<p>Urine-based biomarkers offer numerous advantages for clinical analysis, including non-invasive collection, a suitable sample source for longitudinal disease monitoring, a better screenshot of disease heterogeneity, higher sample volumes, faster processing times, and lower rejection rates and costs. They will be extremely useful in a clinical trial context, which can be applied alone or in combination with other methods as long as they demonstrate clear reproducibility across cohorts. While biofluids such as urine present enormous challenges with a wide dynamic range and extreme complex typically dominated by a few highly abundant proteins, we have demonstrated that the analytical issue can be efficiently addressed by focusing on extracellular vesicles (EVs), tiny packages released by all kinds of cells. These tiny packages contain different kinds of molecules from inside the cells. Here, we established a robust EV isolation and characterization platform to screen and validate Parkinson’s Disease (PD) and Renal Cell Carcinoma (RCC) biomarkers from urine. PD is a progressive neurological disorder affecting body movement because some brain cells stop producing dopamine. PD is often not diagnosed until it has advanced, making early detection crucial. We investigated urinary EVs from 138 individuals to enable early detection and found several proteins involved in PD development that could be biological indicators for early disease detection. Several biochemical techniques were applied to verify our findings. In the second project, we attempted to develop a novel diagnostic technique for early intervention of RCC. Here, we made our efforts to develop a quantitative method based on data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry to analyze urinary EV phosphoproteomics for non-invasive RCC biomarker screening. Combined with our in-house EVtrap method for EV isolation and PolyMAC enrichment of phosphopeptides, we quantified 2,584 unique phosphosites. We observed unique upregulated phosphosites and pathways differentiating healthy control (HC), chronic kidney disease (CKD), low-grade, and high-grade clear cell RCC. These applications have a significant promise for early PD and RCC diagnosis and monitoring based on actual functional proteins with urine as the source. These studies might provide a viable path to developing urinary EV-based disease diagnosis.</p>

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L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche formée de cellules hautement spécialisées et uniques dont les nombreuses fonctions servent à maintenir une vision adéquate. En revanche, ces fonctions spécifiques rendent les cellules de l’EPR particulièrement vulnérables au stress oxydant. Avec le vieillissement, les cellules de l’EPR peuvent dégénérer et devenir non-fonctionnelles, donnant lieu à plusieurs maladies telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Dans les pays occidentaux, la DMLA est la principale cause de cécité et de déficience visuelle chez les personnes âgées. En fait, environ 90 % des patients atteints de la DMLA souffrent de la forme sèche, pour laquelle il n'existe aucun traitement. Des années de recherche ont établi que le stress oxydant est un contributeur majeur à la pathogenèse de la DMLA sèche. De nombreuses études ont montré que le stress oxydant induit les cellules de l’EPR à libérer des vésicules extracellulaires (VEs). Nos propres travaux ont démontré que les VEs peuvent induire le stress oxydant et la sénescence chez les cellules de l’EPR. Comme d'autres, nous avons constaté que les VEs étaient enrichis en microARNs. Grâce au séquençage d’ARN, nous avons identifié le let-7f comme étant l'un des microARNs les plus abondants contenus dans ces vésicules. L'objectif de ce mémoire a été l’exploration entre la relation let-7f et la dégénérescence des cellules de l’EPR. Nos résultats ont démontré une régulation et une augmentation de l’expression du let-7f dans les cellules de l’EPR sous stress oxydant, in vitro et in vivo. De plus, la surexpression du let-7f a généré un stress oxydant, le dysfonctionnement et la sénescence des cellules humaines de l’EPR (ARPE-19). De plus, l’inhibition du let-7f à protéger ces cellules contre les conséquences néfastes induites par l’iodate de sodium. En somme, les résultats de ce travail suggèrent fortement que le let-7f est impliqué dans la dégénérescence des cellules de l’EPR et pourraient aider à la découverte de nouveaux processus pertinents dans la pathogenèse de la DMLA sèche. / The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly specialized and unique monolayer of cells whose many functions are vital for maintaining proper vision. In turn, these specific functions render RPE cells particularly vulnerable to oxidative injury. With age, RPE cells can degenerate and become dysfunctional, giving rise to various disorders such as age-related macular degeneration (AMD). In western countries, AMD is the primary cause of blindness and visual impairments in the elderly. In fact, approximately 90% of all AMD patients suffer from the dry form of the disease, for which there exist no approved treatment. Decades of research have established that chronic oxidative stress is a major contributor to the pathogenesis of dry AMD. Numerous studies have shown that oxidative stress induces RPE cells to release extracellular vesicles (EVs) which participate in cell-to-cell communication. Our recent work has demonstrated that EVs alone were sufficient in inducing oxidative stress and senescence in RPE cells. Consistent with others, we found that EVs released by RPE cells were enriched in microRNAs. RNA-sequencing identified let-7f as one of the most abundant miRNAs contained in these vesicles. Despite being one of the first miRNAs to be discovered, the role of let-7f in RPE cells has remained essentially unexplored. The aim of this dissertation was to investigate the relationship between let-7f and RPE cells in regards to their degeneration and dysfunction. Our results revealed that the expression of let-7f increased and was regulated by oxidative stress in RPE cells, in vitro and in vivo. In addition, let-7f overexpression promoted oxidative stress, cellular dysfunction and senescence in human RPE (ARPE-19) cells. Finally, inhibition of let-7f exhibited protective effects against sodium iodate-induced oxidative injury. Overall, the findings in this work provide strong evidence that let-7f is implicated in the degeneration of RPE cells and further mechanistic investigation may help to uncover novel insights into the genesis of dry AMD.

Bien que l’évolution de la résistance aux médicaments soit l'un des plus grands défis dans la lutte contre les maladies infectieuses, beaucoup de phénomènes restent inexpliqués. Dans le cas de la leishmaniose, la résistance est un problème majeur depuis plusieurs années. Cette maladie zoonotique négligée est causée par le parasite protozoaire Leishmania, transmis par des phlébotomes lors du repas sanguin. Chez l’humain, elle se décline en trois formes principales : viscérale, cutanée et muco-cutanée. La leishmaniose peut aussi se développer chez les chiens infectés, qui constituent un réservoir majeur de transmission. Sans vaccin efficace, le contrôle de la maladie repose principalement sur la chimiothérapie, mais peu de molécules homologuées sont disponibles. En outre, les mêmes produits sont utilisés chez les chiens et les humains, ce qui favorise l'émergence et la propagation de souches résistantes aux médicaments. Leishmania est en effet connu pour détenir d’incroyables particularités génomiques (telles que la formation d’amplicons circulaires contenant des gènes de résistance) qui lui permettent de survivre dans des conditions de stress, telles que la pression médicamenteuse. Par ailleurs, Leishmania est un eucaryote qui a conservé la capacité de produire des vésicules extracellulaires (EVs) au cours de l’évolution. Ces particules de taille nanométrique sont produites naturellement par la majorité des cellules biologiques et ont un contenu riche en protéines, lipides et acides nucléiques. Bien que des caractéristiques clés des EVs du protozoaire aient été découvertes, aucune étude n’a encore été réalisée sur les EVs de souches résistantes. Ainsi, cet aspect constitue le cœur de mon projet de recherche de doctorat : l’étude des EVs de Leishmania et leur rôle dans le phénomène de la résistance aux médicaments. Nos travaux sont les premiers à démontrer que les mécanismes de résistance aux médicaments peuvent induire des changements dans la morphologie, la taille et la distribution des EVs de Leishmania. Nous avons identifié le protéome de base des EVs du parasite et nous avons mis en évidence des protéines enrichies dans les EVs libérées par des parasites résistants à l'antimoine, à la miltéfosine et à l'amphotéricine B. Nous avons également étudié le contenu en ADN des EVs de parasites résistants et confirmé l'enrichissement des amplicons porteurs de gènes de résistance aux médicaments, associés aux EVs. En complément, nos tests de transferts d’EVs ont prouvé que ces vésicules permettent le transfert horizontal de gènes de résistance : un mécanisme alternatif de résistance aux médicaments. Finalement, nous avons montré que les EVs des parasites résistants améliorent la croissance des promastigotes et réduisent l'accumulation de ROS, ce qui favorise la survie et la propagation des populations résistantes aux médicaments. En conclusion, ces découvertes permettront le développement de nouveaux tests diagnostiques et de nouvelles approches thérapeutiques pour certaines maladies infectieuses zoonotiques, basés sur les profils des EVs. De plus, elles ont une importance majeure dans la compréhension de la résistance médicamenteuse et prouve que les EVs fonctionnent comme des médiateurs efficaces dans le transfert horizontal de gène. Ce nouveau mécanisme facilite ainsi la transmission des gènes de résistance aux médicaments entre les parasites et favorise leur survie lorsqu'ils sont confrontés à des environnements stressants. / Although the evolution of drug resistance is one of the greatest challenges in the fight against infectious diseases, many phenomena remain unexplained. In the case of leishmaniasis, resistance has been a major problem for several years. This neglected zoonotic disease is caused by the protozoan parasite Leishmania, transmitted by sandflies during the blood meal. In humans, it comes in three main forms: visceral, cutaneous, and mucocutaneous. Leishmaniasis can also develop in infected dogs, which constitute a major reservoir of transmission. Without an effective vaccine, the control of the disease relies mainly on chemotherapy, but few approved molecules are available. Furthermore, the same products are used in dogs and humans, which promotes the emergence and spread of drug-resistant strains. Leishmania is indeed known to possess incredible genomic peculiarities (such as the formation of circular amplicons containing resistance genes) which allow it to survive under stressful conditions, such as drug pressure. Furthermore, Leishmania is a eukaryote that has retained the ability to produce extracellular vesicles (EVs) during evolution. These nano-sized particles are produced naturally by most biological cells and have a rich content of proteins, lipids, and nucleic acids. Although key characteristics of the protozoan EVs have been discovered, no studies have yet been performed on the EVs of resistant strains. Thus, this aspect constitutes the heart of my doctoral research project: the study of Leishmania EVs and their role in the phenomenon of drug resistance. Our work is the first to demonstrate that drug resistance mechanisms can induce changes in the morphology, size, and distribution of Leishmania EVs. We have identified the basic proteome of parasite EVs, and we have demonstrated enriched proteins in EVs released by parasites resistant to antimony, miltefosine and amphotericin B. We also studied the DNA content of EVs from resistant parasites and confirmed the enrichment of amplicons carrying drug resistance genes associated with EVs. In addition, our EV transfer tests have proven that these vesicles allow the horizontal transfer of resistance genes: an alternative mechanism of drug resistance. Finally, we showed that EVs from resistant parasites enhance promastigote growth and reduce ROS accumulation, which promotes the survival and spread of drug-resistant populations. In conclusion, these discoveries will allow the development of new diagnostic tests and new therapeutic approaches for certain zoonotic infectious diseases, based on the profiles of EVs. Moreover, these findings are of major importance in the understanding of drug resistance and prove that EVs function as effective mediators in horizontal gene transfer. This new mechanism thus facilitates the transmission of drug resistance genes between parasites and promotes their survival when confronted with stressful environments.

[ES] Las intervenciones actuales utilizadas en el ámbito clínico durante el infarto agudo de miocardio (IAM) se centran en la revascularización de la zona isquémica. Entre dichas estrategias, la angioplastia coronaria, procedimiento por el cual se utiliza un catéter para desobstruir la arteria ocluida, es el método más utilizado. Sin embargo, se ha descrito este proceso (conocido como reperfusión) desencadena un daño adicional en el miocardio, por lo que la combinación de dicha intervención con moléculas cardioprotectoras resulta de gran interés para tratar de reducir el tamaño del infarto. El presente trabajo propone dos nuevas moléculas con el fin de precondicionar el área isquémica antes de la reperfusión en el contexto del IAM. La primera estrategia propuesta se ha basado en el aporte de un ácido graso (diDHA) en la zona isquémica antes de la reperfusión para tratar de reducir el estrés de los cardiomiocitos y el número de células muertas antes de la reperfusión. Además, se han sintetizado nanoconjugados basados en la unión covalente de diDHA a un unido covalentemente a un esqueleto polimérico (ácido poli-L-glutámico, PGA) con el fin de incrementar la estabilidad del diDHA y conseguir una liberación controlada de la molécula. Los resultados obtenidos mostraron que la formulación PGA-diDHA6.4 fue la más optimizada, mostrando un mejor efecto en el precondicionamiento de los cardiomiocitos antes de la reperfusión en términos de reducción de apoptosis, generación de especies reactivas de oxígeno y mantenimiento de la función mitocondrial in vitro. Además, dicho nanoconjugado también mostró un modesto efecto terapéutico cuando se administró en modelos in vivo de isquemia-reperfusión en ratas y cerdos, reduciendo el tamaño final de infarto respecto a los grupos control. La segunda estrategia terapéutica propuesta se ha centrado en aumentar el potencial terapéutico de las vesículas celulares de pequeño tamaño (SEV o exosomas) procedentes de medio condicionado de células madre estromales (MSC). Numerosos estudios han descrito el papel terapéutico de factores paracrinos secretados por las MSC, donde se incluyen tanto factores solubles como vesículas extracelulares (EV) y, en especial, SEV. Diversas estrategias, como la modificación genética o precondicionamiento de estas células, han sido utilizadas para aumentar el potencial terapéutico de las mismas. En este trabajo se ha propuesto la modificación genética de las MSC con el objetivo de enriquecer las SEV en proteínas de interés que pudiesen potenciar el efecto terapéutico de las SEV nativas. En base a estudios previos, donde se ha visto que la oncostatina-M (OSM) podría jugar un papel anti-fibrótico en el contexto del IAM, se decidió incorporar dicha proteína en la superficie de las SEV derivadas de MSC mediante su fusión con proteínas presentes de forma natural en la superficie de las SEV, con el objetivo de desencadenar una respuesta en las células diana. La modificación de la secuencia de la OSM y su fusión con la tetraspanina CD81 permitieron cargar de manera efectiva la OSM en la superficie de las SEV, y los resultados preliminares en fibroblastos ventriculares cardíacos mostraron un efecto funcional beneficioso con respecto a los SEV control y los enriquecidos en CD81, reduciendo la tasa de proliferación de las células en condiciones de ayuno, y modificando la expresión y la liberación de la proteína telo-Col1α1 en las células después de ser estimuladas con TGFβ-1, α-dextrano y ácido ascórbico-L-sulfato En resumen, dos nuevas estrategias terapéuticas avanzadas libres de células han sido propuestas en el presente trabajo, donde se han mostrado resultados preliminares prometedores para reducir el daño en el miocardio tras el IAM en términos de reducción de apoptosis de cardiomiocitos y de activación de fibroblastos car / [CA] Les intervencions actuals utilitzades en l'àmbit clínic durant l'infart agut de miocardi (IAM) se centren en la revascularització de la zona isquèmica. Entre aquestes estratègies, l'angioplàstia coronària, procediment pel qual s'utilitza un catèter per a desobstruir l'artèria oclosa, és el procés més utilitzat. No obstant això, s'ha descrit que aquest procés (conegut com a reperfusió) desencadena un mal addicional en el miocardi. En conseqüència, la combinació d'aquesta intervenció amb molècules cardioprotectores resulta de gran interés per a tractar de reduir la grandària de l'infart. El present treball proposa dues noves molècules amb potencial cardioprotector en el context del IAM. Com a primera estratègia terapèutica, s'ha proposat l'aportació d'un àcid gras (diDHA) a la zona isquèmica del miocardio abans de la reperfusió per a tractar de reduir l'estrés dels cardiomiocitos i el nombre de cèl·lules mortes abans de la reperfusió. A més, s'han sintetitzat nanoconjugats basats en la unió covalent de diDHA a un esquelet polimèric (àcid poli-L-glutàmic, PGA) amb la finalitat d'incrementar l'estabilitat del diDHA i aconseguir un alliberament controlat de la molècula. Els resultats obtinguts van mostrar que la formulació PGA-diDHA6.4 va ser la més efectiva, mostrant un millor efecte en el precondicionament dels cardiomiocitos abans de la reperfusió en termes de reducció d'apoptosi, generació d'espècies reactives d'oxigen i manteniment de la funció mitocondrial in vitro. A més, el nanoconjugat PGA-diDHA6.4 també va mostrar un modest efecte terapèutic quan es va administrar en models in vivo d'isquèmia-reperfusió en rates i porcs, reduint la grandària final d'infart respecte als grups control. La segona estratègia proposada s'ha centrat en potenciar l'efect terapèutic de vesícules extracelul·lars de xicoteta grandària (SEV o exosomes) que son secretades per cèl·lules mare estromales. Nombrosos estudis han descrit el paper terapèutic de factors paracrinos secretats per les MSC, on s'inclouen tant factors solubles com vesícules extracelul·lars (EV) i, especialment, les SEV. Diverses estratègies, com la modificació genètica o el precondicionament de les MSC, s'han estudiat per augmentar el potencial terapèutic d'aquestes cèl·lules. En aquest treball, es va pensar en la modificació genètica de les MSC amb l'objectiu d'enriquir les SEV en proteïnes d'interés que pogueren potenciar l'efecte terapèutic de les SEV natives. Sobre la base d'estudis previs, on s'ha vist que la oncostatina-M (OSM) podria jugar un paper anti-fibròtic en el context del IAM, es va decidir incorporar aquesta proteïna en la superfície de les SEV derivades de MSC mitjançant la seua fusió amb proteïnes presents de manera natural en la superfície de les SEV, amb l'objectiu de desencadenar una resposta en les cèl·lules diana. La modificació de la seqüència de la OSM i la seua fusió amb la tetraspanina CD81 van permetre carregar de manera efectiva la OSM en la superfície de les SEV, i els resultats preliminars en fibroblastos ventriculars cardíacs van mostrar un efecte funcional respecte als SEV control i els enriquits en CD81, reduint la taxa de proliferació de les cèl·lules en condicions de dejuni, i modificant l'expressió i la secreció de la proteïna telo-Col1α1 en les cèl·lules després de ser estimulades amb TGFβ-1, α-dextran i àcid ascòrbic-L-sulfat, simulant una activació dels fibroblastos in vitro. En resum, dues noves estratègies terapèutiques avançades lliures de cèl·lules han sigut proposades en el present treball, on s'han mostrat resultats preliminars prometedors per a reduir el mal en el miocardi després del IAM en termes de reducció d'apoptosi de cardiomiocitos i d'activació de fibroblastos cardíacs. / [EN] Current therapeutic approaches against acute myocardial infarction (AMI) are focused on myocardial ischemic zone revascularization. The most common strategy is called primary angioplasty, in which a catheter is introduced to unblock the affected artery and restore blood flux, in a process called reperfusion. Nevertheless, an additional injury on cardiac tissue is caused after reperfusion, and the combination of primary angioplasty with the use of cardioprotective molecules has emerged as a potential strategy to reduce cardiac tissue injury. Two new cell-free therapeutic strategies to preconditionate myocardial ischemic area before reperfusion have been proposed to reduce cardiac injury after AMI. The first therapeutic strategy proposed consisted on the input of a free fatty acid (di-docosahexaenoic acid, diDHA) covalently bound to a polymeric backbone (poly-L-glutamic acid, PGA) in order to increase diDHA solubility and stability and modulate its effect on target cells. Results showed that PGA-diDHA6.4 conjugate administration during ischemia protected cardiomyocytes from reperfusion-induced injury, as apoptotic number of cells and oxidative stress was reduced, and mitochondrial function was less affected when compared to untreated cells. In addition to this, PGA-diDHA6.4 also showed therapeutic effects when locally administered in an ischemia-reperfusion in vivo model in rats and pigs, where a modest reduction of area at risk was observed compared to control groups. The second cell-free strategy proposed in this work was focused on enhancing the therapeutic potential of small extracellular vesicles (SEV or exosomes) isolated form mesenchymal stromal cells (MSC) conditioned media. Previous studies have described the therapeutic potential of paracrine factors released by MSC, where both soluble factors and vesicular components are included. In particular, SEV have gained special attention. Several stretegies, such as genetic modification or cell preconditioning, have been tested to enhance the MSC therapeutic potential. In this work, it was proposed MSC genetic modification in order to load proteins of interest on SEV and potentiate its native therapeutic potential. Based on previous findings, where it has been described a potential anti-fibrotic role of oncostatin-M (OSM) in AMI context, we decided to incorporate OSM on SEV surface by its fusion to CD81 tetraspanin, a protein naturally loaded on SEV surface, in order to trigger functional effects on target cells. OSM sequence modification was necessary in order to load the protein on SEV surface efficiently, and preliminary data showed that modified OSM-CD81 loaded on SEV had a functional effect on human ventricular cardiac fibroblasts. Concretely, decrease of proliferation rate after starvation and telo-Collagen1α1 location pattern modification was observed after stimulation with a pro-fibrotic cocktail (containing TGFβ-1, α-dextran and ascorbic-L-acid sulphate) in vitro when cells were treated with modified OSM-CD81- SEV compared to ctrl and CD81-loaded SEV treatments. Overall, two new advanced cell-free therapies with preliminary promising results have been proposed in order to reduce myocardial injury after AMI in terms of cardiomyocytes apoptosis reduction and fibrosis mitigation. / Tejedor Gascón, S. (2021). Development of new advanced therapies to mitigate ischemia-reperfusion-induced injury during acute myocardial infarction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171487