer lugar se obtuvo una clara diferencia en el grado de metilación entre el fragmento analizado localizado aguas arriba del primer exón, con ausencia de metilación respecto al localizado aguas abajo, para el que se obtuvieron patrones específicos de metilación. Comparando el grado de metilación en diferentes áreas cerebrales en pacientes con esquizofrenia y controles, se observó que en la circunvolución del parahipocampo el grado de metilación es mayor que en las otras áreas analizadas y además hay indicios de diferencias entre ambos grupos analizados en ambos hemisferios. Los análisis de expresión encaminados a determinar si el grado de de metilación estaba correlacionado con los niveles de expresión no permitieron llegar a resultados concluyentes al respecto.Otro gen de gran interés en la evolución de la especie humana es el gen HAR1A el cual se caracteriza por incluir una región con evolución acelerada en el linaje humano. Se consideró que un gen de las características del gen HAR1A podría constituir también un buen gen candidato para la esquizofrenia, por lo que se llevó un estudio caso control de las mismas características que el realizado con el gen FOXP2. El hecho de no encontrar diferencias significativas en las frecuencias genotípicas, alélicas o haplotípicas en el estudio de asociación caso-control llevado a cabo con el gen HAR1A indica que no parece estar relacionado con la vulnerabilidad a la esquizofrenia, aunque podría estar relacionado con la susceptibilidad a padecer alucinaciones auditivas dentro del contexto psicótico, al obtenerse diferencias globales en la comparación de haplotipos entre pacientes alucinadores y pacientes sin alucinaciones. / This thesis has focused in the study of FOXP2 gene, which is the first gene related to a language disorder and which has been subject to positive selection in human lineage, as candidate gene for schizophrenia through different approaches Case-control study didn't allow establishing a consistent relationship between the analyzed structural variants (SNPs and trinucleotide repetitions) and auditory hallucination as alternative phenotype for schizophrenia. Nevertheless, a role of FOXP2 in vulnerability to schizophrenia through its relationship with language cannot be ruled out since SNP rs2396753 showed a trend to significance and SNP rs2253478 showed significative differences for Poverty of Speech. Analysis of promoter region suggests regulation of the expression of the gene is more complex than it was initially expected.Evolutionary analysis of a 6Kb fragment surrounding first exon of the gene revealed different evolutionary rates in different fragments as well as some potential promoter regions. A highly conserved region was detected upstream of the annotated promoter. In order to determine if this highly conserved region should be included in the promoter core functional analyses were performed. These experiments indicated that this region probably contains repressor elements. Under the epigenetic hypothesis of the origin of schizophrenia an analysis of the methylation patterns of a CpG island adjacent to first untranslated was performed. Differences between upstream and downstream region were detected as well as differences for methylation of parahippocampal gyrus in patients and controls and between hemispheres. Quantification of mRNA levels was conducted in order to correlate methylation and expression levels of the gene, with inconclusive results.As a summary, with our results we cannot rule out a role of FOXP2 in the susceptibility to schizophrenia, although no direct evidence has been obtained.

Los linfomas cutáneos primarios de células T (LCPCT) son un grupo heterogéneo de linfomas no-Hodgkin que se caracterizan por la presencia de linfocitos atípicos en la piel. En el presente trabajo se ha analizado el perfil genético de la micosis fungoide tumoral (MFt) para conocer las alteraciones más frecuentes y su posible función como marcadores pronósticos. Por otra parte, se ha realizado un estudio paralelo para conocer el estatus de los genes del receptor de células T (TCR). Se estudiaron un total de 41 MFt, 13 síndromes de Sézarys (SS) y 6 linfomas cutáneos anaplásicos de célula grande CD30+ (LCACG-CD30+). Se aplicaron las técnicas de microarrays de hibridación genómica comparada (oligoarrayCGH) e hibridación in situ fluorescente (FISH) para los genes del TCR. El análisis de oligoarrayCGH reveló que un 78% presentaron alteraciones genéticas. Las alteraciones más frecuentes fueron las ganancias de 7q33.3q35, 17q21.1, 8q24.21, 9q34, 10p14 y 1q31.2q32.2, y las pérdidas de 9p21.3, 9q31.2, 17p13.1, 13q14.11, 6q21.3, 10p11.22, 16q23.2 y 16q24.3. El análisis de la inestabilidad genética permitió segregar a las MFt en dos grupos, uno genéticamente estable (0-5 alteraciones) y otro genéticamente inestable (>5 alteraciones). Además, se ha observado que el grupo genéticamente inestable se asociaba a la ganancia del cromosoma 7q. Finalmente, se ha observado que pertenecer al grupo genéticamente inestable así como presentar deleciones de 9p21.3, 10q26qter y ganancia en 8q24.21 se asociaba a una peor supervivencia. El análisis de los genes del TCR ha mostrado que las translocaciones de TCRAD, TCRB y TCRG no es un evento genético frecuente en los LCPCT. Sin embargo, se han observado ganancias en el número de copias de las sondas TCRB (7q34) y TCRG (7p14) en 3/6 MFt y 3/13 SS, lo que confirma los resultados previamente observados mediante las técnicas de oligoarrayCGH y citogenética convencional. De este estudio se concluye: 1. Nuestros datos confirman que la MFt presenta un perfil genético caracterizado por las ganancias de 7q, 17q, 8q, 9q, 10p y 1q, y las pérdidas de 9p, 9q, 17p, 13q, 6q, 10p y 16q. 2. Las alteraciones estructurales de los loci del TCR no son una característica genética de los LCPCT. Sin embargo, no se excluye su papel patogénico en los LCPCT. 3. Se ha definido el perfil de inestabilidad genético de la MFt y se ha observado la presencia de dos grupos, un grupo estable y otro inestable. Además, se ha observado una asociación significativa de la ganancia del cromosoma 7q con el perfil genéticamente inestable, lo que sugiere un importante papel patogénico de esta región en este subgrupo de MFt. 4. Respecto a los marcadores pronóstico, las pérdidas de 9p21.3 y 10q26qter, y la ganancia de 8q24.21, así como pertenecer al grupo genéticamente inestable se han asociado a un pronóstico desfavorable. Por otra parte, la edad superior a los 60 años en el momento del diagnóstico y el hecho de presentar lesiones cutáneas en más de dos localizaciones también se han asociado a una peor supervivencia. 5. Se ha observado que las MFt que presentaban infiltración en sangre periférica, presentaban alteraciones similares a las halladas en el SS en estudios previos lo que sugiere la existencia de una firma genética común para los SS de novo y los SS con una MF previa. Con respecto a los LCACG-CD30+, se confirma que ambas entidades son diferentes, no sólo en sus características clínicas sino también en sus perfiles genéticos. / Primary cutaneous T cells lymphomas (CTCL) are a heterogeneous group of non-Hodgkin lymphomas characterized by the presence of atypical lymphocytes in the skin. This work analyzed exhaustively the genomic profile of the tumoral stage mycosis fungoides (MFt) to find the most frequent alterations and their possible role as prognostic markers, as well as, to compare MFt genetic profile with other CTCL (specifically, Sézary syndrome [SS] and cutaneous anaplastic large cell lymphoma-CD30+ [cALCL-CD30+]). Moreover, there has been a parallel study to know the status of the genes of T cell receptor (TCR). We studied a total of 41 MFt, 13 SS and 6 cALCL-CD30+ using oligonucleotide array comparative genomic hybridization (oligoarrayCGH) and fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques. Among the 41 MFt, 78% had genetic alterations. The most frequent alterations were gains of 7q33.3q35, 17q21.1, 8q24.21, 9q34, 10p14 and 1q31.2q32.2, and losses of 9p21.3, 9q31.2, 17p13.1, 13q14.11, 6q21.3, 10p11.22, 16q23.2 and 16q24.3. We also performed a genetic instability analysis and it has been observed that MFt segregate into two groups, a genetically stable (0-5 changes) and a genetically unstable (> 5 changes). It has also been observed that genetically unstable group was related to the presence of the gain of 7q. Regarding prognostic markers, deletion of 9p21.3, 10q26qter and 8q24.21 gain and to belong to the genetically unstable group was associated with a poor overall survival. On the other hand, TCR genes analyses showed that TCRAD, TCRB and TCRG translocations are not a frequent event in CTCL. However, we have observed extra signal FISH copies of TCRB (7q34) and TCRG (7p14) probes in 3/6 MFt and 3/13 SS, confirming our results previously observed by conventional cytogenetics and oligoarrayCGH techniques. This study concludes: 1. Our results confirm a MFt genomic profile characterized by gains of 7q, 17q, 8q, 9q, 10p y 1q, and losses of 9p, 9q, 17p, 13q, 6q, 10p y 16q regions. 2. TCR loci structural alterations are not a genetic characteristic of CTCLs. 3. We have defined the genomic instability of MFT and we observed the presence of two distinct groups: one called genetically stable and a second group called genetically unstable, characterized by the presence of numerous genetic changes. It has also observed a significant association of chromosome 7q gain with the genetically unstable group, suggesting an important pathogenic role of this region in this subset of MFT. 4. We have observed that losses of 9p21.3 and 10q26qter regions and the gain of the 8q24.21 region as well as belonging to the genetically unstable group have been associated with a poor prognosis. With regard to clinical characteristics, age over 60 years at diagnosis and presenting skin lesions in more than two locations have also been associated with poorer survival. 5. The comparison between MFt and SS genomic profiles has shown that MFt patients with peripheral blood involvement showed similar changes to those found in the SS in previous studies. These findings suggest the existence of a common genetic signature for de novo SS and SS with a previous MF. Regarding cALCL-CD30+, we confirmed that both entities are different not only in its clinical features but also on their genetic profiles.

Se ha propuesto que el cromosoma X tiene una tasa de fijación de reordenaciones cromosómicas subdominantes superior a la de los autosomas y algunos datos empíricos parecen concordar con esta predicción. Para contrastar esta hipótesis en el género Drosophila se han construido mapas físicos de los cromosomas X, 3 y 4 de las especies D. repleta y D. buzzatti (homólogos a los cromosomas X, 2L y 3L de D. melanogaster). La técnica utilizada para la obtención de estos mapas ha sido la hibridación in situ de un total de 218 marcadores (clones génicos, cósmidos y fagos P1) procedentes de la especie D. melanogaster. Las especies D. repleta y D. buzzatii pertenecen al grupo repleta del subgénero Drosophila y divergieron de D. melanogaster (subgénero Sophophora) hace 40-62 millones de años. En el caso del cromosoma 3 se analizó la organización molecular de la región de 1,944 Mb que rodea al locus Adh en la especie D. melanogaster. Para los cromosomas X y 4 se obtuvieron mapas físicos de todo el cromosoma con una densidad promedio de marcadores de uno cada 333 kb y uno cada 342 kb respectivamente. La comparación de los mapas físicos de las especies D. melanogaster y D. repleta nos permite estimar el número de inversiones fijadas durante la divergencia de estas dos especies. Los resultados también han sido comparados con los obtenidos previamente para el cromosoma 2 en estas mismas especies. Esta comparación muestra que hay diferencias de hasta cuatro veces en la tasa evolutiva entre cromosomas siendo el cromosoma X el que tiene una tasa más elevada. En conjunto se estima que el numero de inversiones paracéntricas fijadas entre estas dos especies es de 393 y la tasa promedio de disrupciones por Mb y por millón de años es de 0,053. Este resultado corrobora la elevada tasa de reordenaciones observada en el género Drosophila.La comparación de los mapas físicos obtenidos para las especies D. repleta y D. buzzatii indica que los puntos de rotura de las inversiones Xb y Xc fijadas entre estas dos especies han sido mal asignados. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo estas dos inversiones no estarían dispuestas en tándem sino que serían inversiones solapantes. / It has been proposed that the fixation rate of underdominant chromosomal rearrangements should be higher for the X chromosome than for autosomes and some empirical data agree with this prediction. To check this hypothesis in the Drosophila genus physical maps of the D. repleta and D. buzzatii X, 3 and 4 chromosomes (homologous to chromosomes X, 2L and 3L of D. melanogaster) have been constructed. In situ hybridization of 218 markers from D. melanogaster (gene clones, cosmids and P1s) was used to construct the maps. D. repleta and D. buzzatii belong to the repleta group of the Drosophila subgenus and diverged from D. melanogaster (Sophophora subgenus) 40-62 million years ago. The molecular organization of a 1,944 region of Drosophila melanogaster around the Adh locus was analyzed, whereas for chromosomes X and 4 physical maps of the whole chromosomes were obtained. The markers density in these two chromosomes is one marker per 333 kb for chromosome X and one marker per 342 kb in chromosome 4.The comparison of the physical maps of D. melanogaster and D. repleta allowed us to estimate the number of inversions fixed during the divergence of these two species. The results have also been compared to those previously obtained for chromosome 2. Four-fold differences in the number of inversions between chromosomes were found with chromosome X exhibiting the highest rate of rearrangement. Combining all results, we estimated that 393 paracentric inversions have been fixed in the whole genome since the divergence between D. repleta and D. melanogaster. This amounts to an average rate of 0.053 disruptions per Mb per million year, corroborating the high rate of rearrangement in the genus Drosophila. The chromosomal maps of D. repleta and D. buzzatii have also been compared showing that the breakpoints of inversions Xb and Xc have not been correctly assigned. According to our data these two inversions previously considered as in tandem, are overlapping inversions.

Una simple mutació en el gen K-Ras comporta transformació cel·lular. Les cèl·lules tenen pocs punts de transició que puguin determinar d'aquesta manera tan important el comportament cel·lular. Fins al punt que hi ha diferències entre diferents mutacions puntuals del mateix gen. Així va quedar demostrat que el creixement dels tumors subcutanis de NIH3T3 amb mutació en el codó 13 ( G:T - A:T/ Gly-Asp ASP13) tenen un període de latència més llarg però creixen més ràpid que els tumors NIH3T3 amb K-Ras mutat en el codó 12 (G:T - A:T/ Gly-Cys CYS12). En front a aquests resultats postulem que les mateixes mutacions puntuals en el gen K-Ras que determinen diferents fenotips de cèl·lules tumorals poden determinar diferències angiogèniques en els tumors que desenvolupen. Els marcatges específics amb anticossos de PECAM, desmina, α-Actina de la musculatura llisa i macròfags assenyalen que els tumors amb CYS12 tenen major densitat de vasos sanguinis però hem trobat diàmetres més grossos i més cèl·lules desmina positives al voltant dels vasos sanguinis dels tumors ASP13. La proliferació endotelial no ens aporta diferències entre els diferents tipus de tumors en un moment de creixement tumoral ja consolidat. Han estat analitzats els nivells de VEGF i els tumors amb mutació ASP13 expressen més aquest factor de creixement endotelial que no els tumors amb mutació CYS12. El fet de que in vitro també es denotin aquestes diferències ens remarca que la diferència mutacional en Ras és determinant. La presència d'altres cèl·lules de suport que hem descrit en els tumors ASP13 podria remarcar aquesta diferència però no de manera exclusiva. El VEGF que estan produint aquestes cèl·lules actua sobre les cèl·lules endotelials. Podem descartar l'efecte autocrí ja que no hem observat expressió ni estimulació del VEGFR2 in vitro. L'angiogènesi depent de la balança entre els factors pro i anti angiogènics. TSP-1, Ang 4 (precursor) i Ang-1 han estat analitzats en aquest sistema per Western Blot. L'expressió de TSP-1 en el sistema in vivo ha estat indetectable. En el cas de les angiopoietines observem una tendència dels tumors CYS12 acumular-ne més que els ASP13, però els resultats del Western Blot han estat molt heterogenis. L'absència de TSP-1 dóna força a les accions del VEGF en els tumors ASP13. Sembla que les angiopoietines podrien tenir un paper en el sitema angiogènic dels tumors CYS12. L'expressió de les MMPs ha estat analitzada per zimografia i Western Blot. In vitro no s'ha detectat expressió de MMP9 ni MMP7, d'aquesta manera queda palès que l'expressió d'aquestes metaloproteïnases la realitzen majoritàriament les cèl·lules acompanyants al tumor. Ja està descrit que els macròfags són grans productors de MMP9 i MMP7 i també que la seva expressió pot estar estimulada per citoquines, factors de creixement com el VEGF i molt induïda per l'hipòxia dels macròfags. Es relaciona aquestes dues MMPs amb proliferació i invasió cel·lular, promoció de l'apoptosi i alliberació de factors angiogènics entre altres possibles accions. Per tan afecten el fenotip vascular que hem descrit en els tumors ASP13. Els tumors amb mutació CYS12 incrementen la MMP2 activa respecte dels tumors ASP13 mentre que aquests segons tenen major expressió de TIMP-2 i MMP14 que els primers. La funció de promoure la migració endotelial que se li atribueix a la MMP2 podria explicar-nos la dispersió de les cèl·lules endotelials i el major número de vasos que observem en els tumors CYS12. TIMP-2 i MMP14 amb la capacitat de moderar la proliferació endotelial i d'estimular la tumoral respectivament poden contribuir a definir el fenotip angiogènic i tumoral dels tumors ASP13. Hem començat a traslladar aquests resultats en una sèrie de tumors colorectals humans on coneixem les mutacions en el gen K-Ras i disposem d'un seguiment clínic de més de 4 anys. No hem trobat diferències en la densitat vascular però si una tendència a expressar VEGFR2 en els tumors amb mutació en el gen K-Ras que comporta menys supervivència global. Aquests resultats confirmen que hi ha diferències angiogèniques entre diferents mutacions del gen K-Ras. Sembla que el VEGF, les metaloproteïnases i les cèl·lules de suport tumorals convergeixen a promoure aquestes diferències. En els tumors humans caldrà tenir més paràmetres per determinar si existeixen diferències.

Plant growth and productivity are compromised by environmental stresses such as pathogens, extreme temperatures, drought and high salinity. Being sessile organisms, plants had to develop different physiologic and biochemical strategies to cope with these potential harmful situations. Drought in particular is one of the major environmental stresses that plants are forced to endure during their life cycle. The adaptation to water deficit is controlled by a cascade of molecular networks that start with the perception of water shortage which leads to increases in the ABA levels. Even though the ABA signalling model is well described for Arabidopsis, little is known for other plant species. With this thesis we proposed to increase the knowledge of maize response to drought, focusing on a maize kinase of the SnRK2 family ‐ ZmSnRK2.8/ZmOST1 ‐ which is highly homologous to the Arabidopsis OST1. We divided our work on three chapters, namely the biochemical characterization of ZmOST1, the functional characterization of ZmOST1 and the study of ZmOST1 regulation. 1) ZmOST1 biochemical characterization With Chapter 1 we characterized ZmOST1 at the biochemical level, making parallels with the Arabidopsis system whenever pertinent. We found a very close biochemical relationship between the maize and Arabidopsis kinases that suggests a conserved mechanism of plant responses to ABA and drought stress and point to the potential use of this kinase in improvement programs of drought tolerance in crops. 2) ZmOST1 functional characterization With Chapter 2 we described ZmOST1 as a functional kinase that is activated by different osmotic stresses and that is able to complement the Arabidopsis ost1‐2 mutant with effects on stomata closure. We also present a transcription factor of the NAC superfamily (ZmSNAC1) as a novel cognate substrate of ZmOST1. Under abiotic stresses ZmOST1 is capable of phosphorylating this transcription factor with further implications on stomata regulation. 3) ZmOST1 regulation With the results presented in Chapter 3 a larger picture of ABA signalling appears that implicates new partners on ZmOST1 regulation, specifically the CK2 kinase and the proteasome degradation. Ample evidence is shown suggesting CK2 phosphorylation is implicated in ABA signalling by affecting ZmOST1 localization, protein levels, protein degradation and interaction with PP2C phosphatases. At the plant level, overexpressing ZmOST1 mutagenized on the CK2 loci of phosphorylation grants several potential beneficial traits that could prove important for crop biotechnology, such as higher protein levels, better protein stability, enhanced phosphorylation activity and better stomata regulation. Working model: Taken the results presented in this thesis together, we propose a change in the current ABA signalling model. First we believe that there is an important role for CK2 in ABA sensing and SnRK2 activation that could affect the binding of the kinase to the PP2C phosphatises and regulate SnRK2 through degradation. Second, we propose that, apart from the always off and transiently fast on/off modes of SnRK2 activity, there is a third always on mechanism in which the kinase is fully detached from the phosphatase. / La sequía es actualmente el factor abiótico más limitante para el crecimiento de las plantas y se está agravando con los actuales cambios climáticos, aumento de población y reducción de las reservas de agua. Se estima que en el 2050 el 50% de las tierras cultivadas tengan problemas de salinidad o sequía. Por ello, la intensificación de la agricultura y el desarrollo de la mejora biotecnológica de adaptación al estrés son áreas que tienen que reforzarse. En esta tesis se pretende ampliar los conocimientos sobre la respuesta del maíz a la sequía haciendo un estudio profundizado de una quinasa de tipo SnRK2, designada ZmOST1 que está implicada en la respuesta de las plantas al déficit hídrico. - Capítulo 1: Caracterización bioquímica de la quinasa de maíz ZmOST1 en que se establece que ZmOST1 se localiza en el núcleo y citoplasma, se activa por ABA, es capaz de autofosforilar su centro activo y directamente interacciona con una fosfatasa ZmPP2C a través de su dominio regulador. - Capítulo 2: Caracterización fisiológica de ZmOST1. Se determinan los niveles de expresión y de actividad de la quinasa en diferentes tratamientos y estadios de desarrollo; se establece que ZmOST1 es capaz de recuperar el fenotipo de cierre estomático en mutantes OST1 de Arabidopsis; y se identifica un factor de transcripción que se caracteriza como un nuevo substrato de esta quinasa. - Capítulo 3: Se describe una nueva ruta de regulación de ZmOST1 en que esta quinasa es fosforilada por la CK2 (casein kinase 2) en el dominio regulador. Mutagenizando los residuos diana de la CK2 en la ZmOST1 lleva a una mayor acumulación, una menor degradación por el proteasoma y una hipersensibilidad a ABA.