Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

No presente trabalho está descrita a análise de experimentos de microarranjos de DNA realizados pelos pesquisadores do Projeto GENOLYPTUS em conjunto com a empresa NimbleGen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), assim como a validação dos resultados gerados por essa análise, com a finalidade de encontrar genes diferencialmente expressos entre folhas e xilema de E. grandis para futuro estudo. O processo de análise dos microarranjos de DNA envolveu a busca por um software com programas estatísticos adequados ao estudo de grande quantidade de dados com mínima probabilidade de erro. A comprovação dos resultados gerados pelo software escolhido foi realizada com o uso da técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa (em tempo real) precedida de transcrição reversa (qRT-PCR). Alguns dos genes mais diferencialmente expressos foram selecionados para esta etapa, juntamente com alguns genes com expressão não tão alta. Os genes mais expressos nas folhas que foram escolhidos codificam para; (i) uma proteína semelhante à metalotioneína do tipo 3 (MT-3); (ii) uma glicolato-oxidase; (iii) uma catalase; (iv) uma fosforribulocinase precursora de cloroplasto (PRK); (v) um fator de transcrição MYB do tipo MYB142 e, (vi) uma proteína tipo “dedo-de-zinco”. Os genes mais expressos no xilema escolhidos foram os que codificam (i e ii) duas proteínas expressas em Arabidopsis thaliana; (iii) uma proteína hipotética expressa em Nicotiana benthamiana; (iv) uma descarboxilase de UDPglicuronato do tipo 2, (v) uma quitinase do tipo ELP; (vi) uma celulosesintase tipo 3; (vii) um fator de transcrição MYB; (viii) uma cafeoil-CoA-3- O-metiltransferase (CCoAOMT) e; (ix) uma proteína rica em prolina híbrida do tipo 2 (HyPRP2). Os resultados das qRT-PCRs demonstraram que o experimento de microarranjo e seus resultados foram consistentes e válidos, embora os primeiros tenham demonstrado valores de expressão freqüentemente mais altos. Acreditamos que tanto a análise dos microarranjos de DNA quanto a equivalência das amostras (duplicatas) biológicas estudadas foram totalmente sustentadas pelos resultados da qRT-PCR, pois foram robustas o suficiente para estimar um grande número de genes simultaneamente e indicar aqueles mais importantes como candidatos para futuras análises. / In the present work it is described the analysis of DNA microarray experiments developed by GENOLYPTUS researchers together with Nimblegen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), as well as the validation of the generated results with the aim to find differentially expressed genes between leaves and xylem tissue of E. grandis for further study. The DNA microarray analysis process comprised the search for software containing statistical programs satisfactory for studying an enormous amount of data with a very low false discovery rate. The confirmation of the generated data by the chosen software was made with the use of quantitative (real-time) reverse-transcription followed by polymerase chain reaction (qRT-PCR). Some of the most differentially expressed genes were selected for this step, along with some genes with average expression. Leaf chosen genes were those that codify (i) a metallothionein-like protein type 3 (MT-3), (ii) a glycolate oxidase, (iii) a catalase, (iv) a precursor phosphoribulokinase (PRK) from chloroplast, (v) a MYB transcription factor (MYB142), and (vi) a CONSTANS-LIKE 16 zincfinger protein. Xylem chosen genes were those codifying (i and ii) two expressed proteins from Arabidopsis thaliana, (iii) a hypothetic protein expressed in Nicotiana benthamiana, (iv) a putative UDP-glucuronate decarboxylase type 2, (v) a chitinase type ELP (ectopic deposition of lignin in pith), (vi) a cellulose synthase type 3, (vii) a MYB transcription factor, (viii) a caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), and (ix) a hybrid proline-rich protein type 2 (HyPRP2). Our qRT-PCR results proved the full consistency and validation of the microarray experiments, although the relative expression ratios of the first were often higher. We believe that our microarray analysis as well as the equivalence of biological samples (duplicates) were fully supported by the qRT-PCR findings since they were robust enough to evaluate a massive number of genes and able to point out important candidate genes.

As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-06-01T14:04:34Z No. of bitstreams: 1 Arão Nogueira de Araújo.pdf: 7553802 bytes, checksum: 0c5e8c2804378d774ba5e08d3125d938 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T14:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arão Nogueira de Araújo.pdf: 7553802 bytes, checksum: 0c5e8c2804378d774ba5e08d3125d938 (MD5) / Contexto: A cognição social é vista como um mediador entre a neurocognição básica e o funcionamento social. Pode ser definida como um conjunto de operações mentais que dá suporte às interações sociais as quais incluem a percepção, a interpretação e a produção de respostas às intenções, disposições e comportamento dos outros. Déficits da percepção emocional e do processamento contextual têm sido amplamente registrados em diversas patologias e associados com o baixo desempenho social e com a redução da qualidade de vida. Todavia, é um desafio desenvolver avaliações que sejam sensíveis às disfunções cognitivas sutis, o que é particularmente importante para esse domínio. Objetivo: Construir um instrumento de medida da cognição social para adultos – o Teste de Percepção Emocional em Contextos Sociais (TPECS) e demonstrar seus parâmetros psicométricos. Metodologia: Um grupo de juízes, composto por dez profissionais experientes, especialistas em suas respectivas áreas de atuação (psicologia clínica, neuropsicologia, psiquiatria e neurologia), realizou a análise do TPECS para validade de conteúdo. Estes profissionais responderam ao TPECS e preencheram um formulário de análise dos componentes do referido instrumento. Depois, o TPECS foi administrado a quinze indivíduos de um grupo piloto que o responderam em duas ocasiões distintas (teste-reteste), com intervalo médio de uma semana, para a avaliação da confiabilidade temporal do instrumento. Uma análise dos itens do TPECS e uma avaliação da consistência interna de suas tarefas foram realizadas com os dados provenientes de todos os grupos avaliados. Resultados: Na validade de conteúdo, os componentes do TPECS obtiveram uma aprovação de 100% pelos juízes com o método de porcentagem de concordância. Na análise empírica dos itens, mediante o índice de facilidade de Davis e a técnica dos 27% superiores e inferiores como um índice de discriminação, a maioria das figuras do TPECS foi classificada como fácil e relativamente discriminativa em quase todas as tarefas. Em geral, as figuras do Livro de Estímulos I foram mais fáceis de identificar e menos discriminativas do desempenho dos sujeitos estudados do que as do Livro de Estímulos II. Discussão: A disposição dos resultados referentes às emoções básicas (Livro de Estímulos I) e complexas (Livro de Estímulos II) no TPECS parece corroborar com a ideia da teoria híbrida da percepção emocional. De acordo com essa teoria, a identificação de expressões emocionais psicologicamente óbvias tende a ser realizada categoricamente e de emoções menos obvias, de maneira mais dimensional. Conclusão: O TPECS parece ter se mostrado um instrumento promissor para a avaliação da cognição social, principalmente, frente aos aspectos de percepção emocional, do processamento contextual e da metacognição. No entanto, outros métodos de validação são recomendados para delimitação dos construtos proponentes, além da aplicação da avaliação da confiabilidade com outras amostras. Ajustes, como a retirada de alguns itens, podem ser necessários para tornar o teste mais homogêneo.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-12T18:21:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Felipe Souza.pdf: 1608692 bytes, checksum: 44bd98a260434ee708f97ad01e7b025c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-12T18:21:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Felipe Souza.pdf: 1608692 bytes, checksum: 44bd98a260434ee708f97ad01e7b025c (MD5) / A região do semiárido é caracterizada pelo seu clima seco, altas temperaturas e baixos índices pluviométricos, apresentando um ambiente de estresse para a vegetação. No entanto, as espécies presentes nesta região apresentam características adaptativas que lhes permitem sobreviver a estas condições, como mamona. Indicada pelo PNPB, a mamona possui um elevado teor de óleo em suas sementes, o qual possui diversas aplicações, dentre elas a produção de Biodiesel. Apesar do grande interesse nesta espécie, ainda há poucos estudos publicados quanto à biologia molecular em sementes relacionadas a estresses abióticos. No presente estudo foi realizado um screening hídrico utilizando PEG 8000 nos potenciais -0,2; -0,4; -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 e -1,4 MPa para verificar a tolerância de suas sementes à seca, em seguida foram conduzidos testes moleculares com RT-qPCR para análise da expressão dos genes DREB, MAPK, Aquaporina, Ciclofilina, CDPK e HDA. Os dados obtidos demonstraram que as sementes da mamona não são tolerantes ao estresse hídrico, durante a sua germinação, sendo afetadas fortemente nos potenciais mais baixos como -0,2 MPa. Os genes MAPK, Ciclofilina, DREB1A e CDPK se mostraram responsivos ao estresse hídrico, o HDA apresentou uma expressão significativa durante a embebição em água por 36 horas, entretanto uma supressão quando primariamente tratado com PEG e reidratado em água. / Salvador

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Nutrição, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:07:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290261.pdf: 1582656 bytes, checksum: 0e1ddf393fed95a15749cc3aee11f437 (MD5) / A erva-mate (Ilex paraguariensis) espécie vegetal usada no preparo de bebidas como o chimarrão, o tererê e o chá mate tostado, possui propriedades antioxidante, hipocolesterolêmica e vasodilatadora, as quais podem ser benéficas na prevenção das doenças cardiovasculares (DCV). A paroxonase-2 (PON2) é uma enzima antioxidante cuja atividade está inversamente associada ao estresse oxidativo celular e pode ser modulada pela alimentação. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar se a erva-mate - verde ou tostada - possui a propriedade de modular a expressão gênica e a atividade da PON2 in vitro, em cultura de macrófagos, e in vivo, em monócitos e macrófagos obtidos após a ingestão das infusões de erva-mate por mulheres saudáveis. No estudo in vitro, células THP-1 foram incubadas com os extratos de erva-mate verde ou tostada ou com os ácidos clorogênico ou caféico, principal constituinte fenólico da erva-mate e metabólito plasmático. O estudo in vivo foi subdividido em agudo e de curta duração (sete dias). No estudo agudo, 20 voluntárias ingeriram 500 mL de infusão de erva-mate verde, tostada ou de água (controle) e amostras de sangue foram coletadas antes e 2 h após as ingestões. No estudo de curta duração, as mesmas 20 participantes consumiram as infusões de erva-mate ou de água, na dose de 330 mL três vezes ao dia, durante 7 dias, e amostras de sangue foram coletadas antes e no final do período, após jejum de 12-14 h. As diferenças foram avaliadas pelo teste t pareado de Student, teste de Wilcoxon e Mann-Whitney, considerando-se p < 0,05 como significativo. De acordo com os resultados obtidos no estudo in vitro, os extratos de erva-mate verde ou tostada (0,8 e 2,4 µg/mL, ou 1 e 3 ?M equiv. Ácido clorogênico/L) aumentaram a expressão gênica da PON2 nos macrófagos THP-1 (p < 0,05), enquanto concentrações maiores de extrato (3, 5 e 10 ?M) aumentaram a atividade. Resultados semelhantes foram encontrados para o ácido clorogênico (1 e 3 ?M), enquanto o ácido caféico aumentou somente a atividade e não a expressão da PON2. No estudo in vivo, a ingestão aguda das infusões de erva-mate verde ou tostada aumentou a expressão gênica e as atividades arilesterase e lactonase da PON2 nos monócitos do sangue periférico (p < 0,05). O consumo de erva-mate verde ou tostada durante sete dias elevou a expressão gênica da PON2 nos monócitos e nos macrófagos derivados de monócitos (p < 0,05) e aumentou de forma não significativa a atividade da PON2. A ingestão de erva-mate verde e tostada, de forma aguda ou por 7 dias, aumentou a atividade da PON1 no plasma (p < 0,05). Em geral, não houve diferença entre os dois tipos de erva-mate estudados. Com base nos resultados do presente estudo, podemos sugerir que a erva-mate verde ou tostada modulou positivamente a expressão gênica e a atividade da enzima PON2 em monócitos e macrófagos, indicando, assim, possível proteção contra o estresse oxidativo celular.

SILVA, Anderson Weiny Barbalho. Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos. 2016. 202 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:32:25Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Previous issue date: 2016 / The aims of this study were: 1) to investigate the expression and distribution of messengers RNAs and proteins of TNF-α and interleukin 1 systems members in the ovaries of cyclic cows; 2) to evaluate the effects of TNF-α, Dexamethasone and IL-1β, on the survival and activation of bovine primordial follicles in vitro; 3) to characterize the expression profile of TNF-α and IL-1β systems in bovine granulosa cells of preovulatory follicles during ovulation induced by GnRH/LH in vivo; 4) to evaluate the influence of gonadotropins (FSH/LH) in the expression of mRNA for TNF-α system and IL-1β system in cumulus cells cultured in vitro; and 5) to analyze the effect of TNF-α and IL-1β on cumulus cells expansion, ultrastructure integrity of cultured COCs; mRNA expression of HAS-2, CASP3, CASP6 and iNOS of cumulus cells after in vitro culture. Bovine ovaries were processed for immunohistochemistry and Western Blot analyzes for the location of proteins for TNF-α system and interleukin system 1 in preantral and antral follicles. To evaluate the in vitro follicular survival and activation, ovarian tissues were cultured for 6 days in the presence of IL-1β, TNF-α or Dexamethasone at different concentrations. To evaluate the profile of expression of TNF-α and IL-β systems after GnRH treatments in vivo, granulosa cells from bovine preovulatory follicles were collected at different time points. COCs were cultured for 12 and 24h in the presence of gonadotropins, TNF-α and IL-1β. TNF-α system (TNF-α, TNFR1 and TNFR2) and interleukin I system (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in preantral and antral follicles by immunohistochemistry. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system members were observed at different stages of development. Concerning to in vitro culture of bovine ovarian tissue, the presence of TNF-α (10 ng/mL) reduced the follicular survival and increased the number of apoptotic cells, whereas the addition of dexamethasone (10 ng/mL) maintained the follicular ultrastructure. On the other hand, the presence of IL-1β (10 or 50 ng/mL) was able to maintain the percentage of normal follicles and promote the primordial follicles activation. In vivo, an increased expression of mRNA for TNF-α and TNFR1 was observed 12 h after GnRH treatment. Higher levels of mRNA for TNFR2 were observed at 3, 6 and 12 h after GnRH administration. However, it was seen an increase in mRNA levels for IL-1RA 24h after GnRH induction. In vitro, TNF-α and IL-1β did not shown additive effect of cumulus cells expansion. The levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and TNFR2 were increased in COCs cultured for 12 h in the presence of gonadotropins. The presence of gonadotropins increased the mRNA levels for IL-1R1 and IL-1RA in cumulus cells after 24h of culture. The presence of TNF-α reduced levels of HAS-2, CASP3 and CASP6, whereas IL-1β increased levels of mRNA for IL-β, IL-1RA and HAS-2 in cultured cumulus cells. Furthermore, IL-1β increased iNOS expression after 24h of culture. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of COCs cultured in presence of TNF-α or IL-1β. In conclusion, TNF-α system members and interleukin-1 system members are differentially expressed in ovarian cells. TNF-α reduces the follicular survival in vitro, while dexamethasone enhances the ultrastructure of cultured follicles. On the other hand, IL-1β promotes the development of primordial follicles in vitro. The expression of TNF-α system and the IL-1 system is regulated by gonadotropins in vivo and in vitro. The presence of TNF-α and IL-1β maintain the normal ultrastructure of cultured COCs. These results indicate an important role of TNF-α and interleukin 1 systems in the regulation of bovine folliculogenesis and ovulation. / Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar a expressão e a distribuição de RNAs mensageiros e proteínas dos sistemas TNF-α e interleucina 1 em ovários de vacas cíclicas, 2) avaliar os efeitos do TNF-α, Dexametasona e da IL-1β, na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in situ; 3) caracterizar o perfil de expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1β em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos, durante a ovulação induzida por GnRH/LH in vivo; 4) avaliar a influência das gonadotrofinas (FSH/LH) na expressão de RNAm para o sistema TNF-α e sistema IL-1β em células do cumulus cultivadas in vitro; e 5) analisar o efeito do TNF-α e da IL-1β na expansão de células do cumulus, na manutenção da integridade ultraestrutural de CCOs; na expressão de RNAm para HAS-2, CASP3, CASP6 e iNOS em células do cumulus após cultivo in vitro. Ovários bovinos foram processados para análises de imunohistoquímica e Western Blot para a localização das proteínas para o sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 em folículos pré-antrais e antrais. Para avaliação da sobrevivência e ativação folicular in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados por 6 dias na presença de IL-1β, TNF-α ou Dexametasona em diferentes concentrações. Células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos foram coletadas em diferentes momentos após a administração intramuscular de GnRH para avaliação do perfil de expressão dos sistemas TNF-α e IL-β in vivo. CCOs foram cultivados in vitro por 12 e 24 h na presença de gonadotrofinas, TNF-α e IL-1β. Os resultados da imunohistoquímica mostraram que as proteínas para os membros do sistema TNF-α (TNF-α, TNFR1 e TNFR2) e do sistema interleucina I (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em folículos pré-antrais e antrais. Foram observados níveis variáveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. Em relação ao cultivo in vitro de fragmentos ovarianos, a presença de TNF-α (10 ng/mL) reduziu a sobrevivência folicular e aumentou o número de células apoptóticas, enquanto que a adição de Dexametasona (10 ng/mL) ao meio de cultivo manteve a ultraestrutura folicular. Por outro lado, a presença de IL-1β (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folículos normais e de promover a ativação dos folículos primordiais. In vivo, um aumento na expressão de RNAm para TNF-α e TNFR1 foi observado 12 h após tratamento com GnRH. Níveis mais elevados de RNAm para TNFR2 foram observados em 3, 6 e 12 h após administração de GnRH. No entanto, foi observado um aumento nos níveis de RNAm para IL-1RA após 24h da indução por GnRH. In vitro, o TNF-α e a IL-1β não apresentaram efeito aditivo à expansão das células do cumulus. Os níveis de RNAm para TNF-α, TNFR1 e TNFR2 foram aumentados em CCOs cultivados por 12 h na presença de gonadotrofinas. A presença de gonadotrofinas aumentou os níveis de RNAm para IL-1R1 e IL-1RA em células do cumulus após cultivo por 24h. O TNF-α reduziu os níveis de RNAm para HAS-2, CASP3 e CASP6, enquanto que a IL-1β elevou os níveis de expressão de IL-β, IL-1RA e HAS-2 em células do cumulus cultivadas. Além disso, a IL-1β aumentou a expressão de iNOS após 24h de cultivo. A análise ultraestrutural confirmou a integridade dos CCOs cultivados na presença de TNF-α ou IL-1β. Em conclusão, os componentes do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 são expressos diferencialmente em células ovarianas. O TNF-α reduz a sobrevivência folicular in vitro, enquanto a Dexametasona mantém a ultraestrutura de folículos cultivados. Por outro lado, a IL-1β promove o desenvolvimento de folículos primordiais in vitro. A expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1 é regulada por gonadotrofinas in vivo e in vitro. A presença de TNF-α e IL-1β mantém a ultraestrutura normal de CCOs cultivados. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 na regulação da foliculogênese e ovulação em bovinos.

GADELHA, Cibelle Gomes. Aclimatação à salinidade induzida por nitroprussiato de sódio na germinação e no desenvolvimento inicial de plântulas de pinhão-manso. 2015. 124 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, 2015 / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2016-09-12T12:12:10Z No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-27T17:17:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T17:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) Previous issue date: 2015 / The jatropha (Jatropha curcas L.) is an oilseed species, belonging to the family Euphorbiaceae, considered a good alternative to agricultural arid and semi-arid regions, such as the Brazilian Northeast. The soil salinization is a common problem in these regions, reducing the productivity of several crops, by negatively affect the growth and plant development. Therefore, it becomes important to carry out studies on the development of this species in salt stress conditions, as well as the assessment of the effects of nitric oxide (NO) in the induction of acclimation to salinity. This study evaluated the effects of pre-treatment of seeds with sodium nitroprusside (SNP), a compound that spontaneously releases NO in solution on germination and early development of jatropha seedlings in salt stress conditions. The concentration of NPS was set in a first experiment, in which jatropha seeds were germinated in germitest moistened sheets of paper with distilled water (pretreatment with water) or with NPS solutions of 50, 75, 100 and 200 M for a period of 24 hours (pre-treatment with SNP). Subsequently, the seeds were transferred to moistened sheets germitest with distilled water (control conditions) or 100 mM NaCl (saline treatment). After eight days after the pre-treatment (DAPT), the pretreated seedlings with NPS to 75 uM showed the best performance in saline conditions, mainly due to significant reductions in levels of Na + and lipid peroxidation, and the improvements in mobilization of reserves and growth. Based on this, we performed a second experiment, which aimed to confirm the observed results and expand the studies of pretreatment on physiology, biochemistry and molecular biology of jatropha plants under salt stress. Pretreatment of seeds with NPS to 75 uM resulted in better germination and mobilization of reserves, as well as further growth of seedlings in saline conditions, compared to non-pretreated. Furthermore, the pretreatment was a decrease in the accumulation of Na + and Cl- ions in saline stress conditions. Oxidative damage in the endosperm and embryo axis of jatropha seedlings were attenuated by pretreatment with NPS. This was due, at least in part, to induction of antioxidant system, both enzymatic, nonenzymatic as under conditions of salt stress, as well as the reduction in H2O2 concentration under these conditions. The analysis of gene expression of CAT and GR was consistent with the increase in activity of these enzymes, promoted by pretreatment with NPS under saline conditions. Based on these results, it is concluded that pretreatment with NPS was efficient in inducing acclimatization of jatropha seedlings to salt stress, mainly for allowing a better ionic and redox homeostasis. / O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma espécie oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, considerada uma boa alternativa agrícola para regiões áridas e semiáridas, como o Nordeste brasileiro. A salinização dos solos é um problema bastante comum nessas regiões, diminuindo a produtividade de diversas culturas agrícolas, por afetar negativamente o crescimento e o desenvolvimento vegetal. Portanto, torna-se relevante a realização de estudos acerca do desenvolvimento dessa espécie em condições de estresse salino, bem como a avaliação dos efeitos do óxido nítrico (NO) na indução da aclimatação à salinidade. Objetivou-se com esse trabalho avaliar os efeitos do pré-tratamento de sementes com nitroprussiato de sódio (NPS), um composto que libera espontaneamente NO em solução, sobre a germinação e o desenvolvimento inicial de plântulas de pinhão-manso em condições de estresse salino. A concentração de NPS foi definida em um primeiro experimento, no qual sementes de pinhão-manso foram germinadas em folhas de papel germitest umedecidas com água destilada (pré-tratamento com água) ou com soluções de NPS a 50, 75, 100 e 200 μM, por um período de 24 h (pré-tratamento com NPS). Posteriormente, as sementes foram transferidas para folhas de papel germitest umedecidas com água destilada (condição controle) ou com NaCl a 100 mM (tratamento salino). Decorridos oito dias após o pré-tratamento (DAPT), as plântulas pré-tratadas com NPS a 75 μM foram as que apresentaram melhor desempenho em condições salinas, principalmente devido às reduções significativas nos teores de Na+ e na peroxidação lipídica, e pelas melhoras na mobilização de reservas e do crescimento. Com base nisso, foi realizado um segundo experimento, visando-se ampliar os estudos desse pré-tratamento na fisiologia e na bioquímica das plântulas de pinhão-manso sob condições de estresse salino. O pré-tratamento das sementes com NPS a 75 μM resultou em uma melhor germinação e mobilização de reservas, bem como em um maior crescimento das plântulas em condições salinas, em comparação às não pré-tratadas. Além disso, o pré-tratamento promoveu uma redução no acúmulo dos íons Na+ e Cl-, em condições de estresse salino. Os danos oxidativos no endosperma e no eixo embrionário das plântulas de pinhão-manso foram atenuados pelo pré-tratamento com NPS. Isso se deveu, pelo menos em parte, à indução do sistema antioxidativo, enzimático ou não enzimático, sob condições de estresse salino, bem como pela redução dos teores de H2O2, sob tais condições. A análise da expressão gênica da catalase e da redutase da glutationa foi concordante com o aumento em atividade dessas enzimas, promovido pelo pré-tratamento com NPS sob condições de salinidade. Baseado nos resultados obtidos, conclui-se que o pré-tratamento com NPS foi eficiente na indução da aclimatação das plântulas de pinhão-manso ao estresse salino, principalmente por propiciar uma melhor homeostase iônica e redox.

SILVA, Mariana Baraldi. Estudo sobre a reprodução de ovinos da raça somalis brasileira: histomorfometria epididimária, expressão gênica e proteica no aparelho reprodutor. 2013. 119 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-04T22:45:42Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) Previous issue date: 2013 / The Somalis Brasileira breed is one of the most rustic sheep of the Northeast, being very adapted to the semi-arid and extensive breeding systems, based on native pasture. Therefore, this breed, as well as the others described, represent unique and extremely important genotypes to guarantee the variability of herds in production systems, formation of new breeds or crosses with exotic animals. Despite the aptitude and differentiated adaptability of the Brazilian Somalis sheep, few works are found in the literature on these animals. Therefore, the present study was conducted with the purpose of evaluating aspects of the epididymis, gene expression and proteomics of tissues of the reproductive apparatus of sheep of this breed. Animals with 150 days of age were slaughtered (according to norms of the Ministry of Agriculture) and organs collected for analysis of RNA extraction in testis, epididymis, vesicular and bulb-urethral glands, and epididymal histomorphometry. Expression of the genes was assessed by RT-PCR, using the GAPDH gene as a reference. Protein was also extracted from epididymal tissue samples for identification by mass spectrometry (ESI-Q-ToF). Data thus obtained were analyzed with the protein annotation application (STRAP) and the potential interactions of specific proteins, with the application STRING 9.05. The expression of clusterin was detected in all tissues analyzed, but the head (Ep2) and body (Ep5) regions of the epididymis presented the highest expressions (p <0.05). The expression of mRNA for osteopontin was localized in all tissues tested, but the expression in the seminal vesicles was higher than in the other organs (p <0.05). Levels of mRNA for osteopontin did not differ in the regions of the epididymis, testis and bulb-urethral glands (p> 0.05). Expression of prostaglandin D-synthetase (PGDS) mRNA was detected in the testes and all segments of the epididymis, with no differences between them (p> 0.05). However, it was not possible to detect expression levels of this gene in the accessory sex glands. The results obtained in the histological analysis of the 8 epididymal segments in Brazilian Somali sheep showed the presence of several cell types in the epithelium, such as main, apical, basal and halo cells. The main, basal and halo cells were observed in all segments of the epididymis and apical cells were not observed in the tail of the epididymis. The volumetric proportion of the regions showed a higher percentage of epithelium in the proximal head, distal head and body (Ep6), and the lower count was shown in the body (Ep5). The connective tissue count was higher in the same segment (Ep5) and without significant differences along the epididymal segments in general. The lamina propria count showed few alterations in the regions of the epididymis and the lumen without spermatozoa was visibly larger in the proximal head, whereas in the region of the head and body of the epididymis there was a large percentage of lumen with spermatozoa. / A raça Somalis Brasileira é uma das mais rústicas dentre os ovinos deslanados do Nordeste, sendo bastante adaptada ao semiárido e sistemas de criação extensivos, com base em pastagem nativa. Portanto, esta raça, assim como as demais deslanadas, representam genótipos únicos e de suma importância para a garantia da variabilidade dos rebanhos dos sistemas de produção, formação de novas raças ou cruzamentos com animais exóticos. Apesar das aptidões e diferenciada capacidade de adaptação dos carneiros Somalis Brasileira, poucos são os trabalhos encontrados na literatura sobre estes animais. Portanto, o presente estudo foi conduzido com a finalidade de avaliar aspectos do epidídimo, expressão gênica e proteômica de tecidos do aparelho reprodutivo de carneiros desta raça. Animais com 150 dias de idade foram abatidos (conforme normas do Ministério da Agricultura) e órgãos coletados para análise de extração de RNA, em testículo, epidídimo, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais, e histomorfometria epididmária. A expressão dos genes foi avaliada através de RT-PCR, utilizando-se o gen da GAPDH como referência. Procedeu-se também à extração de proteínas das amostras de tecido epididimário para identificação através de espectrometria de massa (ESI-Q-ToF). Dados assim obtidos foram analisados com o aplicativo para anotações de proteínas (STRAP) e as potenciais interações de específicas proteínas, com o aplicativo STRING 9.05. A expressão de clusterina foi detectada em todos os tecidos analisados, mas a região da cabeça (Ep2) e corpo (Ep5) do epidídimo apresentaram as maiores expressões (p < 0,05). A expressão de mRNA para osteopontina foi localizada em todos os tecidos testados porém, a expressão nas vesículas seminais foi maior do que nos demais órgãos (p < 0,05). Níveis de mRNA para osteopontina não diferiram nas regiões do epidídimo, testículo e glândulas bulbo-uretrais (p > 0,05). A expressão de mRNA para a prostaglandina D-sintetase (PGDS) foi detectada nos testículos e todos os segmentos do epidídimo, não apresentando diferenças entre eles (p > 0,05). No entanto, não foi possível detectar níveis de expressão deste gen nas glândulas sexuais acessórias.

FARIAS, I. R. Analise da expressão dos genes de reparo da lesão de fita dupla do DNA de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. 2017. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-09-11T14:16:57Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / The need to increase the demand for food produced brought with it an incorporation of technical-scientific development in agriculture and became a justification for the use of some chemicals in order to obtain a higher production through the manipulation of organic factors. The damage caused by high levels of toxicity of pesticides in a greater number of cases of cancers in farmers, making studies of the mechanisms of action involved and the damages that can cause human health of extreme relevance. In order to maintain a genomic integrity and its human stability around 150 genes involved in our DNA repair mechanisms. These errors when a DNA tape (DSBs) can be corrected by two types of mechanism, a Homologous Recombination (HR) and a Joint of Non-Homologous Extremities (NHEJ). Problems in DNA tape repair mechanisms in response to various types of damage caused by exposure to agrochemicals by farmers may trigger the accumulation of genetic genes and / or a deregulation of cell growth, leading to genomic instability and neoplastic development. The aim of the present study was to analyze genetic genetics by genetic cytogenetics by gene expression using the real-time PCR technique using ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 and LIG4 genes, belonging to the double-stranded DNA repair mechanism. This analysis was based on 90 cases of rural workers exposed to pesticides in the region of the Chapada do Apodi, in Limoeiro do Norte, and 10 samples from healthy individuals as control. With this study, it was possible to identify the ATM, LIG4 and XRCC5 genes presented the level of expression significant for a time variable of exposure to agrochemicals and for a variable groups of farmers, the genes LIG4, XRCC5 and XRCC6 presented the level of expression Para as variables Smoke and alcohol levels; expression levels of the XRCC5 and XRCC6 genes were still significant for a variable use of EPIs; the BRCA2 gene presented significance of expression for a variable karyotype; finally, gene XRCC6 a variable type of contact with pesticide. These results support the importance of ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes in the maintenance of genomic stability, promoting a better understanding of the cellular mechanisms influenced by exposure to pesticides. / A necessidade do aumento na demanda de alimentos produzidos trouxe consigo a incorporação do desenvolvimento técnico-científico à agricultura e passou a ser justificativa para a utilização de alguns produtos químicos com o objetivo de obter uma maior produção por meio da manipulação de fatores orgânicos. Os danos que são acarretados devido aos níveis elevados de toxicidade dos agrotóxicos vem sendo uma das maiores causas de cânceres em agricultores, tornando-se de extrema relevância os estudos nos mecanismos de ação envolvidos e os danos que podem vir a causar à saúde humana. Afim de manter a integridade genômica e sua estabilidade os seres humanos possuem em torno de 150 genes envolvidos diretamente nos mecanismos de reparo de DNA. Estes danos quando acometem a dupla fita de DNA (DSBs) podem ser corrigidos por dois tipos de mecanismo, a Recombinação Homóloga (HR) e a Junção de Extremidades Não Homólogas (NHEJ). Problemas nos mecanismos de reparo de dupla fita de DNA como resposta a diversos tipos de danos acarretados pela exposição a agrotóxicos por agricultores pode desencadear o acúmulo de alterações genéticas e/ou a desregulação do crescimento celular, levando à instabilidade genômica e desenvolvimento neoplásico. Portanto, o presente estudo tem por objetivo analisar as alterações genéticas, por citogenética clássica por bandeamento G, e a expressão genica, por meio da técnica de PCR em tempo real, dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 e LIG4, pertencentes ao mecanismo de reparo de fita dupla do DNA. Essa análise baseou-se em 90 casos de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos da região da Chapada do Apodi, em Limoeiro do Norte, e 10 amostras de indivíduos saudáveis como controle. Com esse estudo, foi possível identificar que: os genes ATM, LIG4 e XRCC5 apresentaram o nível de expressão significativo para a variável tempo de exposição aos agrotóxicos e para a variável grupos de agricultores, os genes LIG4, XRCC5 e XRCC6 apresentaram o nível de expressão significativa para as variáveis fumo e álcool; os níveis de expressão dos genes XRCC5 e XRCC6 foram ainda significativos para a variável uso de EPIs; o gene BRCA2 apresentou significância de expressão para a variável cariótipo, por fim, o gene XRCC6 apresentou nível de expressão significativo para a variável tipo de contato com agrotóxico. Estes resultados suportam a importância dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 e LIG4 na manutenção da estabilidade genômica promovendo um melhor entendimento dos mecanismos celulares influenciados pela exposição a agrotóxicos.