Abstract Trojan is a novel leukocyte-specific protein cloned from chicken (Gallus gallus) embryonic thymocytes. The molecule is a type I transmembrane protein with an extracellular CCP domain followed by two FN3 domains. Its cytoplasmic tail is predicted to possess a MAPK docking and a PKA phosphorylation site. Trojan displays differential expression on developing thymocyte subpopulations. It is high on CD4 and CD8 double negative, and CD4 or CD8 single positive cells, but diminishes from the surface of selection-undergoing CD4 and CD8 double positive cells. This expression pattern is similar to that of anti-apoptotic molecules such as IL-7Rα and BCL-2. We hypothesised an involvement of Trojan in the regulation of apoptosis, possibly as an anti-apoptotic receptor. Our in vitro studies with a T cell line showed that upon apoptosis induction, Trojan expression rises dramatically on the surface of surviving cells and gradually decreases towards its normal levels as cells recover. When sorted based on their Trojan levels, cells with high expression appear less susceptible to apoptotic induction than those bearing no Trojan on their surface. Cells that overexpress Trojan from a cDNA plasmid show elevated steady state intracellular calcium, suggesting the molecule is able to transmit cytoplasmic signals. In addition, computational analyses pointed towards an involvement of MAPK and a possible regulatory mechanism by PKA. Trojan belongs to a novel gene family that includes two other members in the chicken. One is a receptor-type tyrosine phosphatase named Mystran, and the other – a transmembrane protein with an ITAM, named Thracian. We discovered the family in other avian species and found related genes in reptiles and coalecanth fish. We observed dynamic adaptation of their extracellular regions possibly in concert with ligand-binding, association with other surface molecules or as a response to pathogen challenges. This was coupled to largely unchanged cytoplasmic tails, suggesting a conserved signalling mechanism. The presented study shows that a novel avian leukocyte protein called Trojan possibly has an anti-apoptotic role. It belongs to a gene family that was subjected to evolutionary selection, likely linked to the molecular function of the proteins. / Tiivistelmä Trojan on uusi kanan (Gallus gallus) alkioiden kateenkorvan kypsyvistä T soluista tunnistettu molekyyli. Se on tyypin I solukalvoproteiini, jolla on solun ulkopuolinen CCP-domeeni ja kaksi FN3-domeenia. Trojanin solun sisäisessä osassa on rakenteen perusteella MAPK:n sitoutumisalue sekä PKA-fosforylaatiopaikka. Trojania ilmennetään T-solujen kehityksen aikana runsaasti CD4 ja CD8 kaksoisnegatiivisissa ja CD4 tai CD8 yksöispositiivisissa soluissa, mutta ilmentyminen on vähäinen valintaa läpikäyvissä CD4 ja CD8 kaksoispositiivisissa soluissa. Tunnetut apoptoosia eli ohjelmoitua solukuolemaa estävät molekyylit, kuten IL-7Rα ja BCL-2, noudattavat samankaltaista ilmentymistä kypsyvien T solujen pinnalla. Hypoteesimme on, että Trojanilla on rooli apoptoosin säätelyssä, mahdollisesti solukuolemaa estävänä reseptorina. In vitro apoptoosikokeet osoittivat, että aluksi Trojanin ilmentyminen lisääntyy huomattavasti soluissa, jotka välttävät apoptoottisen kuoleman, ja normalisoituu sitten muutaman solujakautumisen jälkeen. Trojania vähän ilmentävät solut ovat alttiimpia ohjelmoidulle solukuolemalle, kuin sitä paljon ilmentävät solut. Solujen sisäinen kalsiumtaso on kohonnut soluilla, jotka yliekspressoivat Trojania cDNA plasmidista. Tämä viittaa siihen, että Trojan voi toimia sytoplasman signaalinvälityksessä. Lisäksi tietokoneperusteiset ennusteet viittaavat siihen, että MAPK ja PKA voivat liittyä Trojan-signalointiin. Tutkimuksessa tunnistettiin Trojan-geeniperhe. Perheeseen kuuluu Trojanin lisäksi kaksi muuta geeniä: reseptorityyppinen tyrosiinifosfataasi Mystran ja ITAM-domeenin sisältävä solukalvon proteiini Trachian. Geeniperhe löydettiin muistakin lintulajeista, sekä niitä läheisesti muistuttavat geenit matelijoilta ja varsieväkalalta. Havaitsimme Trojan-perheen proteiineissa dynaamista sopeutumista, joka voi olla seurausta ligandien sitoutumisesta, vuorovaikutuksesta muiden pintaproteiinien kanssa tai vasteesta patogeenihaasteeseen. Proteiinien solunsisäiset alueet olivat sen sijaan suurilta osin muuttumattomia, joten ne voivat toimia solusignaloinnissa. Väitöstutkimuksessa kuvataan uusi valkosolujen proteiini Trojan, joka toiminnallisesti saattaa estää ohjelmoitua solukuolemaa. Trojan kuuluu geeniperheeseen, johon on kohdistunut sen toimintaan liittyvää valintaa.

Abstract There are more small-bodied species of birds than those having large bodies. Generally, and relative to occurrance in any one place, small-bodied species also contain more individuals than large-bodied species. The same patterns have been documented for several groups of higher organisms for example, snakes, flowering plants and mammals, which suggests that there exists a general reason "why", which applies to other groups of species as well as to birds. This thesis attempts to identify this reason. In the first place, it is possible that most species happened to become small-bodied by chance. Simulations of neutral body-size evolution indicate however that the observed bias towards small size is stronger than that accounted for by neutral evolution. Then, the most plausible explanation for why most species are small is that small-bodied species speciate faster. However, statistical analyses accounting for historical relatedness of present-day species indicate no relation between body size and the rate of speciation. Finally, instead of little by little, the dominance of small species may have arisen suddenly, when approximately 65 million years ago (presumably) a large meteorite hit the earth, causing mass extinctions. However, analysis of body sizes and genetic differences of extant species reveals that while avian species numbers were approximately halved, the catastrophe affected small and large species equally. Thus, the reason why most species are small does not seem to be due to differential rates of speciation or extinction. Instead, the cause appears to be in the tempo and mode of evolution. It was found by analysis of extant species' body size that probably most differences in body size between species arise at the moment of speciation. Differences between small-bodied species are smaller than between large-bodied species and probably this difference also has its origin at the moment of speciation. Consequently, groups of small species stay small whereas groups of large species are more variable in body size, so that in the end most species are small. / Tiivistelmä Maailman noin 10 000 lintulajin joukossa pienikokoisia lajeja on enemmän kuin suurikokoisia. Yleensä pienkokoiset lajit ovat myös yksilömääriltään suurempia kuin samalla paikalla esiintyvät suurikokoiset lajit. Koska sama ilmiö on havaittu monissa muissa suurissa eliöryhmissä (esim. nisäkkäät, käärmeet ja kukkakasvit), on ilmeistä, että on olemassa yhteinen syy, joka pätee niin linnuissa kuin muissakin eliöryhmissä. Tämän väitöskirjan tavoite on selvittää, mikä tämä yhteinen syy voisi olla. Ensinnäkin on mahdollista, että suurin osa lajeista on kehittynyt pienikokoisiksi aivan sattumalta. Ruumiin koon evoluution simulaatiot kuitenkin osoittavat, että on hyvin epätodennäköistä, että neutraali evoluutio olisi johtanut pienikokoisten lajien suuriin määrään havaitussa määrin. Toinen mahdollinen selitys ilmiölle on, että pienikokoiset lajit lajiutuvat nopeammin. Tilastolliset analyysit, jotka ottavat huomioon nykyisin elävien lajien sukulaisuussuhteet, osoittavat ettei ruumin koon ja lajiutumisen vauhdin välillä ole yhteyttä. Kolmas mahdollinen selitys pienikokoisten lajien suurelle määrällä on historiallinen. On mahdollista, että pienikokoisten lajien suhteellisen suuri määrä syntyi nopeasti noin 65 miljoonaa vuotta sitten tapahtuneen massasukupuuton seurauksena, joka fossiiliaineiston perusteella kohdistui erityisesti suurikokoisiin maaeläimiin (esimerkiksi dinosauruksiin). Vertaileva analyysi nykyään elävien lintulajien ruumiin koosta ja geneettisistä eroista osoittaa, että vaikka suuri osa lintulajeista hävisi massasukupuutossa, tämä katastrofi karsi lajeja riippumatta niiden ruumiin koosta. Näyttää siis siltä, etteivät erot lajiutumisen tai sukupuuttojen esiintymisessä selitä sitä, että suurin osa lajeista on pienikokoisia. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella syy näyttäisi sen sijaan olevan ruumiin koon kehityksen vauhdissa ja siinä tavassa, jolla kehitys yleensä etenee. Analyysi nykyisten lajien ruumiin koosta paljasti, että suurin osa eroista lajien välillä syntyy (evolutiiviessa aikataulussa) suhteellisen nopeasti lajiutumistapahtuman yhteydessä (punktualismi) eikä vähitellen pitkien aikojen kuluessa (gradualismi), kuten yleensä oletetaan. Kehityslinjojen sisällä pienikokoisten lajien väliset erot ruumiin koossa olivat pienempiä kuin isokokoisten lajien väliset erot - ja todennäköisesti myöskin tämä ero syntyy lajiutumisen yhteydessä. Tämä johtaa evoluution kuluessa tilanteeseen, että alunperin pienikokoisista lajeista kehittyneet lajit ovat myös pienikokoisia, kun taas isokokoisten lajien kehityslinjoissa on nähtävissä huomattavasti paljon enemmän vaihtelua ruumiin koossa. Näiden seurauksena eliöstöissä suurin osa lajeista lopulta on pienikokoisia.

Abstract Species of Lactobacillus (L.) are important starter and probiotic lactic acid bacteria used in the dairy industry. Industrial fermentation processes are prone to phage infections, which can cause severe economic losses. The main objective of this thesis was to examine in more depth the genetic variation and evolution of L. delbrueckii and L. rhamnosus phages. Aspects of interactions and co-evolution of a phage and its host have also been included in this study. In this study, the complete genomic DNA sequences of four Lactobacillus phages were determined and analyzed in detail. Specific phage genes and genetic elements were identified and studied in more depth. The L. delbrueckii phage JCL1032 was found to be a temperate phage which is able to integrate into two distinct genes of L. delbrueckii, but with exceptionally low frequency. The isolated JCL1032-lysogenic bacteria expressed a complex phage resistance against several L. delbrueckii phages. The rarely reported coexistence of phage adsorption resistance and immunity could not be explained by lysogenic conversion. Instead, the spontaneously induced JCL1032 may have provided a selective advantage to adsorption resistant lysogens. The biological activity of two group I introns residing within the terminase large subunit and tape measure genes of the JCL1032 genome (49,433 bp) was demonstrated. The diversification of L. delbrueckii phages is mainly due to insertions, deletions and recombination, as was demonstrated by comparative analyses of the LL-Ku and c5 genomes of 31,080 bp and 31,841 bp, respectively. Interestingly, both phages have possible autonomous transcription units of genes within their genomes. It seemed that evolution of the 36,366-bp genome of the L. casei phage Lc-Nu has been fuelled by deletions as well. The lytic phage Lc-Nu has an imperfect lysogeny module and the phage is genetically closely related to L. casei prophages. This clearly demonstrated that Lc-Nu has a recent temperate origin. This study provides genetic tools, genes, and regulatory elements for biotechnological applications and for developing starter strains with enhanced phage resistance properties. / Tiivistelmä Hapatteina ja probiootteina käytetyt Lactobacillus-maitohappobakteerit (L. ) ovat merkittävässä asemassa meijeriteollisuudessa. Teolliset käymisprosessit ovat alttiita faagi-infektioille, jotka voivat aiheuttaa tuotantolaitoksille huomattavia taloudellisia tappioita. Tämän tutkimuksen päätavoitteena oli syventää tietoa L. delbrueckii ja L. rhamnosus -bakteereita infektoivien faagien geneettisestä muuntelusta ja evoluutiosta. Tutkimuksessa käsitellään myös faagin ja isäntäbakteerin välistä vuorovaikutusta sekä yhteisevoluutiota. Tutkimuksessa määritettiin neljän Lactobacillus-faagin genominen DNA-sekvenssi, identifioitiin faagigeenejä ja muita geneettisiä elementtejä sekä tutkittiin niiden toimintaa. L. delbrueckiin JCL1032-faagi osoittautui tutkimuksessa temperaatiksi. JCL1032-genomi voi integroitua kahteen eri geeniin isäntäbakteerin kromosomissa, joskin lysogeniafrekvenssi on hyvin alhainen. Tutkimuksessa eristetyt JCL1032-lysogeeniset bakteerikannat olivat resistenttejä useille Lactobacillus-faageille. Osassa lysogeenisia bakteereita resistenssi ilmeni jo faagin adsorptiovaiheessa. Vastaavanlainen ilmiö on kuvattu vain harvoin aiemmin. Havaittua kompleksista resistenssiä ei voitu selittää lysogeenisella konversiolla. Sen sijaan ilmiön taustalla voi olla JCL1032-profaagien spontaani indusoituminen bakteerin kromosomista, mikä voi antaa valintaetua adsorptioresistenteille lysogeenisille bakteereille. JCL1032-genomissa (49 433 emäsparia) osoitettiin olevan kaksi biologisesti aktiivista intronia terminaasin suurta alayksikköa ja hännän mittaproteiinia koodaavissa geeneissä. LL Ku- ja c5-faagien genomien (31 080 ja 31 841 emäsparia) vertailu osoitti L. delbrueckii -faagien evoluution olevan pääasiassa seurausta insertioista, deleetioista ja rekombinaatiosta. Kummassakin genomissa oli mahdollisesti päällekkäisiä ja itsenäisesti transkriptoituvia geenialueita. Deleetiot ovat muokanneet myös L. casein lyyttisen Lc- Nu-faagin genomia (36 466 emäsparia). Faagin lysogeniamoduuli sisälsi vain osan lysogeeniseen elinkiertoon tarvittavista geeneistä. Lc-Nu on geneettisesti läheistä sukua L. casei -profaageille, mikä myös viittaa siihen, että Lc-Nu on kehittynyt temperaatista faagista. Tutkimustuloksia faagien geeneistä ja säätelyelementeistä voidaan hyödyntää hapatebakteerien faagiresistenssiominaisuuksien kehittämisessä sekä erilaisissa bioteknologisissa sovelluksissa.

Abstract The study gathered information about polyamine metabolism throughout the Scots pine (Pinus sylvestris L.) zygotic embryogenesis and about physiological events occurring simultaneously in the megagametophyte tissue. Additionally, novel sequence data of the Scots pine polyamine genes were used for studying the evolution of polyamine genes in plants. Phylogenetic analyses revealed that the eukaryotic ornithine decarboxylase (ODC) might have evolved from a multifunctional bacterial progenitor. In conifers, the alternative arginine decarboxylase (ADC) pathway is preferred in putrescine biosynthesis, which may have caused the relaxed purifying selection in the ODC genes. The phylogenetic analysis of spermidine synthase (SPDS), spermine synthase (SPMS) and thermospermine synthase (ACL5) sequences supported the view that eukaryotic SPDS genes are derived from a common ancestor, whereas SPMS genes have evolved several times from SPDS genes. The identified Scots pine sequence was defined as a putative thermospermine synthase (TSPMS) encoding gene and named PsACL5. The phylogenetic analysis of polyamine oxidase (PAO) sequences supported the view that plants possess several different PAOs, which may have different catalytic properties. The consistency of the polyamine concentration profiles during Scots pine zygotic embryogenesis suggested that polyamines have an important role in the embryo development and that individual polyamines may have different roles at different developmental stages. Generally, the polyamine concentrations increased at the early stages but decreased at the late stages of embryo development. Only the free putrescine fraction remained stable throughout the embryo development. Putrescine was almost solely produced via the ADC pathway and the ADC enzyme was at least partially transcriptionally regulated. Both ADC mRNA transcripts and ADC protein localized in dividing cells of embryos, which implicated the essential role of ADC in the mitosis of plant cells. The megagametophyte was viable from the early phases of embryo development until the early germination of mature seeds. However, the megagametophyte cells in the narrow embryo surrounding region (ESR) died via morphologically necrotic cell death. In the dying cells, extensive nucleic acid fragmentation caused the unspecific hybridization of probes in an in situ mRNA hybridization assay. The occurrence of necrotic cell death in Scots pine embryogenesis indicated that developmentally and physiologically regulated necrotic cell death is evolutionarily conserved and exists also in plants. / Tiivistelmä Työssä tutkittiin polyamiiniaineenvaihduntaa ja megagametofyyttisolukossa tapahtuvia fysiologisia muutoksia metsämännyn (Pinus sylvestris L.) alkionkehityksen aikana. Polyamiineja (putreskiini, spermidiini ja spermiini) syntetisoivia ja hajottavia entsyymejä koodaavien geenien emäsjärjestys selvitettiin metsämännystä. Sekvenssejä käytettiin kasvien polyamiinigeenien evoluution tutkimiseen. Tutkimuksessa todettiin, että eukaryooteissa putreskiinin biosynteesistä vastaava entsyymi, ornitiinidekarboksylaasi (ODC), on voinut kehittyä bakteerien lysiinikarboksylaasista (LDC), joka dekarboksyloi sekä ornitiinia että lysiiniä. Kasveissa putreskiinia voidaan tuottaa myös arginiinidekarboksylaasin (ADC) kautta, mikä on johtanut ODC-geeneihin kohdistuvan puhdistavan valinnan heikentymiseen. Aminopropyyli-ryhmiä liittävien entsyymien osalta tutkimus tukee käsitystä, jonka mukaan eukaryoottiset spermidiinisyntaasit (SPDS) ovat kehittyneet yhteisestä kantamuodosta, kun taas spermiinisyntaasi (SPMS) on syntynyt useita kertoja SPDS-geenin kahdentumisen kautta. Metsämännystä tunnistettiin termospermiinisyntaasia (TSPMS) koodaava geeni, jolle annettiin nimeksi PsACL5. Fylogeneettisen analyysin perusteella kasveissa on useita erilaisia polyamiinien hajotuksesta vastaavia polyamiinioksidaaseja (PAO), joiden katalyyttiset ominaisuudet voivat poiketa toisistaan. Metsämännyllä polyamiinipitoisuudet vaihtelivat alkionkehitysvaiheen mukaan yhdenmukaisesti eri vuosina, mikä viittaa polyamiinien tärkeään rooliin alkionkehityksessä. Polyamiinipitoisuudet kasvoivat varhaisen ja pienenivät myöhäisen alkionkehityksen aikana lukuun ottamatta vapaan putreskiinin pitoisuutta, joka pysyi samana koko alkionkehityksen ajan. Putreskiinia tuotettiin alkioissa lähes pelkästään ADC-reitin kautta, ja ADC-entsyymin säätelyn todettiin tapahtuvan ainakin osittain transkription tasolla. Koska sekä ADC-geenin lähetti-RNA että ADC-entsyymi löytyivät alkion jakautuvista soluista, on ilmeistä, että ADC-entsyymillä on tärkeä tehtävä kasvisolujen mitoosissa. Megagametofyytti säilyi elossa koko alkionkehityksen ajan lukuun ottamatta alkio-onteloa reunustavia soluja, jotka olivat morfologialtaan nekroottisia. Nukleiinihappojen voimakas pilkkoutuminen aiheutti soluissa koettimien epäspesifisen sitoutumisen, kun geenien ilmenemistä paikannettiin lähetti-RNA:han in situ hybridisaatio-menetelmällä. Tutkimuksessa löydetty männyn alkiokehitykseen liittyvä nekroottinen solukuolema osoitti ensimmäistä kertaa, että fysiologista ja kehityksellistä nekroottista solukuolemaa esiintyy myös kasveissa.