Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: O presente estudo teve como objetivo isolar, cultivar e caracterizar as células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) bovino, obtenção de vesículas extracelulares e meio condicionado do cultivo celular (MC) e avaliação do seu potencial imunomodulador em cultivo de explantes endometriais bovinos. Para isso, as CTM-TA foram coletadas (n=3) de tecido adiposo e sofreram isolamento, processamento e cultivo. As amostras foram submetidas à análise citogenética, imunofenotípica (CD44, CD29, vimentina, CD34 e MHCII), de viabilidade e de diferenciação (adipogênica, osteogênica e condrogênica), e então criopreservadas. Após descongelamento e expansão, o meio condicionado do cultivo celular foi submetido à ultracentrifugações para obtenção das vesículas extracelulares que foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e Western Blot (Alix e CD9). Explantes de endométrios bovinos (n=7) provenientes de abatedouro foram submetidos a cultivo e desafio com LPS (3μg/mL) por 48 horas. Os grupos experimentais foram CN (controle negativo, sem desafio com LPS), CP (controle positivo, apenas desafio com LPS), V (desafio com LPS e adição de vesículas extracelulares) e MC (desafio com LPS e adição de meio condicionado). Avaliou-se secreção de PGF2α e IL-1β por Elisa, morfologia do tecido através de histopatologia, expressão tecidual de Fas-L, TLR-4, PGDH e PGF2α-R por Imunoistoquímica. No cultivo celular das CTM-TA foi obtida uma população celular homogênea e fibroblastóide, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: Os exossomos constituem uma classe de pequenas vesículas extracelulares de aproximadamente 40-150 nm originadas pelo sistema endossomal. Essas vesículas são produzidas constitutivamente por praticamente todos os tipos celulares, e são responsáveis por transportar distintas classes de moléculas, em resposta a diferentes estímulos. O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que em condições tais como AIDS, septicemia, diabetes, insuficiência cardíaca, doença pulmonar obstrutiva crônica, diabetes e câncer, contribui para a atrofia de fibras musculares esqueléticas. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi caracterizar os RNAs transportados por exossomos de miotubos C2C12 com atrofia induzida por TNF-α e avaliar a ação desses exossomos no fenótipo de mioblastos e miotubos C2C12. Exossomos liberados no meio de cultura de miotubos C2C12 tratados com TNF-α, e de seus respectivos controles, foram isolados por ultracentrifugação e analisados quanto ao seu conteúdo de RNA por RT-qPCR (microRNAs) e sequenciamento de nova geração (RNA total). Além disso, mioblastos e miotubos C2C12 foram tratados com esses mesmos exossomos para analisar a expressão de genes envolvidos com ciclo celular e a capacidade de migração/proliferação (mioblastos), bem como na atrofia celular (miotubos). Nossos resultados demonstraram que exossomos provenientes de miotubos são capazes de alterar os níveis de transcritos de genes envolvidos na proliferação, motilidade e diferenciação de mioblastos em miotubos.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Exosomes constitute a class of small extracellular vesicles of approximately 40-150 nm originated by the endosomal system. These vesicles are constitutively produced by virtually all cell types and are responsible for carrying distinct classes of molecules in response to different stimuli. TNF-α is a proinflammatory cytokine that in conditions such as AIDS, septicemia, diabetes, heart failure, chronic obstructive pulmonary disease, diabetes and cancer, contributes to atrophy of skeletal muscle fibers. In this sense, the objective of the present study was to evaluate the expression and action of RNAs transported by exosomes from C2C12 myotubes with TNF-α-induced atrophy in the phenotype of myoblasts and myotubes. Exosomes released in the culture medium from TNF-α treated C2C12 myotubes and from their respective controls were isolated by ultracentrifugation and analyzed for their RNA content by RT-qPCR (microRNAs) and new generation sequencing (total RNA). In addition, myoblasts and C2C12 myotubes were treated with these same exosomes to analyze the expression of genes involved in cell cycle and migration / proliferation capacity (myoblasts), as well as cell atrophy (myotubes). Our results demonstrated that exosomes from myotubes alter the expression genes involved in the proliferation, motility and differentiation of myoblasts into myotubes. We also verified that exosomes from TNFα-treated myotubes decreased migration / proliferation capacity of myoblasts. In addition, we iden... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Anthony César de Souza Castilho / Resumo: A superestimulação ovariana é uma das biotecnologias utilizadas com objetivo de aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas com alto valor econômico através da obtenção de múltiplas ovulações e tem sido amplamente empregada na espécie bovina. O conhecimento da dinâmica folicular permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos hormonais capazes de regular o desenvolvimento folicular, o momento e o número de ovulações produzidas. As duas gonadotrofinas mais utilizadas para induzir o crescimento de múltiplos folículos durante esses protocolos são o hormônio folículo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica equina (eCG); e ambos têm se mostrado eficazes. Sabe-se que a utilização da superestimulação ovariana utilizando FSH provoca mudanças positivas nos complexos cumulus-oócito (CCOs) e que a utilização do eCG no final do tratamento superestimulatório aumenta a resposta ovulatória, a ocorrência de estro, as concentrações de progesterona e as taxas de prenhes em programas de inseminação artificial (IA). Deste modo, o uso desses protocolos parece alterar o microambiente folicular e consequentemente a competência dos CCOs que se desenvolvem nele. Dentre os vários fatores presentes nesse microambiente estão as vesículas extracelulares (VEs; incluindo os exossomos), que carregam diversas moléculas como mRNA e microRNAs (miRNAs). Diante disso, o presente estudo visou avaliar o efeito da superestimulação ovariana com FSH ou FSH combinado a eCG, sobre a expressão gênica de embriões ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ovarian superestimulation is a biotecnology used to increase the reproductive potential of females with high economic value by obtaining multiple ovulations and has been widely used in cattle. The follicular dynamics knowledge allows the development of numerous hormonal protocols able to regulate follicular development, the moment and the number of ovulations produced. Two most used gonadotrophins to induce the growth of multiple follicles during these protocols are follicle stimulating hormone (FSH) and chorionic gonadotropin equine (eCG) and both have proven effective. It is known that the ovarian superstimulation using FSH causes positives changes in cumulus-oocyte complexes (COCs) and the use of eCG at the end of superstimulatory treatment increases the ovulatory response, the oestrus occurrence, progesterone concentrations and pregnancy rates in artificial insemination (AI). Thus, these protocols seems to alter the follicular microenvironment and therefore the competence of COCs that development it. Among the several factors presents in this microenvironment are the extracellular vesicles (EVs; including the exosomes), that carry different molecules such mRNA and microRNA (miRNAs). Therefore, this study aimed to assess the effects of ovarian superstimulation with FSH or FSH combined with eCG on embryo gene expression produced from COCs recovered from superstimulated cows. Additionally, it was checked if the exosomes presents in follicular fluid from these cows, when adde... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dentre outros fatores, a fertilidade depende da qualidade espermática (QE; características morfofuncionais) e dos componentes espermáticos moleculares. Devido à QE nem sempre estar associada à fertilidade, o estudo dos componentes moleculares ganha cada vez mais destaque. Os microRNAs, reguladores pós-transcricionais, estão presentes nos espermatozoides e desempenham funções importantes na espermatogênese, na maturação espermática e no desenvolvimento embrionário. Entretanto, os mecanismos pelos quais estes regulam a fertilidade masculina são pouco conhecidos. Portanto, o objetivo dos estudos aqui presentes foi investigar o papel dos miRNAs na determinação e regulação da fertilidade. No primeiro estudo, partidas de sêmen criopreservado de touros Aberdeen Angus (Bos taurus) com alta (54,3±1,0%; AF; n=3) e baixa fertilidade (41,5±2,3%; BF; n=3) foram submetidas às avaliações da QE; à produção in vitro e coleta de embriões com uma célula, duas células e blastocistos; e à avaliação do perfil de 380 miRNAs. Os genes-alvo dos miRNAs diferentemente abundantes nos espermatozoides e nos embriões dos touros AF e BF foram investigados. O diâmetro, número de células e taxa de proliferação dos blastocistos também foram analisados. Ainda, neste estudo, foi validado um novo modelo para provar que o espermatozoide é capaz de entregar miRNAs ao embrião. Para a análise estatística, foram empregadas as análises de variância (ANOVA) e de Qui-Quadrado. Quando não mencionado, o nível de significância foi de 5%. Dentre os miRNAs avaliados, o miR-216b foi menos abundante nos espermatozoides (P=0,08) e zigotos (P<0,05) dos touros AF. O gene-alvo deste miRNA, KRAS, associado à proliferação celular, foi mais abundante (P<0,05) nos embriões de duas células dos touros AF assim como a taxa de primeira clivagem e o número de células dos blastocistos que foram maiores neste grupo. Ainda, provou-se que o miR-216b é entregue pelo espermatozoide ao embrião. No segundo estudo, seis touros da raça Nelore (Bos indicus) foram utilizados, sendo três submetidos ao estresse térmico testicular (heat stress; HS). O sêmen foi coletado sete dias antes e 21 dias após o estresse. A QE foi avaliada seguida pela análise do perfil de 380 miRNAs espermáticos e exossomais. Os dados foram analisados por ANOVA. O nível de significância foi de 5%. HS apresentou 21 miRNAs espermáticos diferentemente abundantes, mas não apresentou diferença no conteúdo de miRNAs exossomais. Os miR-126-5p e -146a apresentaram menor abundância nos espermatozoides HS assim como apresentaram menor abundância nos espermatozoides dos touros BF do primeiro estudo. Já o miR-216b não apresentou diferença neste segundo estudo. Assim, com base nos dois estudos, podemos concluir que 1) os miRNAs são importantes para a fertilidade; 2) existem miRNAs importantes para a fertilidade que são alterados por injúrias à espermatogênese; e 3) o miR-216b, entregue pelo espermatozoide ao embrião, é importante para o desenvolvimento embrionário inicial regulando de maneira diferente embriões de touros de AF e BF; provando que miRNAs espermáticos possuem papel na regulação e determinação da fertilidade. Estes estudos possuem grande importância na geração de conhecimentos sobre os miRNAs espermáticos e apresentam resultados pioneiros que confirmam que o espermatozoide bovino contribui com mais que o DNA ao desenvolvimento embrionário. / Bulls fertility relies of many factors. In concern to sperm cells, it depends of sperm quality (SQ; morphofunctional features) and sperm molecular components. Due to the fact thatsperm quality is not always related with fertility, the effect of many molecular factors on fertility has been intensively studied. miRNAs, which have post transcriptional action, are present on sperm cells and are important to spermatogenesis, sperm maturation and embryo development. However, the mechanisms by which they regulate male fertility are not completely understood. Thus, the objective of the present studies was to investigate the role of miRNAs on fertility regulation. On the first study, frozen-thawed semen batches of high (54.3±1.0%; HF; n=3) and low fertility (41.5±2.3%; LF; n=3) Aberdeen Angus (Bos taurus) bulls were analyzed in concern to SQ; were used in embryo in vitro production to produce and collect embryos of one cell, two cells and blastocysts; and were analyzed to the profile of 380 sperm miRNAs. The target genes of the miRNAs that presented different abundance levels on sperm cells and embryos of HF and LF bulls were investigated. Blastocysts diameter, cell number and proliferation index were also evaluated. Besides, in this study, we validated a new model to prove that some miRNAs are delivered by sperm cell to embryo. Data were analyzed by analyzes of variance (ANOVA) and Chi-Square. Signicante level was 5% unless otherwise stated. Among miRNAs evaluated, miR- 216b presented less abundance on HF sperm cells (P=0.08) and HF zygotes (P<0.05). miR- 216b target gene, KRAS, that is related with cell proliferation, presented high abundance (P<0.05) on HF two cells embryos such as the first clivage rate and the number of cells on blastocysts that were greater on this group. We also showed that miR-216b is delivered by sperm cells to embryos. On the second study, we used six Nelore (Bos indicus) bulls. Three bulls were submitted to testicular heat stress (HS group). Semen was collected three days before and 21 days after heat stress. Samples were analyzed in concern to SQ and to the profile of 380 miRNAs on sperm cells and on exossomes. Data were analyzed by ANOVA. Signicante level was 5%. HS presented 21 sperm miRNAs diferently abundant, but miRNAs from exossomes were not different between the HS and control groups. miR-126-5p and -146a presented less abundance on HS sperm cells and on BF bulls sperm cells of the first study. miR-216b was not different in the second study. Thus, we can conclude that 1) miRNAs are important to fertility; 2) there are miRNAs that are important to fertility and can be altered by spermatogenesis injuries; and 3) miR-216b is delivered by sperm cells to embryos and is important to initial embryo development regulating HF and LF embryos differently; showing that sperm miRNAs are important molecules for regulation and establishment of fertility. The studies here presented generate knowledge upon sperm miRNAs importance and present novel results that confirm that bull sperm cells contribute with more than DNA to embryo development.

O acidente vascular encefálico (AVE) é uma doença comum e de grande impacto para a saúde da população, uma vez que é considerado a principal causa de incapacidades neurológicas, principalmente motora e cognitiva. Considerando que os exossomos e o seu conteúdo podem ser marcadores prognóstico de demência em pacientes com Doença de Alzheimer, avaliamos o perfil exossomal circulante em pacientes pós AVE isquêmico com e sem comprometimento cognitivo. Ainda, é de conhecimento que os pacientes tratados com trombolíticos apresentam redução na dependência funcional a longo prazo, assim é de interesse avaliar os exossomos periféricos destes pacientes. Este trabalho visou investigar o perfil de exossomos circulantes em pacientes após diagnóstico de AVE isquêmico (AVEI) nas fases aguda e crônica. Foram determinados o conteúdo de proteína total e a atividade da acetilcolinesterase (AChE), marcadores de exossomos, além de correlacionar escores de comprometimento neurológico com os parâmetros bioquímicos. Ainda, considerando que o estresse oxidativo tem um papel central na fisiopatologia da isquemia cerebral, determinamos o conteúdo de espécies reativas e a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em exossomos circulantes. Os fatores comprometimento cognitivo e o uso do trombolítico na fase aguda da doença não mostraram ter influência sobre os parâmetros estudados. Os resultados sugerem que uma diminuição de exossomos circulantes, já que houve uma redução na quantificação de proteínas totais na fase crônica, pode sugerir um prejuízo no sistema de remoção de materiais tóxicos levando ao acúmulo de materiais indesejados disso, o estado oxidativo exossomal, representado pelos níveis de espécies reativas e a atividade da SOD, foi alterado na fase crônica quando comparado com a fase aguda. Estes resultados sugerem que há uma alteração do perfil dos exossomos ao longo do tempo nos pacientes com AVE isquêmico. Nossos dados indicam que os níveis de espécies reativas na fase aguda podem predizer alterações no perfil dos exossomos na fase crônica de pacientes com comprometimento cognitivo, especificamente nas atividades das enzimas SOD e AChE e na concentração de proteínas totais. Estas associações não foram observadas em pacientes sem comprometimento cognitivo. Correlacionamos os parâmetros bioquímicos com as escalas de déficit neurológico, os escores do Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) foram inversamente proporcionais aos níveis de AChE naqueles pacientes que não receberam o tratamento trombolítico na fase aguda. Assim, nossos dados demonstram que o prejuízo cognitivo (menores escores de MEEM) está associado a maiores níveis de atividade da AChE em exossomos circulantes. O papel dosexossomos na fisiopatologia da isquemia cerebral, assim como na predição de diagnóstico de comprometimento cognitivo precisa ser melhor investigado. / Stroke is a common disease and has a major impact on the public health, since it is considered the main cause of neurological disabilities, mainly motor and cognitive impairment. Considering that exosomes’ content may be prognostic markers of dementia in patients with Alzheimer's disease we evaluated the circulating exosomal profile in patients with ischemic stroke with and without cognitive impairment. Furthermore, it is known that thrombolytic therapy reduces long-term disability, so it is interesting to evaluate the peripheral exosomes of these patients. This work aimed to investigate the profile of circulating exosomes in patients after diagnosis of ischemic stroke in the acute and chronic phases. Total protein content and acetylcholinesterase activity (AChE), markers of exosomes were determined, also it was correlated the scores of cognitive function tests with biochemical parameters. Considering that oxidative stress plays a central role in the pathophysiology of cerebral ischemia, we determined the content of reactive species and the activity of the superoxide dismutase enzyme (SOD) in circulating exosomes. The factors cognitive impairment and the use of thrombolytic in the acute phase of the disease did not show influence on the studied parameters. The results suggest that a decrease in circulating exosomes, since there was a reduction in the quantification of total proteins in the chronic phase, may suggest a damage in the system of removal of toxic materials leading to the accumulation of unwanted materials. The exosomal oxidative state, represented by the reactive species levels and the SOD activity, was altered in the chronic phase when compared to the acute phase These results suggest that the profile of the exosomes is altered over time in patients with ischemic stroke. Our data indicate that reactive species levels in the acute phase may predict changes in the exosome profile in the chronic phase of patients with cognitive impairment, specifically in the activities of SOD and AChE enzymes and in the concentration of total proteins. These associations were not observed in patients without cognitive impairment. We correlated the biochemical parameters with the the scores of the assessment of cognitive function tests, the Mini-Mental State Examination (MMSE) scores were inversely proportional to the AChE levels in those patients who did not receive the thrombolytic treatment in the acute phase. Thus, our data demonstrate that cognitive impairment (lower MMSE scores) is associated with higher levels of AChE activity in circulating exosomes. The role of exosomes in the pathophysiology of cerebral ischemia, as well as in the prediction of diagnosis of cognitive impairment, needs to be better investigated.

Duas patologias principais estão associadas ao HTLV-1: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). O mecanismo pelo qual ocorre o desenvolvimento destas doenças em apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados é desconhecido. Sabe-se que diversos fatores estão associados ao desenvolvimento destas patologias, como carga proviral, características celulares, genéticas e imunológicas do hospedeiro. No entanto, tais mecanismos não foram totalmente elucidados e novas abordagens de estudos são necessárias para a compreensão da patogênese viral. Nesse sentido, vários estudos relatam o papel dos exossomos no desenvolvimento de infecções virais como HIV, EBV e HCV através do transporte de componentes incluindo proteínas, RNAm e miRNA. A possibilidade da transferência do conteúdo viral por essas vesículas para células não infectadas na ausência de vírus é um mecanismo intrigante. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo isolar os exossomos diretamente do soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar o conteúdo dessas vesículas quanto à expressão dos genes virais tax e HBZ entre os grupos assintomático e sintomático. Para tanto, os exossomos foram isolados por precipitação polimérica (Exoquick(TM)) e caracterizados por Western Blot (expressão dos marcadores CD9, CD81, Alix e citocromo c) e Análise de Rastreamento de Nanopartículas (tamanho e concentração). Além disso, o conteúdo dos exossomos foi analisado por PCR em tempo real para quantificação dos genes virais regulatórios tax e HBZ. Por fim, no intuito de estabelecer o papel dos exossomos como biomarcadores para o desenvolvimento da HAM/TSP, os níveis de expressão destes genes foram associados à carga proviral do HTLV-1. Os transcritos de RNAm de tax e HBZ foram detectados apenas em exossomos isolados do soro dos indivíduos sintomáticos, com ausência nos assintomáticos. Além disso, a expressão de tax e HBZ nos exossomos dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 foi correlacionada positivamente com a CPV. Dessa forma, os resultados sugerem que os exossomos podem desempenhar importante papel na patogênese da mielopatia, através do transporte de genes virais de uma célula infectada para não-infectada. No entanto, mais estudos que relacionam o papel dos exossomos na infecção pelo HTLV-1 são necessários. / Two major pathologies has been associated with HTLV-1 infection: adult T- cell leukemia/lymphoma (ATLL) and HTLV-1 associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis (HAM / TSP). The mechanism which is responsible for the appearance of these diseases in only 1 to 5% of the infected individuals is unknown. Is known that several factors has been related to the development of these diseases, such as proviral load and cellular, genetic and immunological characteristics of the host. However, these mechanisms have not been fully elucidated and new approaches are necessary to understand the viral pathogenesis. Thus, several studies have reported the involvement of exosomes in the development of the HIV, HCV, and EBV viral infections carrying components including proteins, mRNA and miRNA. The possibility of transfer of viral content via these vesicles to uninfected cells in the absence of virus is an intriguing mechanism. Therefore, this proposal aimed to isolate exosomes from serum of HTLV-1 infected patients and compare the content of these vesicles regarding viral gene expression of tax and HBZ between asymptomatic and symptomatic group. For this, the exosomes were isolated by polymeric precipitation (Exoquick(TM)) and characterized by Western Blot (expression of markers CD9, CD81, and Alix) and Nanoparticle tracking Analysis (size and concentration). Furthermore, the exosomes content were analyzed by real-time PCR for the quantification of tax and HBZ regulatory viral genes. Finally, to establish the role of exosomes like biomarkers to HAM/TSP development, levels of these genes were associated with proviral load of HTLV-1. Viral mRNA transcripts including tax and HBZ were found only in exosomes isolated from serum of symptomatic individuals and absence in assymptomatic. Furthermore, tax and HBZ expression in exosomes from HTLV-1 infected individuals were positive correlated with proviral load. Thus, the results suggests that exosomes can able to develop important role in myelopathy pathogenesis carrying viral genes of infected cell to uninfected cell. However, more studies that relate the role of exosomes in HTLV-1 are needed

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Dentre as c?lulas capazes de secretar exossomos est?o as c?lulas tumorais e as c?lulas imunes. Sabe-se que a presen?a das c?lulas imunes ? importante para erradicar os tumores. No entanto, achados recentes demonstram que a inflama??o pode promover o crescimento tumoral. Os macr?fagos associados a tumores (TAMs) s?o conhecidos por apresentarem diferentes subtipos, M1 e M2, capazes de secretarem exossomos. O presente estudo se prop?s a observar o comportamento dos exossomos derivados dos TAMs, dos subtipos 1 e 2, frente a cultura de c?lulas humanas SCC-25, HSC-3 e SAS derivadas de CE de l?ngua, por meio da an?lise da capacidade de invas?o, prolifera??o e viabilidade das c?lulas tumorais na presen?a dos exossomos. Observou-se que as microves?culas derivadas dos TAMs apresentam positividade para CD63, caracterizando-as como exossomos. Os exossomos dos TAMs do subtipo M2 foram os ?nicos a apresentarem marca??o para TGF-?, quando em compara??o com os exossomos M1, THP1 e das linhagens celulares de CE, sugerindo que os exossomos M2 podem ser respons?veis pela express?o de TGF-? nas c?lulas tumorais, uma vez que s?o internalizados. Nos ensaios de migra??o, observou-se que as c?lulas SCC-25 em presen?a de meio de cultura DMEM F/12, apresentaram maior capacidade de invas?o frente aos exossomos M2 (p?0,001), para concentra??o de 0,1 ?g/ml. Para as c?lulas HSC-3 e SAS, n?o foi observada rela??o estatisticamente significante entre a presen?a de exossomos cultivados juntamente com as c?lulas tumorais e a capacidade de invas?o celular (p>0,05). Quando os exossomos foram colocados no compartimento inferior do transwell, as c?lulas HSC-3 em presen?a dos exossomos M2 (1,0 ?g/ml) apresentaram maior capacidade de invas?o (p?0,001). O teste de viabilidade demonstrou que as c?lulas HSC-3 tornam-se mais vi?veis frente ? presen?a dos exossomos M2 (p?0,001) na concentra??o de 50 ?g/ml. Para as c?lulas SCC-25, o resultado foi o mesmo (p?0,05). A imunofluoresc?ncia demonstrou a internaliza??o dos exossomos nas linhagens celulares estudadas. Os achados sugerem que a presen?a de exossomos M2, frente ?s culturas de c?lulas de CE de l?ngua, pode ser um campo de pesquisa importante para futuros estudos com terapias-alvo. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the oral tongue is one of the most common malignant lesions in the oral cavity and is characterized by presenting a locally invasive and aggressive behavior. The exosomes are responsible for cell-cell communication and may influence tumor progression, metastasis and therapeutic efficacy. Among the cells that can secrete exosomes are tumor cells and immune cells. It is known that the presence of immune cells is important to eradicate tumors. However, recent findings suggest that inflammation may promote tumor growth. The tumor associated macrophages (TAMs) are known to have subtypes, M1 and M2, that secrete exosomes. This study?s goal was to observe the behavior of derivatives TAMs exosomes, subtypes 1 and 2, against human cell culture SCC-25, HSC-3 and SAS derived from SCC of oral tongue, through the analysis of invasiveness, proliferation and viability of tumor cells in the presence of exosomes. It was observed that the microvesicles derived from TAMs are positive for CD63, characterizing them as exosomes. The exosomes of the M2 subtype TAMs were the only ones to present TGF-? marking, as compared with M1 exosomes, THP1 and SCC cell lines, suggesting that M2 exosomes may be responsible for TGF-? expression in tumor cells. In the migration tests, it was found that the SCC-25 cells in the presence of culture medium DMEM F / 12 showed higher invasion capacity in the presence of M2 exosomes (p?0,001) to a concentration of 0.1 ?g/ml. For HSC-3 and SAS cells, there was no significant statistical relationship between the presence of exosomes and invasiveness (p> 0.05) for the exosomes derived from TAMs. When the exosomes were placed in the lower compartment of the transwell, the HSC-3 cells in the presence of M2 exosomes (1.0 ?g/ml) had higher invasiveness (p?0,001). The viability test showed that HSC-3 cells became more viable in the presence of M2 exosomes (p?0.001) at a concentration of 50 ?g/ml. For SCC-25 cells, the result was the same (p?0.05). Immunofluorescence showed the internalization of exosomes in the cell lines studied. These findings suggest that the presence of M2 exosomes in the SCC of the oral tongue cell cultures may be an important research field for future studies of targeted therapies.

O acidente vascular encefálico (AVE) é uma doença comum e de grande impacto para a saúde da população, uma vez que é considerado a principal causa de incapacidades neurológicas, principalmente motora e cognitiva. Considerando que os exossomos e o seu conteúdo podem ser marcadores prognóstico de demência em pacientes com Doença de Alzheimer, avaliamos o perfil exossomal circulante em pacientes pós AVE isquêmico com e sem comprometimento cognitivo. Ainda, é de conhecimento que os pacientes tratados com trombolíticos apresentam redução na dependência funcional a longo prazo, assim é de interesse avaliar os exossomos periféricos destes pacientes. Este trabalho visou investigar o perfil de exossomos circulantes em pacientes após diagnóstico de AVE isquêmico (AVEI) nas fases aguda e crônica. Foram determinados o conteúdo de proteína total e a atividade da acetilcolinesterase (AChE), marcadores de exossomos, além de correlacionar escores de comprometimento neurológico com os parâmetros bioquímicos. Ainda, considerando que o estresse oxidativo tem um papel central na fisiopatologia da isquemia cerebral, determinamos o conteúdo de espécies reativas e a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em exossomos circulantes. Os fatores comprometimento cognitivo e o uso do trombolítico na fase aguda da doença não mostraram ter influência sobre os parâmetros estudados. Os resultados sugerem que uma diminuição de exossomos circulantes, já que houve uma redução na quantificação de proteínas totais na fase crônica, pode sugerir um prejuízo no sistema de remoção de materiais tóxicos levando ao acúmulo de materiais indesejados disso, o estado oxidativo exossomal, representado pelos níveis de espécies reativas e a atividade da SOD, foi alterado na fase crônica quando comparado com a fase aguda. Estes resultados sugerem que há uma alteração do perfil dos exossomos ao longo do tempo nos pacientes com AVE isquêmico. Nossos dados indicam que os níveis de espécies reativas na fase aguda podem predizer alterações no perfil dos exossomos na fase crônica de pacientes com comprometimento cognitivo, especificamente nas atividades das enzimas SOD e AChE e na concentração de proteínas totais. Estas associações não foram observadas em pacientes sem comprometimento cognitivo. Correlacionamos os parâmetros bioquímicos com as escalas de déficit neurológico, os escores do Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) foram inversamente proporcionais aos níveis de AChE naqueles pacientes que não receberam o tratamento trombolítico na fase aguda. Assim, nossos dados demonstram que o prejuízo cognitivo (menores escores de MEEM) está associado a maiores níveis de atividade da AChE em exossomos circulantes. O papel dosexossomos na fisiopatologia da isquemia cerebral, assim como na predição de diagnóstico de comprometimento cognitivo precisa ser melhor investigado. / Stroke is a common disease and has a major impact on the public health, since it is considered the main cause of neurological disabilities, mainly motor and cognitive impairment. Considering that exosomes’ content may be prognostic markers of dementia in patients with Alzheimer's disease we evaluated the circulating exosomal profile in patients with ischemic stroke with and without cognitive impairment. Furthermore, it is known that thrombolytic therapy reduces long-term disability, so it is interesting to evaluate the peripheral exosomes of these patients. This work aimed to investigate the profile of circulating exosomes in patients after diagnosis of ischemic stroke in the acute and chronic phases. Total protein content and acetylcholinesterase activity (AChE), markers of exosomes were determined, also it was correlated the scores of cognitive function tests with biochemical parameters. Considering that oxidative stress plays a central role in the pathophysiology of cerebral ischemia, we determined the content of reactive species and the activity of the superoxide dismutase enzyme (SOD) in circulating exosomes. The factors cognitive impairment and the use of thrombolytic in the acute phase of the disease did not show influence on the studied parameters. The results suggest that a decrease in circulating exosomes, since there was a reduction in the quantification of total proteins in the chronic phase, may suggest a damage in the system of removal of toxic materials leading to the accumulation of unwanted materials. The exosomal oxidative state, represented by the reactive species levels and the SOD activity, was altered in the chronic phase when compared to the acute phase These results suggest that the profile of the exosomes is altered over time in patients with ischemic stroke. Our data indicate that reactive species levels in the acute phase may predict changes in the exosome profile in the chronic phase of patients with cognitive impairment, specifically in the activities of SOD and AChE enzymes and in the concentration of total proteins. These associations were not observed in patients without cognitive impairment. We correlated the biochemical parameters with the the scores of the assessment of cognitive function tests, the Mini-Mental State Examination (MMSE) scores were inversely proportional to the AChE levels in those patients who did not receive the thrombolytic treatment in the acute phase. Thus, our data demonstrate that cognitive impairment (lower MMSE scores) is associated with higher levels of AChE activity in circulating exosomes. The role of exosomes in the pathophysiology of cerebral ischemia, as well as in the prediction of diagnosis of cognitive impairment, needs to be better investigated.

O acidente vascular encefálico (AVE) é uma doença comum e de grande impacto para a saúde da população, uma vez que é considerado a principal causa de incapacidades neurológicas, principalmente motora e cognitiva. Considerando que os exossomos e o seu conteúdo podem ser marcadores prognóstico de demência em pacientes com Doença de Alzheimer, avaliamos o perfil exossomal circulante em pacientes pós AVE isquêmico com e sem comprometimento cognitivo. Ainda, é de conhecimento que os pacientes tratados com trombolíticos apresentam redução na dependência funcional a longo prazo, assim é de interesse avaliar os exossomos periféricos destes pacientes. Este trabalho visou investigar o perfil de exossomos circulantes em pacientes após diagnóstico de AVE isquêmico (AVEI) nas fases aguda e crônica. Foram determinados o conteúdo de proteína total e a atividade da acetilcolinesterase (AChE), marcadores de exossomos, além de correlacionar escores de comprometimento neurológico com os parâmetros bioquímicos. Ainda, considerando que o estresse oxidativo tem um papel central na fisiopatologia da isquemia cerebral, determinamos o conteúdo de espécies reativas e a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em exossomos circulantes. Os fatores comprometimento cognitivo e o uso do trombolítico na fase aguda da doença não mostraram ter influência sobre os parâmetros estudados. Os resultados sugerem que uma diminuição de exossomos circulantes, já que houve uma redução na quantificação de proteínas totais na fase crônica, pode sugerir um prejuízo no sistema de remoção de materiais tóxicos levando ao acúmulo de materiais indesejados disso, o estado oxidativo exossomal, representado pelos níveis de espécies reativas e a atividade da SOD, foi alterado na fase crônica quando comparado com a fase aguda. Estes resultados sugerem que há uma alteração do perfil dos exossomos ao longo do tempo nos pacientes com AVE isquêmico. Nossos dados indicam que os níveis de espécies reativas na fase aguda podem predizer alterações no perfil dos exossomos na fase crônica de pacientes com comprometimento cognitivo, especificamente nas atividades das enzimas SOD e AChE e na concentração de proteínas totais. Estas associações não foram observadas em pacientes sem comprometimento cognitivo. Correlacionamos os parâmetros bioquímicos com as escalas de déficit neurológico, os escores do Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) foram inversamente proporcionais aos níveis de AChE naqueles pacientes que não receberam o tratamento trombolítico na fase aguda. Assim, nossos dados demonstram que o prejuízo cognitivo (menores escores de MEEM) está associado a maiores níveis de atividade da AChE em exossomos circulantes. O papel dosexossomos na fisiopatologia da isquemia cerebral, assim como na predição de diagnóstico de comprometimento cognitivo precisa ser melhor investigado. / Stroke is a common disease and has a major impact on the public health, since it is considered the main cause of neurological disabilities, mainly motor and cognitive impairment. Considering that exosomes’ content may be prognostic markers of dementia in patients with Alzheimer's disease we evaluated the circulating exosomal profile in patients with ischemic stroke with and without cognitive impairment. Furthermore, it is known that thrombolytic therapy reduces long-term disability, so it is interesting to evaluate the peripheral exosomes of these patients. This work aimed to investigate the profile of circulating exosomes in patients after diagnosis of ischemic stroke in the acute and chronic phases. Total protein content and acetylcholinesterase activity (AChE), markers of exosomes were determined, also it was correlated the scores of cognitive function tests with biochemical parameters. Considering that oxidative stress plays a central role in the pathophysiology of cerebral ischemia, we determined the content of reactive species and the activity of the superoxide dismutase enzyme (SOD) in circulating exosomes. The factors cognitive impairment and the use of thrombolytic in the acute phase of the disease did not show influence on the studied parameters. The results suggest that a decrease in circulating exosomes, since there was a reduction in the quantification of total proteins in the chronic phase, may suggest a damage in the system of removal of toxic materials leading to the accumulation of unwanted materials. The exosomal oxidative state, represented by the reactive species levels and the SOD activity, was altered in the chronic phase when compared to the acute phase These results suggest that the profile of the exosomes is altered over time in patients with ischemic stroke. Our data indicate that reactive species levels in the acute phase may predict changes in the exosome profile in the chronic phase of patients with cognitive impairment, specifically in the activities of SOD and AChE enzymes and in the concentration of total proteins. These associations were not observed in patients without cognitive impairment. We correlated the biochemical parameters with the the scores of the assessment of cognitive function tests, the Mini-Mental State Examination (MMSE) scores were inversely proportional to the AChE levels in those patients who did not receive the thrombolytic treatment in the acute phase. Thus, our data demonstrate that cognitive impairment (lower MMSE scores) is associated with higher levels of AChE activity in circulating exosomes. The role of exosomes in the pathophysiology of cerebral ischemia, as well as in the prediction of diagnosis of cognitive impairment, needs to be better investigated.

Duas patologias principais estão associadas ao HTLV-1: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). O mecanismo pelo qual ocorre o desenvolvimento destas doenças em apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados é desconhecido. Sabe-se que diversos fatores estão associados ao desenvolvimento destas patologias, como carga proviral, características celulares, genéticas e imunológicas do hospedeiro. No entanto, tais mecanismos não foram totalmente elucidados e novas abordagens de estudos são necessárias para a compreensão da patogênese viral. Nesse sentido, vários estudos relatam o papel dos exossomos no desenvolvimento de infecções virais como HIV, EBV e HCV através do transporte de componentes incluindo proteínas, RNAm e miRNA. A possibilidade da transferência do conteúdo viral por essas vesículas para células não infectadas na ausência de vírus é um mecanismo intrigante. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo isolar os exossomos diretamente do soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e comparar o conteúdo dessas vesículas quanto à expressão dos genes virais tax e HBZ entre os grupos assintomático e sintomático. Para tanto, os exossomos foram isolados por precipitação polimérica (Exoquick(TM)) e caracterizados por Western Blot (expressão dos marcadores CD9, CD81, Alix e citocromo c) e Análise de Rastreamento de Nanopartículas (tamanho e concentração). Além disso, o conteúdo dos exossomos foi analisado por PCR em tempo real para quantificação dos genes virais regulatórios tax e HBZ. Por fim, no intuito de estabelecer o papel dos exossomos como biomarcadores para o desenvolvimento da HAM/TSP, os níveis de expressão destes genes foram associados à carga proviral do HTLV-1. Os transcritos de RNAm de tax e HBZ foram detectados apenas em exossomos isolados do soro dos indivíduos sintomáticos, com ausência nos assintomáticos. Além disso, a expressão de tax e HBZ nos exossomos dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 foi correlacionada positivamente com a CPV. Dessa forma, os resultados sugerem que os exossomos podem desempenhar importante papel na patogênese da mielopatia, através do transporte de genes virais de uma célula infectada para não-infectada. No entanto, mais estudos que relacionam o papel dos exossomos na infecção pelo HTLV-1 são necessários. / Two major pathologies has been associated with HTLV-1 infection: adult T- cell leukemia/lymphoma (ATLL) and HTLV-1 associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis (HAM / TSP). The mechanism which is responsible for the appearance of these diseases in only 1 to 5% of the infected individuals is unknown. Is known that several factors has been related to the development of these diseases, such as proviral load and cellular, genetic and immunological characteristics of the host. However, these mechanisms have not been fully elucidated and new approaches are necessary to understand the viral pathogenesis. Thus, several studies have reported the involvement of exosomes in the development of the HIV, HCV, and EBV viral infections carrying components including proteins, mRNA and miRNA. The possibility of transfer of viral content via these vesicles to uninfected cells in the absence of virus is an intriguing mechanism. Therefore, this proposal aimed to isolate exosomes from serum of HTLV-1 infected patients and compare the content of these vesicles regarding viral gene expression of tax and HBZ between asymptomatic and symptomatic group. For this, the exosomes were isolated by polymeric precipitation (Exoquick(TM)) and characterized by Western Blot (expression of markers CD9, CD81, and Alix) and Nanoparticle tracking Analysis (size and concentration). Furthermore, the exosomes content were analyzed by real-time PCR for the quantification of tax and HBZ regulatory viral genes. Finally, to establish the role of exosomes like biomarkers to HAM/TSP development, levels of these genes were associated with proviral load of HTLV-1. Viral mRNA transcripts including tax and HBZ were found only in exosomes isolated from serum of symptomatic individuals and absence in assymptomatic. Furthermore, tax and HBZ expression in exosomes from HTLV-1 infected individuals were positive correlated with proviral load. Thus, the results suggests that exosomes can able to develop important role in myelopathy pathogenesis carrying viral genes of infected cell to uninfected cell. However, more studies that relate the role of exosomes in HTLV-1 are needed