El zinc es un micronutriente esencial para las plantas, pero tóxico a concentraciones elevadas. La mayoría de las plantas adaptadas a suelos metalíferos excluyen el exceso de metales de sus tejidos. Sin embargo, algunas plantas denominadas hiperacumuladoras toleran y acumulan en parte aérea concentraciones de metales extremadamente altas. Una de las hipótesis más aceptadas que explica la adquisición de este rasgo relaciona una elevada concentración de metales con una mayor resistencia a patógenos y herbívoros (hipótesis de la defensa metálica). De hecho, existen evidencias de que altas concentraciones de metal en planta pueden ser tóxicas para microorganismos fitopatógenos (hipótesis de la defensa elemental), incluso a niveles por debajo del umbral de hiperacumulación (hipótesis de la mejora defensiva). No obstante, el Zn podría sobre o subregular compuestos orgánicos relacionados con el sistema inmune de la planta, acentuando la respuesta al estrés (hipótesis de los efectos conjuntos) o ahorrando costes metabólicos (hipótesis de la compensación). En esta tesis se examinó la hipótesis de la defensa metálica en plantas hiperacumuladoras y no hiperacumuladoras inoculadas con hongos necrotróficos. Para ello se consideraron el efecto directo tóxico del Zn y la interacción con las defensas orgánicas, estableciéndose tres patosistemas con plantas creciendo en distintas concentraciones de Zn: Noccaea caerulescens inoculada con Alternaria brassicicola y Arabidopsis thaliana inoculada con Alternaria o Botrytis cinerea. En el caso de Arabidopsis, se emplearon cuatro mutantes con defectos metabólicos en la respuesta al estrés: npr1, pad1, coi1 y etr1. Además, se localizaron en los Pirineos poblaciones naturales de plantas del género Noccaea, que fueron identificadas y caracterizadas con vista a futuros experimentos de campo. El Zn mejoró la resistencia de Noccaea a Alternaria, y se correlacionó negativamente con algunas de las defensas orgánicas. A pesar de que el SA, JA, ABA y las expresiones de varios genes marcadores de las rutas del SA, JA y JA/Et fueron inducidos por igual 24 horas tras la inoculación con Alternaria, una semana más tarde el Zn y las rutas de señalización de estrés se correlacionaron negativamente. Asimismo, se encontró una compensación entre el Zn y los glucosinolatos en hoja, pero, por el contrario, una semana después de la inoculación con Alternaria la concentración de glucosinolatos se vio incrementada en las hojas infectadas con mayor concentración de Zn. Las plantas de A. thaliana silvestres tratadas con Zn fueron más resistentes a Alternaria, pero no claramente a Botrytis. Arabidopsis silvestre y los mutantes de las rutas de señalización de estrés acumularon concentraciones similares de Zn en hoja, descritas como tóxicas para Alternaria, pero no para Botrytis. El Zn amplificó la expresión de los genes relacionados con las rutas de señalización del SA y del JA/Et en respuesta a la infección por Alternaria. Sin embargo, los cambios en las concentraciones de SA, JA, ABA y ACC no fueron responsables de las diferencias en la resistencia a Alternaria. Los mutantes tratados con Zn no fueron más resistentes a ninguno de los patógenos o incluso más susceptibles a Botrytis. Como el Zn no compensó su defecto metabólico, se sugiere que las defensas orgánicas activadas por el Zn tuvieron un papel más importante contra Alternaria que el Zn como defensa inorgánica. Las plantas de tres poblaciones de suelos no metalíferos de los Pirineos hiperacumularon Zn y Cd y fueron identificadas como Noccaea brachypetala según características morfológicas. Además, creciendo en hidroponía, presentaron diferencias fenotípicas, lo cual sugiere que existen diferencias genéticas subyacentes puestas de manifiesto en la expresión de genes de trasportadores de metales en respuesta a Zn y Cd exógenos. El uso de estas poblaciones para estudios de campo se ve limitado por su fragilidad y dificultad de acceso. / Zinc is an essential plant micronutrient but it can be toxic in elevated concentrations. Most of the plants adapted to metalliferous soils exclude metals from their tissues. However, some plants so-called hyperaccumulators are able to tolerate and accumulate extremely high metal concentrations in their shoots. Among the most accepted hypothesis to explain the acquisition of this trait is that heavy metals protect the plant against pathogens and herbivores (metal defense hypothesis). In fact, Zn and other heavy metals may be toxic for the attacking pathogens at high concentration in plant (elemental defense hypothesis). Metals have been accounted even for improving plant disease resistance below hyperaccumulation levels, thus being a possible explanation for the acquisition of the trait (defensive enhancement hypothesis). Nonetheless, other organic compounds related to the plant immune system, have been reported to be up or under regulated in response to Zn, thus enhancing the stress response (joint effects hypothesis) or saving metabolic cost to the plant (trade-off hypothesis). In this thesis the metal defense hypothesis was tested in metal and non-metal hyperaccumulating species inoculated with necrotrophic fungi. Both direct metal toxicity and indirect metal-induced enhancement of organic defenses were considered. For this purpose three pathosystems were established with plants growing at different Zn concentrations. The pathosystems were: Noccaea caerulescens infected with Alternaria brassicicola and Arabidopsis thaliana infected with Alternaria or Botrytis cinerea. In the case of A. thaliana, npr1, pad1, coi1 and etr1, four stress response defective mutants, were also used. Moreover, natural occurring populations of the genus Noccaea were located in the Pyrenees. Plants were identified and their Zn and Cd accumulation ability characterized with a view to future field experiments. Zn improved Noccaea resistance to Alternaria, leading to a trade-off between the metal and some of the organic-based defenses. Although SA, JA, ABA and the expression of SA, JA and JA/Et pathways marker genes were evenly induced by Alternaria 24 hours after the inoculation, one week later Zn and the hormone signaling showed a negative correlation. A trade-off was also reported between leaf glucosinolates and Zn, but, in contrast, one week after the inoculation glucosinolates concentration increased in the infected leaves with higher Zn concentration. A. thaliana WT Zn-treated plants were more resistant to Alternaria attack, but the Zn effect was not clear against Botrytis. A. thaliana WT and the stress signaling defective mutants concentrated similar leaf Zn values, that were accounted to be potentially toxic for Alternaria, but not for Botrytis. Zn amplified the expression of genes related to the SA and JA/Et signaling pathway in response to A. brassicicola infection. However, changes in the endogenous concentrations of SA, JA, ABA and ACC, were not reported to be responsible for the differences in the resistance to Alternaria. Zn-treated A. thaliana stress response defective mutants were not more resistant to none of the pathogens when Zn was applied or even more susceptible to Botrytis. As Zn did not compensate their metabolic defects, it is suggested that the plant organic defenses activated by the enhanced Zn levels against Alternaria played a more important role than Zn as a direct inorganic defense. The plants from four non-metalliferous Noccaea populations in the Eastern Pyrenees were identified attending to morphological characters as Noccaea brachypetala and they were reported to be Zn and Cd hyperaccumulators. Moreover, plants form three populations differed in the rosette shape while growing hydroponically, suggesting underlying genetic differences that were patent in the heterogeneous expression patterns of metal transporter genes in response to Zn and Cd supply. The populations were fragile and of difficult accessibility, which limits their use for field studies in metal hyperaccumulation and defense.

La presente tesis describe el desarrollo de nuevos métodos de sensado basados en nuevas propiedades de nanomateriales aplicados en la detección de proteínas y ADN. El trabajo ha sido basado en dos plataformas de sensado: primero, electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs). Estos electrodos fueron aplicados en un ensayo de detección por impedancia eléctrica de nanopartículas de oro (AuNPs). Del mismo modo, SPCE fueron adaptados mediante films de polythionina y nanopartículas de Iridio (IrOxNPs) para la detección de secuencias de ADN. La segunda plataforma utilizada fue basada en papel y tiene el formato de un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, del inglés lateral flow immunoassays). Esta plataforma se adaptó para la detección de una proteína específica Parathyroid like hormone (PTHLH) utilizando AuNPs como marcas, con el fin de obtener una nueva estrategia más simple, sin marcaje de isótopos radioactivos, menos costosa y más rápida. En el Capítulo 1 se da una visión general de las aplicaciones llevabas a cabo y mejoras aportadas por parte de nanomateriales en el campo de los biosensores, y las posibles aplicaciones en la detección de biomarcadores. En el Capítulo 2 se presentan los objetivos de la tesis. El uso de SPCE como plataforma para la detección de AuNPs mediante medidas de impedancia se presenta en el Capítulo 3 consiguiendo una mejor detección en comparación con métodos similares publicados para la detección de AuNPs. La técnica desarrollada es aplicada satisfactoriamente en la detección de AuNPs de diferente tamaño, y en un magnetoinmunoensayo utilizando AuNPs como marca para la detección de una proteína modelo. En el Capítulo 4, se presenta el trabajo relacionado con el desarrollo de nuevos sensores para la detección de DNA. El sistema está basado en la modificación de SPCEs mediante películas de un polímero y nanopartículas de óxido de iridio (IrOxNPs) sobre las cuales se inmovilizan secuencias de captura de DNA. La detección del ADN objetivo se consigue mediante medidas de impedancia eléctrica, basadas en el efecto de bloqueo del ADN hibridado para la difusión de un indicador redox a la superficie del electrodo. El biosensor resultante, que opera en modo libre de marcas, fue utilizado para la detección de secuencias de ADN específicas para el parásito de Leishmania. En el Capítulo 5 se presentan conclusiones generales y perspectivas futuras. En el Anexo A, se presenta el trabajo relacionado con las plataformas de papel para la detección de una proteína específica, PTHLH. El sistema de detección presentado es del tipo LFIA. La técnica desarrollada supone una alternativa menos costosa, más rápida y menos peligrosa a las técnicas disponibles actualmente. El límite de detección (LOD) conseguido está en el rango de ng mL-1 en muestras reales (medio de cultivo celular y lisado celulares). Además, se comprobó la compatibilidad del método desarrollado con suero humano utilizando suero humano con PTHLH añadido. En el Anexo B, se presenta el trabajo llevado a cabo en una estancia de investigación. En esta sección se presenta la fabricación de sensores electroquímicos de ADN (E-DNA) y basados en aptameros (E-Ab), y la aplicación de dicha tecnología en sensores serigrafiados de oro y en SPCE modificados con AuNPs. El Anexo C representa la investigación llevada a cabo como continuación de otra hecha anteriormente en nuestro grupo. Las condiciones y materiales encontrados previamente se aplicaron en la fabricación de una plataforma de nanocanales para la detección de una proteína secretada por células cultivadas directamente sobre la plataforma de sensado. / This thesis describes the study and development of new biosensing approaches based on novel properties of nanomaterials for the detection of proteins and DNA. The work has been performed in basis of two sensing platforms: first platform, the carbon screen-printed electrodes (SPCEs), were used in a more sensitive detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements. Furthemore, the same platform (SPCE) was adapted through polythinione films and iridium oxide nanoparticles (IrOxNPs) for the detection of specific DNA sequences in a label free assay. The second platform, paper-based platforms in format of Flow Immunoassay (LFIA), using gold nanoparticles as labels is adapted for the detection of a specific protein, Parathyroid like Hormone (PTHLH), with the aim to find a new strategy for simpler, non-hazardous, cheaper and faster detection of the protein. In Chapter 1 a general overview of the application of nanomaterials for the improvement of biosensors and its application in the field of diagnostics and biomarkers detection is presented. In Chapter 2 the objectives of the thesis are presented. Use of SPCE as platform for detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements is presented in Chapter 3. The developed technique is successfully applied in the detection of AuNPs of different sizes, and in a magnetoimmnuoassay for the detection of a model protein using AuNPs as electrochemical labels. In Chapter 4, a novel biosensor for the detection of DNA is presented. The system is based in SPCE modified with polymer films and Iridium Oxide nanoparticles, where capturing DNA sequences have been immobilized. Detection of target DNA sequences is performed through electric impedance measurements, based in the blocking effect of the DNA against the diffusion of a redox indicator to the surface of the electrode. A label free immunoassay for detection of specific sequences of Leishmania parasite’s DNA is shown. In Chapter 5 general conclusions and future perspectives of the presented work are discussed. In Annex A the work related to the paper-based platform for protein detection is presented. In this annex, detection of a specific protein (parathyroid like hormone, PTHLH) through LFIA strips is described. The developed LFIA strips represent a cheaper, faster and non-hazardous alternative to current available systems for PTHLH detection. Limits of detection (LOD) in the range of ng mL-1 for PTHLH in real samples (cell culture media, cell lysates) are reported. Furthermore, the developed system is challenged using human serum spiked with PTHLH, proving the potential of the system to detect PTHLH In human serum. In Annex B the work carried out in a research stay is presented. In this section fabrication of electrochemical DNA (E-DNA), and electrochemical aptamer (E-Ab) biosensors is described. The aim of the work was focused on adapting the E-DNA and E-Ab technology to SPCE, using AuNPs as connecting platform between the thiol modified DNA and the SPCE. Annex C represents a research done as a continuation of a previous one done in the group related mostly to the study of compatible materials with interest to be used as cells growth platforms with interest in sensing. As continuation of this work, in Annex C the conditions and materials previously selected to grow cells are applied in a nanochannel platform for the detection of a protein secreted by the cells grown directly on the sensing platform.

Els anellovirus són un grup de virus de cadena senzilla d’ADN amb una elevada diversitat genètica i que infecten a vertebrats. Els Torque teno sus virus (TTSuV) son ubics i és l’espècie d’anellovirus específica que infecta els porcs. S’han descrit 3 espècies víriques diferents, anomenades TTSuV1a i TTSuV1b dins del gènere Iotatorquevirus i TTSuVk2a, dins el gènere Kappatorquevirus. Aquests virus son genèticament molt diferents (>56% de diversitat de seqüencia nucleotídica) però comparteixen la mateixa organització del genoma i estratègia d’expressió. L ‘infecció de TTSuV en porcs es caracteritza per una virèmia persistent. Els TTSuVs no es consideren patogènics, però es creu que juguen un paper en la co-infecció amb altres agents infecciosos que causen malalties porcines importants. L'impacte real dels TTSuVs sobre la salut dels porcs, si n’hi ha , segueix sent objecte de debat. L'objectiu principal d'aquesta Tesi fou caracteritzar la variabilitat de TTSuV i explorar el desenvolupament de possibles prototipus vacunals enfront els TTSuVs. El primer estudi descriu la caracterització genètica d'una nova espècie de TTSuV, anomenada Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). Segons l'anàlisi filogenètica, aquest nou virus pertany al gènere Kappatorquevirus, el mateix al qual pertany TTSuVk2a. Es van desenvolupar tècniques quantitatives de PCR basades en la tecnologia de SybrGreen pels estudis epidemiològics i per l’estudi de la distribució geogràfica. En concret, es va desenvolupar una tècnica que quantificava la càrrega total de TTSuV (TTSuV broad-spectrum qPCR) i tres més que quantificaven la càrrega viral específica de cada espècie de TTSuV. D'altra banda, es va estudiar la prevalença i la càrrega d'ADN vírica en animals afectats amb per circovirosi porcina (CP). L'estudi epidemiològic va revelar que TTSuVk2b es distribueix a tot el món, encara que és menys abundant que TTSuV1 i TTSuVK2a. TTSuVk2b es va associar amb la CP, una malaltia porcina d'importància econòmica molt significativa. El segon estudi contenia dos objectius: d'una banda, l'expressió de les proteïnes TTSuVs; per l'altra banda, l’avaluació de l'impacte d’una vacuna experimental multivalent enfront les 4 espècies de TTSuVs conegudes, utilitzant com a model l’infecció natural de TTSuV en porcs. Les proteïnes recombinants ORF1, ORF1-A, ORF2 i ORF3 dels quatre TTSuVs coneguts es van expressar amb èxit mitjançant un sistema d'expressió de baculovirus. Per altra part, la vacuna experimental multivalent (formada per les proteïnes dels gens ORF1 i ORF3) va ser administrada per via intramuscular i intradèrmica utilitzant dos esquemes de vacunació diferents (dues o tres dosis). La seroconversió i els títols vírics en sang es van mesurar a partir de 3 fins a 15 setmanes d'edat, utilitzant respectivament l'ELISA indirecte basat en proteïnes del virus expressades en baculovirus i tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie TTSuV, respectivament. Aquest estudi va mostrar que la vacuna multivalent induïa anticossos anti-TTSuV, però aquest prototipus vacunal no era capaç de controlar la virèmia durant l’infecció natural de TTSuV. Finalment, en el tercer estudi es va avaluar l’immunització enfront TTSuVk2a durant l’infecció natural en porcs. L’immunització va consistir en una combinació d'ADN i proteïnes víriques per augmentar les possibilitats d'activació de respostes immunitàries tant cel·lulars com humorals. Es van utilitzar tècniques de PCR quantitativa per detectar i quantificar els nivells de virèmia de cada espècie de TTSuV, mentre que l’inducció d'anticossos específics va ser monitoritzada mitjançant ELISA indirecte. El grup vacunat va mostrar una seroconversió i una reducció significativa de les càrregues víriques de TTSuVk2a en comparació amb el grup control. Aquest estudi va demostrar per primera vegada que la virèmia per TTSuV pot ser controlada a través de l’ús d’una combinació que inclou ADN i proteïnes recombinant. En general, aquesta Tesi Doctoral contribueix a augmentar el coneixement dels TTSuVs mitjançant la descripció d’una nova espècie vírica, la qual pot estar associada al desenvolupament de malalties del porc, com s’ha indicat per TTSuVk2a. A més, l’infecció per TTSuV pot ser controlada mitjançant l'administració d'una vacuna d'ADN i proteïnes recombinats del virus, mentre que la vacuna basada en múltiples proteïnes (multivalent) no va ser eficient. / Anelloviruses are a highly diverse group of circular single-stranded DNA viruses infecting vertebrates. Torque teno sus viruses (TTSuV) are ubiquitous pig-infecting anelloviruses. Three different viral species have been described, namely TTSuV1a and 1b within the genus Iotatorquevirus and TTSuVk2a, within the genus Kappatorquevirus. These viruses are genetically very distinct (>56% sequence diversity) but share similar genome organization and expression strategy. TTSuV infection in pigs is distributed worldwide, and is characterized by a persistent viremia. TTSuV themselves are considered non-pathogenic; however, it is believed that these viruses play a role in co-infection with other economically important viral porcine infections. Apparently, TTSuV infection can influence the development or may contribute to the pathogenesis of various porcine diseases during co-infection. The real impact of TTSuV on the pig health, if any, is still under debate. The present Thesis aimed to characterize a novel TTSuV species and to explore possible ways of vaccination against TTSuVs. The first study describes the discovery, genetic characterization and epidemiology of a novel TTSuV species, named Torque teno sus virus k2b (TTSuVk2b). According to phylogenetic analysis, this new virus belongs to the Kappatorquevirus genus, belonging to the same genus as TTSuVk2a. Quantitative PCR techniques based on SybrGreen technology were developed; one for quantification of total TTSuV load (TTSuV broad-spectrum qPCR) and others for quantification of each TTSuV species separately. These techniques were used for epidemiological studies and assess the geographical distribution. Moreover, prevalence and viral DNA load were determined in porcine circovirus type 2-systemic disease (PCV2-SD)-affected animals and healthy counterparts, since previous studies have associated another kappatorquevirus species, to the disease. The epidemiological study revealed that TTSuVk2b is worldwide distributed, although less abundant and displaying lower viral DNA titres in serum than TTSuV1 and TTSuVk2a. TTSuVk2b was associated with PCV2-systemic disease (PCV2-SD), which revealed that the two kappatorquevirus species are both genetically and biologically related. The second study contained two objectives. On one hand, TTSuV proteins were expressed in a baculovirus-based platform; on the other hand, the impact of a multivalent experimental vaccine was evaluated in a natural TTSuV infection model of pigs. The ORF1, ORF1-A, ORF2 and ORF3 recombinant proteins of all four known TTSuVs were successfully expressed in a baculovirus expression system. In additional, the multivalent experimental vaccine containing ORF1 and ORF3 proteins was administered by intramuscular and intradermal routes using two different vaccination schedules (twice or three times). Seroconversion and viral titres in blood were measured from 3 weeks until 15 weeks of age, using the indirect ELISA based on baculoviruses proteins and species-specific qPCRs, respectively. This study showed that vaccination induced anti-TTSuV antibodies; however the multivalent vaccine was not able to control viremia during TTSuV natural infection. Finally, in the third study, the immunization against TTSuVk2a during natural infection was evaluated using a different approach. The immunizations consisted of a combination of DNA and protein to increase the possibilities of activating both cellular and humoral immune responses. Quantitative PCR techniques were used to detect and quantify the viremia levels of each TTSuV species, while the induction of specific antibodies was monitored by indirect ELISA. The vaccinated group showed a seroconversion and a significant reduction of the TTSuVk2a viral loads compared to the control group. This study demonstrated for the first time that TTSuV viremia can be controlled by a combined DNA and protein immunization. Overall, the present Thesis contributes to increase the knowledge on TTSuV by means of describing a novel species, which may be involved in disease progression in co-infection with other pig pathogens. Moreover, TTSuV infection can be controlled by the administration of a combined DNA/protein immunization while a multivalent protein based vaccine was not efficient.

Esta tesis presenta el desarrollo y la fabricación de pilas de combustibles microfluídicas para aplicaciones portátiles de baja potencia. En concreto, pilas biológicas que utilizan las enzimas en la degradación de la glucosa. El trabajo está dividido en dos secciones dependiendo de si los dispositivos fabricados son activos, es decir, los reactivos son suministrados a la micropila por bombeo (Capítulo 2 y 3). O si por el contrario los reactivos fluyen sin necesidad de mecanismos externos los dispositivos serán pasivos (Capítulo 4 y 5). En el primer capítulo de la tesis se ha llevado a cabo la primera aproximación en el desarrollo de micro pilas de combustible glucosa/O2 con el objetivo de hacer posible las primeras medidas electroquímicas con enzimas. La pila microfluídica fue construida sobre un sustrato de vidrio en el cual se grabaron electrodos de oro mediante técnicas de microfabricación. Por otro lado, se utilizó fotolitografía suave para la fabricación de los canales (con forma de Y) en PDMS. Esta forma de canal permitió fluir dos soluciones en paralelo usando una bomba de jeringa. Como primera aproximación, las enzimas se encontraban fluyendo de manera continua a través del canal. Eso provocaba experimentos caros y dificultaba su posible aplicación portátil. De este modo, el siguiente aspecto en abordarse fue la inmovilización de los biocatalizadores sobre los electrodos de la micro pila. El Capítulo 2 presenta la fabricación de una pila de combustible que posee los biocatalizadores inmovilizados en la superficie de los electrodos lo cual hace que los biocatalizores sean aprovechados más eficientemente que en la anterior pila. Los electrodos se han fabricado utilizando resina pirolizada y se han usado por primera vez con éxito en pilas microfluídicas enzimáticas de este tipo. La pila está compuesta por diferentes capas de material plástico laminado que han sido cortadas usando un plotter de corte. Esto hace que la fabricación del dispositivo sea rápida, barata y compatible con la manufacturación a gran escala. El canal microfluídico se ha definido también sobre este tipo de material plástico, evitando el largo proceso litográfico relacionado con el PDMS. Por otro lado, el canal (en forma de Y) permite optimizar la potencia que obtenemos de la pila cuando bombeamos dos soluciones diferentes. Por otro lado, el dispositivo necesita ser simplificado para finalmente obtener una fuente de energía portátil. Con este objetivo se abordó la siguiente fase de la tesis. El Capítulo 4 describe la fabricación de una pila microfluídica implementada utilizando sustratos de papel a través de los cuales fluyen los reactivos (de manera pasiva) por efecto capilar. Los componentes de la pila se cortaron utilizando un plotter de corte, lo que permitía fabricar dispositivos con mucha rapidez. Se probó el buen funcionamiento de una pila de combustible de papel y enzimática obteniendo valores de potencia similares a los presentados en el Capítulo 3 (donde las soluciones eran bombeadas). A partir de aquí el trabajo se centró en aproximar la pila de papel a la simplicidad de los test de flujo lateral. Así que la micro pila fue adaptada y operada con éxito usando una única solución, generando energía de una bebida comercial. El Capítulo 5 presenta una micropila de combustible fabricada en papel mucho más sofisticada y pequeña que la del capítulo anterior. Se probó satisfactoriamente una nueva combinación de biocatalizadores que permitió trabajar utilizando muestras a pH neutro. Además, el tamaño compacto del sistema abrió la posibilidad de operar la pila de combustible con fluidos fisiológicos como por ejemplo la sangre. Finalmente, se ha demostrado que es posible tener una pila preparada para alimentar dispositivos que requieran poca demanda de energía. Sin embargo, todavía se deben hacer esfuerzos para acercar esta pila a un mundo real, debido principalmente a que el tiempo de vida de las enzimas es todavía limitado. / This thesis presents the development and fabrication of microfluidic fuel cells for low power and portable applications. Specifically, biological fuel cells that use enzymes for glucose degradation. This work is divided in two sections depending on whether the fabricated devices are active, i. e. the reagents are supplied into the micro fuel cell by pumping (Chapters 2 and 3). If, on the contrary, the reagents flow without needing external mechanisms they are passive devices (Chapters 4 and 5). In the first chapter of the thesis the first approach in the development of glucose/O2 micro fuel cells was conducted in order to allow for the initial electrochemical measurements with enzymes. The microfluidic fuel cell was fabricated using a glass substrate in which gold electrodes were impressed using microfabrication techniques. On the other hand, soft lithography was used to fabricate the Y-shaped PDMS channels. This channel shape enabled to flow two solutions in parallel using a syringe pump. The enzymes were continuously flowing through the channel causing expensive experiments in addition to hindering its possible portable application. Thereby, the biocatalysts immobilization on the electrodes was next addressed in this thesis. Chapter 2 presents the fabrication of a micro fuel cell with enzymes trapped on the electrode surfaces which lead to an effective use of the biocatalysts. The electrodes were fabricated using pyrolyzed resists and were successfully used for the first time in enzymatic microfluidic fuel cells of this kind. The fuel cell was formed by different layers of plastic laminated materials cut using a cutter plotter. This promotes a fast and inexpensive device fabrication which is compatible with large scale manufacturing. The microfluidic channel was also defined on this type of plastic materials, thus avoiding the long lithographic process related to the PDMS. Moreover, this Y-shaped channel allows to optimize the power obtained from the fuel cell when two different solution are pumped into the system. Therefore, the following aspect to be addressed was the biocatalyst immobilization over the electrodes of the micro fuel cell Chapter 4 describes the construction of a microfluidic fuel cell fabricated using paper substrates. The reagents flow through this paper (in a passive way) by capillary action. The fuel cell components were cut using a cutting plotter which allows fabricating devices much faster. The proper functioning of this paper-based microfluidic fuel cell was verified obtaining similar power values to those presented in Chapter 3 (were solution were pumped). From here, the work focused on bringing the paper fuel cell closer to the simplicity of lateral flow tests. The fuel cell was then adapted and successfully operated using a single solution, generating energy from a commercial drink. Chapter 5 presents a microfluidic paper-based fuel cell smaller and more sophisticated than the one presented in previous chapter. A new combination of enzyme was tested which allowed to work with samples at neutral pH. Additionally, the compact size of the system opened the possibility to operate the paper fuel cell with physiological fluids, such as blood. Finally, it was demonstrated that was possible to have a fuel cell ready to fed devices demanding low energy. However, more efforts have to be done in the field to approach this fuel cell to a real world mainly due to the still limited lifetime of the enzymes.

La investigación presentada en esta tesis describe la síntesis y caracterización de derivados aniónicos de metalacarboranos y las aplicaciones posteriores. La primera sección de la tesis se centra en la síntesis y caracterización de derivados metilados del cobaltacarboranos. La reacción de alquilación se ha logrado con éxito mediante acoplamiento cruzado entre el vértice BI y un reactivo de Grignard en presencia de [PdCl2(PPh3)2] como catalizador y CuI como cocatalizador. La determinación y la modulación del potencial redox de metalacarboranos con diferentes sustituientes ha sido estudiado con gran interés en nuestro grupo. Por lo tanto, se ha desarrollado con éxito una ruta sintética eficiente para obtener derivados clorados de metalacarboranos y el posterior estudio de las propiedades electroquímicas de los compuestos que se han sintetizado. El E1/2 (MIII/MII, M=Co, Fe) de los aniones B-halogenado y B-metilado de los metalacarboranos que se determinaron experimentalmente por voltametría cíclica indican que cada halógeno (Cl o I) introducido produce un efecto mayor y contrario al que produce el grupo alquilo. Basándose en su E1/2 potencial, ciertos compuestos seleccionados han sido probados como electrolitos en los dispositivos DSSC. Un logro importante reportado en esta tesis fue el aislamiento de diferentes sales de calcio, plata y hierro del cobaltacarboranos [3]- y sus derivados yodados. La posible aplicación de moléculas aniónicas altamente yodadas como agentes de contraste radiopacos para diagnóstico mediante imágenes de rayos X, requiere la síntesis y caracterización de Ca[I4-3]2 y Ca[I8-3]2. Las sales de plata derivadas del cobaltacarborano se han utilizado como precursoras para preparar las correspondientes sales de Fe(II) y Fe(III) que pueden formar nanopartículas magnéticas. La capacidad de los metalocarboranos individuales para el autoensamblaje y el agregado en soluciones acuosas se ha estudiado en los últimos años. Más recientemente, se ha demostrado que pequeños cambios en la estructura molecular de [3]- provocan modificaciones importantes en su comportamiento en disolución. Cuando se trabaja a altas concentraciones, la sustitución de dos BH por dos BI en la estructura de [3]- conduce a una fase liotrópica lamelar, mientras que las vesículas se forman a concentraciones bajas (1-9mM). Hemos preparado, aislado y caracterizado diferentes sales de cobaltacarborano y algunos derivados para los cuales se ha estudiado su comportamiento en D2O a diferentas concentraciones mediante 1H{11B}-RMN y 11B{1H}-RMN. Otro objetivo importante fue la reacción de apertura de anillo de los derivados de metalacarboranos functionalizados con un anillo de dioxano con biomoléculas, tales como vitaminas, ácidos grasos y azúcares a través de una reacción nucleófila. La reacción de yodación de estas biomoléculas con I2 natural, se realizó con éxito y con buenos rendimientos. Hemos diseñado nuevos derivados bioactivos de metalacarboranos que contienen dos posiciones reactivas diferentes: un átomo yodado para ser radiomarcado y una rama de PEG que se une al vector biológico. Las soluciones inyectables de compuestos química y radioquímicamente puras se han obtenido después de las reacciones de radiomarcaje, ya sea con 125I o 124I a través de la reacción de intercambio isotópico empleando un complejo de paladio como catalizador. Posteriormente se han realizado estudios de biodistribucion in vivo mediante Tomografía por Emisión de Positrones (PET) en ratones sanos y una vez confirmada la bioacumulation se estudió para ratones con cáncer de páncreas y pulmón. / The research presented in this thesis describes the synthesis and characterization of anionic metallabis(dicarbollide) derivatives and the posterior applications. The first section of the thesis is focused on the synthesis and characterization of methylated cobaltabis(dicarbollide) derivatives. The alkylation reaction has been successfully accomplished by cross-coupling reaction between the B-I vertex and Grignard reagent in the presence of [PdCl2(PPh3)2] as catalyst and CuI as cocatalyst. The redox potential determination and modulation of differently substituted metallacarboranes is a matter of interest in our group. So, an efficient synthetic pathway to obtain chlorinated metallabis(dicarbollide) derivatives has been successfully developed and the posterior study of electrochemical properties of the compounds has been accomplished. The E1/2 (MIII/MII, M=Co, Fe) for B-halogenated and B-methylated metallabis(dicarbollide) anions were experimentally determined by Cyclic Voltammetry indicating that each halogen atom (Cl or I) produces an opposite and larger effect than each alkyl moiety. Based on their E1/2 potential, selected compounds have been tested as electrolytes in the DSSC devices. An important achievement reported in this thesis was the isolation of different calcium, silver and iron salts of cobaltabis(dicarbollide) [3]- and its iodinated derivatives. The possible application of such highly iodinated anionic molecules as radiopaque contrast agent for X-ray diagnosting imaging, required the synthesis and characterization of Ca[I4-3]2 and Ca[I8-3]2. Silver set of cobaltabis(dicarbollide) derivatives have been used as precursor to prepare the corresponding Fe(II) and Fe(III) salts that can form magnetic nanoparticles. The ability of single metallacarboranes to self-assembly and aggregate in aqueous solutions has been demonstrated in the last few years. More recently, it has been proven that minor changes in the molecular structure of [3]- provoke major modifications in the solution behavior. The substitution of two B-H by two B-I in the structure of [3]- leads to a lamellae lyotropic phase at high concentration, while vesicles are formed at small concentration (1-9mM). We prepared, isolated and characterized a set of different salts of the parent cobaltabis(dicarbollide) and some of its derivatives and we studied by 1H{11B}-NMR and 11B{1H}-NMR in D2O their behavior at different concentrations. Another important goal was the ring opening reaction of the zwitterionic metallabis(dicarbollide) derivatives with biomolecules, such as vitamins, fatty acids and sugars via a nucleophilic reaction. The iodination reaction of this biomolecules with natural I2 was successfully performed in good yields. We have designed new bio-functional metallabis(dicarbollide) derivatives which contain two different reactive sites: a suitable iodinated moiety ready to be radiolabeled and a PEG branch that can carry the vector. Injectable solutions of chemically and radiochemically pure compounds have been obtained after the radiolabelling reactions with either 125I or 124I via palladium catalyzed isotopic exchange reaction. In vivo Positron Emission Tomography (PET) biodistribution studies were performed on healthy mice and also in tumor model.

La cirrosis ha sido definida como una etapa final de la enfermedad hepática, donde convergen diferentes fenómenos que afectan a la supervivencia de los individuos que la padecen. Dentro de estos fenómenos encontramos el paso de productos bacterianos al torrente sanguíneo, definido como translocación bacteriana patológica. Estos productos bacterianos al ser reconocidos por los Toll-like receptors de las células del sistema inmune, generan un estado pro-inflamatorio crónico. Este estado altera la respuesta inmune sistémica y predispone al desarrollo de infecciones bacterianas y complicaciones de la cirrosis, como la peritonitis bacteriana espontanea. Los probióticos pueden prevenir la translocación bacteriana patológica modulando la microbiota intestinal y mejorando la barrera intestinal. Sin embargo, se desconocen los mecanismos por los cuales mejoran estas condiciones. El primer objetivo de este trabajo ha sido evaluar como el polimorfismo en los TLRs influye en el estado pro-inflamatorio crónico y en concreto en la respuesta inmune sistémica de los pacientes con cirrosis. El segundo objetivo ha sido caracterizar la respuesta inmune innata local en los líquidos ascíticos de los pacientes con cirrosis. Por ultimo, se ha evaluado la influencia de los probióticos en el manejo de la cirrosis inducida con CCl4 en un modelo experimental de rata. A continuación se resumen los resultados de cada publicación. Cytokine production in patients with cirrhosis and TLR4 polymorphisms.% Nieto JC, Sánchez E, Román E, Vidal S, Oliva L, Guarner- Argente C, Poca M, Torras X, Juárez C, Guarner C, Soriano G. World Journal of Gastroenterology. 2014; 20(46): 17516-24. Se analizó la producción de citocinas de las células de sangre perférica de pacientes con cirrosis con o sin el polimorfismo de TLR4 D299G y/o T399I. Los pacientes con alguno de los polimosrfismos de TLR4 tuvieron una mayor incidencia de encefalopatía hepática previa que los pacientes wlid-type (78% vs 20%, P = 0.02). La producción espontanea de IL-6 e IL-10 fue menor en los pacientes con polimorfismos de TLR4 que en los pacientes wild-type [IL-6: 888.7 (172.0-2119.3) pg/mL vs. 5540.4 (1159.2-26053.9) pg/mL, P < 0.001; IL-10: 28.7 (6.5-177.1) pg/mL vs 117.8 (6.5-318.1) pg/mL, P = 0.02]. Sin embargo la producción de TNF-α, IL-6 e IL-10 después de la estimulación con LPS y LTA fue similar en los dos grupos. La presencia de alguno de los polimorfismos de TLR4 en los pacientes con cirrosis se asoció con un patrón distinto en la producción de citocinas, sugiriendo que los polimorfismos en TLR4 tienen un papel importante en el desarrollo de las complicaciones de la cirrosis. Impaired innate immune response of leukocytes from ascitic fluid of patients with spontaneous bacterial peritonitis Juan Camilo Nieto, Elisabet Sánchez, Cristina Romero, Eva Román, Maria Poca, Carlos Guarner, Cándido Juárez, Germán Soriano, Silvia Vidal. Journal of Leukocyte Biology. Epub ahead of print August 7, 2015 - doi:10.1189/jlb.3AB0315-106R Se analizó la respuesta inmune en el líquido ascítico de pacientes con cirrosis y ascitis que presentaban: ascitis estéril, PBE de cultivo positivo bacteriano ó PBE de cultivo negativo, antes y después del tratamiento con antibióticos. En el momento del diagnóstico, se observaron altos niveles de IL-6 e IL-10 en el líquido ascítico de los pacientes con PBE con cultivo positivo y PBE con cultivo negativo. Además había una correlación de los niveles de IL-6 con el porcentaje de neutrófilos (R = 0.686, P , 0.001). En este entorno, los neutrófilos de PBE con cultivo positivo y negativo tenían un estallido respiratorio deficiente, y, después del tratamiento solamente los neutrófilos de PBE con cultivo negativo recuperaron su función completa. Las altas concentraciones de IL-6 e IL-10 se correlacionaban con macrófagos de baja granularidad y niveles bajos de la expresión de CD14 (R = - 0.436, P = 0.005 and R = 0.414, P = 0.007, respectivamente). Los macrófagos de pacientes con PBE con cultivo positivo expresaban niveles bajos de CD16, CD86, CD11b, CD206 y HLA-DR, sugiriendo una función global deficiente. El tratamiento con antibióticos incrementó todos los marcadores antigénicos analizados en los macrófagos de PBE con cultivo positivo. El tratamiento con antibióticos también aumentó la expresión de CD11b y CD86 en los macrófagos de PBE con cultivo negativo. En estos macrófagos, el incremento estuvo acompañado por la recuperación de la función fagocítica. En resumen, los antibióticos revirtieron los niveles de expresión de los marcadores analizados en los macrófagos de PBE con cultivo positivo y negativo a niveles de los macrófagos de la ascitis estéril y restauraron la función de las células de PBE con cultivo negativo. VSL#3 probiotic treatment decreases bacterial translocation in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis Elisabet Sánchez*, Juan C. Nieto*, Ana Boullosa, Silvia Vidal, Francesc J. Sancho, Giacomo Rossi, Pau Sancho-Bru, Rosa Homs, Beatriz Mirelis, Caándido Juárez, Carlos Guarner, Germán Soriano. Liver International. 2015 Mar;35(3):735-45. *Los autores contribuyeron de igual manera en la publicación. Se estudió como el tratamiento con VSL#3 modificaba la translocación bacteriana, la barrera intestinal y la respuesta inmune en el modelo experimental de rata con cirrosis inducida con CCl4. La mortalidad fue similar en el grupo de ratas que habían tomado VSL#3 (10/22, 45%) y el grupo que solo había bebido agua (10/24, 42%). La incidencia de translocación bacteriana fue de 1/12 (8%) en el grupo VSL#3, 7/14 (50%) en el grupo que solo bebía agua (P=0.03 grupo agua vs. grupo VSL#3) y 0/11 (0%) en el grupo control (no cirrosis) (P=0.008 grupo control vs. grupo agua). La concentración de enterobacterias y enterococos ileal y cecal fue similar en los dos grupos de ratas con cirrosis. La concentración de ocludina fue mayor y los niveles de malondialdheido y TNF-α en el suero fueron menores en el grupo VSL#3 comparado con el grupo que solo bebió agua (P<0.05). En resumen, el VSL#3 disminuye la translocación bacteriana, el estado pro-inflamatorio y el daño oxidativo ileal, además incrementa la expresión de ocludinas en el modelo experimental de ratas con cirrosis. / Cirrhosis has been defined as end-stage of liver disease that invariably leads to death. Liver damage can originate pathological bacterial translocation and the passage of bacteria and/or bacterial products to blood flow. Bacterial products can be recognized by immune cells with TLRs and subsequently develop a chronic proinflammatory state. This state alter immune responses predispose to bacterial infections and frequent complications such as spontaneous bacterial peritonitis (SBP). Probiotics can prevent pathological bacterial translocation by modulating intestinal microbiota, improving intestinal barrier and immune disturbances. However, mechanisms involved in better responses in cirrhosis are still unknown. The first objective of this study was to analyze how TLR polymorphisms influence the chronic pro-inflammatory state and specifically in the systemic immune response of patients with cirrhosis. The second objective was to characterize the local innate immune response in ascitic fluid of patients with cirrhosis. Finally, we evaluated the influence of probiotics in the management of cirrhosis induced in an experimental model rats with CCl4. We summarize the results of each publication in the next paragraphs. Cytokine production in patients with cirrhosis and TLR4 polymorphisms.% Nieto JC, Sánchez E, Román E, Vidal S, Oliva L, Guarner- Argente C, Poca M, Torras X, Juárez C, Guarner C, Soriano G. World Journal of Gastroenterology. 2014; 20(46): 17516-24. We analyze the cytokine production by peripheral blood cells from cirrhotic patients with and without TLR4 D299G and/or T399I polymorphisms. Patients with TLR4 polymorphisms had a higher incidence of previous hepatic encephalopathy than wild-type patients (78% vs. 20%, P = 0.02). Spontaneous production of interleukin (IL)-6 and IL-10 was lower in patients with TLR4 polymorphisms than in wild-type patients [IL-6: 888.7 (172.0-2119.3) pg/mL vs. 5540.4 (1159.2-26053.9) pg/mL, P < 0.001; IL-10: 28.7 (6.5-177.1) pg/mL vs. 117.8 (6.5-318.1) pg/mL, P = 0.02]. However, the production of tumor necrosis factor-α, IL-6 and IL-10 after LPS and LTA stimulation was similar in the two groups. TLR4 polymorphisms were associated with a distinctive pattern of cytokine production in cirrhotic patients, suggesting that they play a role in the development of cirrhosis complications. Impaired innate immune response of leukocytes from ascitic fluid of patients with spontaneous bacterial peritonitis Juan Camilo Nieto, Elisabet Sánchez, Cristina Romero, Eva Román, Maria Poca, Carlos Guarner, Cándido Juárez, Germán Soriano, Silvia Vidal. Journal of Leukocyte Biology. Epub ahead of print August 7, 2015 - doi:10.1189/jlb.3AB0315-106R Immune response was analyzed in patients with cirrhosis and ascities with sterile ascites, bacterial positive culture SBP or negative culture SBP before and after antibiotic treatment. At diagnosis, a high concentration of IL-6 and IL-10 was found in the ascitic fluid from negative and positive bacteriological culture. The IL-6 concentration correlated with the percentage of neutrophils (R = 0.686, P = 0.001). In this context, positive and negative culture neutrophils had an impaired oxidative burst, and, after the antibiotic, the negative culture spontaneous bacterial peritonitis burst was fully recovered. Higher concentrations of IL-6 and IL-10 correlated with the presence of low granular CD14low macrophages (R = -0.436, P = 0.005 and R = 0.414, P = 0.007, respectively). Positive culture spontaneous bacterial peritonitis macrophages expressed the lowest levels of CD16, CD86, CD11b, and CD206, and HLA-DR, suggesting an impaired global function. Treatment increased all markers on the positive culture macrophages and CD11b and CD86 on negative culture macrophages. In negative culture spontaneous bacterial peritonitis, this increase was accompanied by phagocytic function recovery. The antibiotics then reverted the marker levels on positive and negative culture macrophages to the levels on sterile ascitis macrophages and restored ascitic negative culture cell function. VSL#3 probiotic treatment decreases bacterial translocation in rats with carbon tetrachloride-induced cirrosis Elisabet Sánchez*, Juan C. Nieto*, Ana Boullosa, Silvia Vidal, Francesc J. Sancho, Giacomo Rossi, Pau Sancho-Bru, Rosa Homs, Beatriz Mirelis, Caándido Juárez, Carlos Guarner, Germán Soriano. Liver International 2014 *Both authors contributed equally to the study. Bacterial translocation, Intestinal barrier and immune response were assessed in rats with CCl4 induced cirrhosis. Mortality during this study was similar in the VSL#3 group (10/22, 45%) and the water group (10/24, 42%). The incidence of bacterial translocation was 1/12 (8%) in the VSL#3 group, 7/14 (50%) in the water group (P = 0.03 vs. VSL#3 group) and 0/11 in the control group (P = 0.008 vs. water group). The concentration of ileal and caecal enterobacteria and enterococci was similar in the two groups of cirrhotic rats. The ileal occludin concentration was higher and ileal malondialdehyde and serum levels of TNF-α were lower in the VSL#3 group than in the water group (P < 0.05). VSL#3 decreases bacterial translocation, the proinflammatory state and ileal oxidative damage and increases ileal occludin expression in rats with experimental cirrhosis.

El càncer de bufeta (BC) és un dels càncers més comuns a Europa. Afortunadament, la majoria de pacients es diagnostiquen en els estadis primerencs de la malaltia, quan el tumor es troba a la mucosa. D’aquest estadi en diem càncer de bufeta no invasiu (NMIBC). El tractament consisteix en la resecció del tumor i, posteriorment, a administrar intravesicalment la soca atenuada de Mycobacterium bovis, M. bovis BCG viu. Els beneficis del BCG com a teràpia per a pacients de NMIBC són clars: el BCG evita la recurrència i la progressió del BC, la qual cosa millora la supervivència dels pacients. Tot i així, cal no oblidar els desavantatges. La majoria de pacients pateixen efectes secundaris lleus i, fins i tot, severs i molts pacients han d’abandonar el tractament a causa de la seva toxicitat. Per tant, cal trobar alternatives més segures. Recentment s’ha descrit la capacitat antitumoral del micobacteri ambiental Mycobaterium brumae. M. brumae ha demostrat tenir una activitat antitumoral semblant al BCG sobre diferents línees cel·lulars de BC humanes. A més a més, aquesta espècie és capaç d’activar macròfags de ratolí i, també, d’activar cèl·lules mononuclears de sang perifèrica per a que siguin citotòxiques per a les cèl·lules de BC. Per tant, el següent pas seria estudiar la capacitat antitumoral de M. brumae i la seva capacitat estimuladora del sistema immunitari en el model animal de BC. Però primer, caldria abordar un altre qüestió important. Es coneix que els micobacteris, degut a l’alt contingut lipídic de la seva paret, són molt hidrofòbics i tenen tendència a formar agregats quan es troben en solucions aquoses. Aquests agregats dificultarien la interacció dels micobacteris amb les cèl·lules canceroses. En aquesta investigació, es van estudiar diferents emulsions amb l’objectiu de disminuir la mida d’aquests agregats. A més a més, l’emulsió escollida havia de mantenir la viabilitat d’M. brumae, de mantenir la seva capacitat antitumoral i de induir una resposta immunitària in vitro. Quan finalment es va escollir, es van aplicar diferents tractaments en el model animal. La supervivència dels animals amb tumor va ser registrada i la resposta immunitària generada es va estudiar mitjançant diverses tècniques. M. brumae ha mostrat resultats prometedors en el model animal i, per tant, podria ser considerat una alternativa segura al BCG per al tractament de pacients de NMIBC. / Bladder cancer (BC) is one of the most common cancers in Europe. Fortunately, most of the cases are diagnosed at early stages of the disease, when tumours are still confined to the mucosa. These are called non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). The treatment consists on resecting the tumour and, then, on the intravesical administration of the attenuated stain of Mycobacterium bovis, M. bovis BCG in its live form. The benefits of BCG in NMIBC patients are clear; BCG avoids recurrence and progression of BC which improves the survival rate of the patients. Nevertheless, the drawbacks cannot be forgotten. Most treated patients experience mild to severe side effects and many patients have to abort the BCG treatment due to its toxicity. Thus, safer alternatives are needed. It has been recently described the antitumour capacity of Mycobacterium brumae, an environmental mycobacterium. M. brumae showed in vitro a similar antitumour activity to BCG on different BC cell lines. Moreover, this species showed to be able to activate murine macrophages and to activate peripheral blood mononuclear cells’ cytotoxicity against BC cells. Thus, the next step was to test M. brumae’s antitumour capacity and its ability to activate an immune response in an animal model of BC. Moreover, another important issue was addressed on the way. It is known that mycobacteria, due to the high lipidic content of their cell wall, are very hydrophobic and have the tendency to aggregate in aqueous solutions. These clumps might difficult the interaction between the bacteria and the BC cells. In this thesis, different emulsions were assayed in order to diminish the size of these aggregates. In addition, the chosen emulsion had to maintain M. brumae viability, to maintain its antitumour activity and its capacity to induce an immune response in vitro. Once one emulsion was chosen, different treatments were tested in the animal model. Survival rates of the treated tumour-bearing mice were recorded and the local and systemic immune response was also studied by using different techniques. In conclusion, emulsified M. brumae showed promising results in the BC mouse model which means it could be a safer alternative to BCG for NMIBC patients.

La inoculación de Staphylococcal enterotoxin B (SEB) en combinación con DGalactosamina en ratones BALB/c, induce shock tóxico y provoca la muerte al cien por cien de los ratones. Una pronta y elevada liberación de IL-2, IL-6, IFNγ y TNFα, así como una activación de STAT1 y STAT3 fueron observadas durante este proceso. Por el contrario, la inoculación periódica de bajas dosis de SEB modifico la respuesta y evito la muerte de los ratones tras inducirles el shock tóxico. Los niveles séricos de citocinas proinflamarorias IL-2 e IFNγ así como sus receptores celulares fueron bajos en estos ratones, mientras que los niveles de IL-10 fueron muy elevados. En el shock tóxico IFNγ fue el responsable de la marcada activación de JAK/STAT1 y de provocar la muerte ya que como se probó, al inhibir las Proteinas JAK con AG490 los niveles de IFNγ así como los de su receptor se redujeron y se evito la muerte. IL-6 fue quien activo STAT3 durante el shock tóxico mientras que IL-10 jugo un papel fundamental en la activación de STAT3 en los ratones tolerizados. EL papel relevante de las células CD4 fue determinado cuando los ratones control que recibieron los linfocitos T CD4 sobrevivieron a la muerte tras la inducción de shock tóxico. Adicionalmente, linfocitos T CD4 purificados a partir de ratones tolerizados, Durante el proceso de tolerización proteínas implicadas en la señalización vía TCR como DGKα

This dissertation addresses three different problems in the study of discrete dynamical systems. Firstly, this work dynamically classifies a 9−parametric family of planar birational maps f : C2 → C2 that is f(x, y) = α0 + α1x + α2y, β0 + β1x + β2y γ0 + γ1x + γ2y , where the parameters are complex numbers. This is done by finding the dynamical degree δ for the degenerate and non degenerate cases of F that is the extended map of f in projective space. The dynamical degree δ defined as δ(F) := lim n→∞ (deg(Fn)) 1 n , indicates the subfamilies which are chaotic, that is when δ > 1, and otherwise. The study of the sequence of degrees dn of F shows the degree growth rate of all the subfamilies of f. This gives the families which have bounded growth , or they grow linearly, quadratically or grow exponentially. The family f includes the birational maps studied by Bedford and Kim in [18] as one of its subfamily. The second problem includes the study of the subfamilies of f with zero entropy that is for δ = 1. These includes the families with bounded (in particular periodic), linear or quadratic growth rate. Two transverse fibrations are found for the families with bounded growth. In the periodic case the period of the families is indicated. It is observed that there exist infinite periodic subfamilies of f, depending on the parameter region. The families with linear growth rate preserve rational fibration and the quadratic growth rate families preserve elliptic fibration that is unique depending on the parameters. In all the cases with zero entropy all the mappings are found up to affine conjugacy. Thirdly, it deals with non-autonomous Lyness type recurrences of the form xn+2 = an + xn+1 xn , where {an}n is a k-periodic sequence of complex numbers with minimal period k. We treat such non-autonomous recurrences via the autonomous dynamical system generated by the birational mapping Fak ◦ Fak−1 ◦ · · · ◦ Fa1 where Fa is defined by Fa(x, y) = (y, a + y x ). For the cases k ∈ {1, 2, 3, 6} the corresponding mappings have a rational first integral. By calculating the dynamical degree we show that for k = 4 and for k = 5 generically the dynamical system is no longer rationally integrable. We also prove that the only values of k for which the corresponding dynamical system is rationally integrable for all the values of the involved parameters, are k ∈ {1, 2, 3, 6}.

El estudio de las life histories es de vital importancia porque proporciona evidencias sobre las condiciones ecológicas, biodiversidad, demografía, vulnerabilidad y otros muchos aspectos de la biología de las especies. La histología ósea es utilizada como herramienta para reconstruir las life histories de vertebrados, analizando el tejido óseo primario o contando el número de marcas de crecimiento (esqueletocronología). Sin embargo, se ha considerado que los endotermos, al contrario que en ectotermos, muestran un crecimiento óseo no cíclico, invalidando la histología ósea para inferir las life histories de mamíferos. El objetivo general de esta tesis es proporcionar las bases de la histología ósea en mamíferos para inferir estrategias de life history. Los objetivos concretos son: i) analizar la fiabilidad de la esqueletocronología ósea en mamíferos, ii) explorar la asociación entre las características del tejido óseo y el ambiente, fisiología, ontogenia y life history y, iii) reconstruir las características de life history en mamíferos fósiles y actuales para obtener datos sobre la evolución de las life histories y biología de la conservación. Se han analizado 274 láminas transversales de hueso de 225 individuos pertenecientes a lirones actuales (Gliridae) y rumiantes actuales y fósiles (Bovidae, Cervidae, Moschidae y Tragulidae). Se han llevado a cabo tanto análisis cualitativos como cuantitativos. Los análisis cualitativos el tejido óseo primario muestran que, en los estadios tempranos de la ontogenia, los rumiantes forman un tejido fibrolamellar (FLC), mientras que los lirones depositan generalmente un tejido parallel fibered bone (PFB). Cuando son adultos, tanto lirones como rumiantes depositan un hueso lamelar denso (External Fundamental System, EFS). Los resultados también muestran que los Lines of Arrested Growth (LAGs) están presentes de forma universal en los mamíferos analizados. Los LAGs están presentes tanto en el tejido de formación rápido (FLC) así como el tejido de formación lento (EFS). El número de líneas de crecimiento en el hueso concuerda con la edad de los animales, proporcionando la evidencia de la periodicidad anual de los LAGs en estos mamíferos. El fémur es el hueso más conservador para aplicar la esqueletocronología ya que registra el mayor número de LAGs. La remodelación y reabsorción ósea puede eliminar o enmascarar los primeros LAGs depositados durante la ontogenia. Esta investigación muestra que el crecimiento óseo se detiene durante el periodo adverso (pocos recursos), acoplado con la variación fisiológica estacional. Estos resultados apoyan que la parada de crecimiento forma parte de una estrategia termometabólica de conservación energética. Además, este trabajo muestra que las características vasculares y celulares del tejido óseo primario sufre una importante variación ontogenética asociada al descenso de la tasa de crecimiento al acercarse la madurez. La densidad vascular y celular decrece mientras que la proporción de canales longitudinales en relación a los circulares incrementa a lo largo de la ontogenia hasta alcanzar la madurez, lo cual podría estar relacionado con la madurez fisiológica. El cambio más significativo durante la ontogenia ocurre durante la transición entre el FLC o PFB a EFS, lo cual está relacionado con la madurez reproductiva. Este trabajo evidencia que esta transición registra el trade-off entre crecimiento y reproducción en rumiantes. De acuerdo con estos hallazgos, la edad de madurez reproductiva puede determinarse contando el número de ciclos de crecimiento antes del EFS. Los resultados comparando las características histológicas cuantitativas entre bóvidos sugiere que los parámetros vasculares y celulares están relacionados con la masa corporal y el metabolismo. De esta forma, el hueso FLC de grandes bóvidos tiende a mostrar más canales circulares (lo cual estaría reflejando mayores tasas de deposición de hueso perióstico) y menores densidades celulares (lo cual estaría reflejando una menor tasa metabólica específica de masa) que los pequeños. / Bone histology is a widely used tool to reconstruct vertebrate life histories, either by analysing primary bone tissue or by counting the number of growth marks (skeletochronology). However, it has long been considered that endotherms, unlike ectotherms, display a continuous or noncyclical bone growth, disabling bone histology for life history inferences in mammals. The general purpose of the research presented in this PhD Thesis is to challenge this statement, contributing to the foundations of mammalian bone histology as a tool for inferences on life history strategies. A sample of 274 bone cross-sections from 225 individuals belonging to extant dormice (Gliridae) and extant and fossil ruminants (Bovidae, Cervidae, Moschidae and Tragulidae) have been analysed under polarized and transmitted light microscopy. The results show that Lines of Arrested Growth (LAGs) are universally present in both mammalian groups analysed in this work. These growth marks are present throughout both, the fast-growing bone tissue deposited during growing period (fibrolamellar bone, FLC or parallel fibered bone, PFB) as well as the slow-growing dense lamellar tissue deposited during the adulthood (External Fundamental System, EFS). The number of rest lines in cortical bones fits well with chronological age of the animals, providing evidence of the annual periodicity of bone growth marks in these mammals. The femur is clearly the most reliable bone for skeletochronology analyses because it records the greatest number of LAGs. Despite this, bone remodelling and resorption can potentially delete or obscure the earliest ontogenetic record, especially in large ruminants. This research further indicates that bone growth is arrested during the energetically challenging period (low resource supply), coupled with physiological seasonal variation. These findings provide support that growth arrest forms part of a thermometabolic strategy for energy conservation. Moreover, this work shows that vascular and cellular features of primary bone tissue undergo strong ontogenetic variation associated with a decrease on growth rate as maturity approaches in mammals. Specifically, vascular and cellular densities decrease whereas the proportion of longitudinal canals in relation to circular ones increases throughout ontogeny until reach maturity, which may be related to physiological maturity. However, the most significant change along ontogeny occurs during the transition between the main primary tissues, from FLC/PFB to EFS, which is related to reproductive maturity. This work provides evidence that this transition reliable records the trade-off between growth and reproduction in ruminants. According to these findings, the age at reproductive maturity can be determined by counting the number of growth cycles within the fast growing tissue before the EFS. The result of comparing histological quantitative features between bovids suggests that vascular and cellular parameters are related to body mass and metabolism rather than to extrinsic factors, such as climate. Accordingly, the FLC bone of larger bovids tends to show more circular canals canals (which may reflect higher rates of periosteal bone deposition) and lower cellular densities (which may reflect lower mass-specific metabolic rate according to Kleiber’s law) than the smaller ones. Finally, the findings on fossil species provide evidence that bone histology is a valuable tool to explore evolutionary trends in mammalian life histories. Moreover, the results of bone histology to get some life history traits in endangered mammals highlight its usefulness on the field of conservation biology. To conclude, the findings of this work provide evidence that, in mammals, bone growth is mainly regulated by endogenous rates and synchronized with seasonal resource availability. The evidence of cyclical bone growth debunks the classical assumption that homeothermic endotherms grow continuously until they attain maturity, providing a clear support to the usefulness of bone histology to reconstruct life history traits in extinct and extant mammals.