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[ES] Actualmente la insuficiencia cardiaca es una de las principales causas de mortalidad y co-morbilidad a nivel mundial sobre todo en países desarrollados. Este tipo de patología a su vez, se desglosa en un gran abanico de posibles agentes que perturban el funcionamiento del músculo cardiaco en función de su causa. Uno de los problemas más importantes a niveles de afectación cardiaca se centra en pacientes que sufren algún tipo de cáncer y son tratados con antraciclinas. Estas drogas ampliamente usadas en el mundo de la oncología, tienen una serie de efectos secundarios entre los cuales destaca su posible efecto cardiotóxico. Este trabajo ahonda sobre este proceso y sobre la existencia de un perfil de paciente con una susceptibilidad a sufrir este tipo de episodios de toxicidad cardiaca. En este sentido, se investiga una serie de miRNAs que se encuentran diferencialmente expresados en pacientes que sufren este tipo de episodios frente a los que no. Una vez se detectan estos miRNA generamos un algoritmo predictor mediante el cual somos capaces de predecir si un paciente sufrirá cardiotoxicidad en función de la cantidad de ciertos miRNAs presentes en suero. Una vez descubiertos estos miRNAs nos centramos en la búsqueda de una posible opción terapéutica para esta serie de eventos. Para ello usamos las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células mesenquimales estromales (MSC), unas células que han demostrado tener un alto potencial terapéutico y de gran seguridad. Se evaluó su capacidad terapéutica en el daño inducido por doxorrubicina y posteriormente se amplió el estudio añadiendo el daño por isquemia reperfusión en diferentes frentes como puede ser la regeneración cardiaca, inhibición de la fibrosis o neoangiogénesis. Aunque es necesario un estudio más exhaustivo de los perfiles de cardiotoxicidad y de los mecanismos de acción tanto de los miRNAs como de las EVs, esta tesis demuestra la capacidad de ambos como una potente herramienta tanto de diagnóstico como terapéutica. / [CA] Actualment la insuficiència cardíaca és un dels principals causes de mortalitat i co-morbiditat a nivell mundial sobretot en països desenvolupats. Aquest tipus de patologia al seu torn, es desglossa en un gran ventall de possibles agents que pertorben el funcionament de l'múscul cardíac en funció de la seva causa. Un dels problemes més importants a nivells d'afectació cardíaca se centra en pacients que pateixen algun tipus de càncer i són tractats amb antraciclines. Aquestes drogues àmpliament usades en el món de l'oncologia, tenen una sèrie d'efectes secundaris entre els quals destaca el seu possible efecte cardiotòxic. Aquest treball aprofundeix sobre aquest succés i sobre ha un perfil de pacient amb una susceptibilitat a patir aquest tipus d'episodis de toxicitat cardíaca. En aquest sentit s'investiga una sèrie de miRNAs que es troben diferencialment expressats en pacients que pateixen aquest tipus d'episodis enfront dels que no. Un cop es detecten aquests miRNA generem un algoritme predictiu mitjançant el qual, som capaços de predir si un pacient patirà cardiotoxicitat en funció de la quantitat de certs miRNAs presents en sèrum. Un cop descoberts aquests miRNAs ens centrem en la recerca d'una possible opció terapèutica per a aquesta sèrie d'esdeveniments. Per a això fem servir les vesícules extracelulres derivades de cèl·lules mesesnquimales, unes cèl·lules que han demostrat tenir un alt potencial terapèutico i de gran seguretat. Es testen la seva capacitat terapèutica en el dany per doxurbicina i posteriorment s'amplia l'estudi afegint el dany per isquèmia reperfusió en diferents fronts com pot ser la regeneració cardíaca, inhibició de la fibrosi o neoangiogènesi. Encara que és necessari un estudi més exhaustiu dels perfils de cardiotoxicitat i dels mecanismes d'acció tant dels miRNAs com de les EVs, aquesta tesi demostra la capacitat de tots dos com una potent eina tant de diagnòstic com terapèutica. / [EN] Heart failure is currently one of the main causes of mortality and co-morbidity worldwide, especially in developed countries. This type of pathology, can be broken down into a wide range of possible agents that disturb the functioning of the cardiac muscle depending on its cause. One of the most important problems in terms of cardiac involvement is centered on patients who suffer from some type of cancer and are treated with anthracyclines. These drugs, widely used in the world of oncology, have a series of side effects, among which their possible cardiotoxic effect stands out. This work delves into this event and into the existence of a patient profile with a susceptibility to suffer this type of episodes of cardiac toxicity. In this sense, we investigate a series of miRNAs that are differentially expressed in patients who suffer this type of episodes versus those who do not. Once these miRNAs were detected, we generated a predictive algorithm by which we are able to predict whether a patient will suffer cardiotoxicity based on the amount of certain miRNAs present in serum. Once these miRNAs were discovered, we focused on the search for a possible therapeutic option for this series of events. For this we used extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal cells (MSC), cells that have been shown to have a high therapeutic potential and high safety. We tested their therapeutic capacity in doxorubicin injury and later extended the study by adding ischemia reperfusion injury on different fronts such as cardiac regeneration, inhibition of fibrosis or neoangiogenesis. Although a more exhaustive study of the cardiotoxicity profiles and mechanisms of action of both miRNAs and EVs is needed, this thesis demonstrates the capacity of both as a powerful diagnostic and therapeutic tool. / Sánchez Sánchez, R. (2021). Estudio del papel de los miRNAs y las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales en la patología cardiaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177178

[ES] Las células mesenquimales estromales (MSC) poseen una serie de cualidades inmunológicas, pro-angiogénicas y regenerativas que las convierten en un excelente candidato para el tratamiento de diversas patologías. A pesar de las pruebas contundentes obtenidas en modelos preclínicos que demuestran la actividad terapéutica de las MSC, los ensayos clínicos no han podido mostrar hasta ahora un beneficio consistente, probablemente debido a deficiencias metodológicas y a la falta de estandarización, así como a la variabilidad genética intrínseca a los estudios en humanos. Debido a ello, ha sido necesario profundizar en los mecanismos responsables del beneficio terapéutico y rediseñar las estrategias clínicas. En los últimos años, se ha observado que la reparación tisular mediada por las MSC se produce de forma paracrina, y se ha constatado que las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por las MSC (EVMSC) son capaces de recapitular las propiedades inmunosupresoras de las células parentales. Además, las estrategias terapéuticas basadas en vesículas tienen grandes ventajas en términos de bioseguridad y producción en condiciones de grado clínico, reduciendo significativamente el coste de dichas terapias. Sin embargo, la dosis efectiva en grandes mamíferos, incluidos los humanos, es bastante elevada y la producción industrial de EVs se ve dificultada en parte, por la senescencia proliferativa que afecta a las MSC durante la expansión celular masiva. En este trabajo hemos intentado solventar los principales escollos de la terapia con EVs incrementando su potencial inmunosupresor y reduciendo por tanto la dosis efectiva. Este incremento se ha conseguido gracias a la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1-alpha y al desarrollo de un medio de acondicionamiento en cultivo basado en citoquinas. Además, la inmortalización de las células secretoras mediante la transducción del gen de la telomerasa humana ha permitido tanto la estandarización del producto como su producción a gran escala. La eficacia de estas EVs ha sido testada en diferentes poblaciones celulares in vitro: linfocitos T, monocitos, células Natural Killer, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos; y en dos modelos de ratón: hipersensibilidad retardada y colitis aguda inducida por TNBS. En conclusión, hemos desarrollado una fuente de EVs de larga duración que secreta grandes cantidades de vesículas con mayor capacidad inmunosupresora y antiinflamatoria, facilitando un producto terapéutico más estándar y fácil de producir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. / [CA] Les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) posseeixen una sèrie de qualitats immunològiques, pro-angiogèniques i regeneratives que les converteixen en un excel·lent candidat per al tractament de diverses patologies. Tot i les proves contundents obtingudes en models preclínics que demostren l'activitat terapèutica de les MSC, els assaigs clínics no han pogut mostrar fins ara un benefici consistent, probablement degut a deficiències metodològiques i a la manca d'estandardització, així com a la variabilitat genètica intrínseca als estudis en humans. A causa d'això, ha calgut aprofundir en els mecanismes responsables del benefici terapèutic i redissenyar les estratègies clíniques. En els últims anys, s'ha observat que la reparació tissular intervinguda per les MSC es produeix de forma paracrina, i s'ha constatat que les vesícules extracel·lulars (EVs) secretades per les MSC (EVMSC) són capaços de recapitular les propietats immunosupressores de les cèl·lules parentals. A més, les estratègies terapèutiques basades en vesícules tenen grans avantatges en termes de bioseguretat i producció en condicions de grau clínic, reduint significativament el cost d'aquestes teràpies. No obstant això, la dosi efectiva en grans mamífers, inclosos els humans, és bastant elevada i la producció industrial de les EVs es veu dificultada en part, per la senescència proliferativa que afecta les MSC durant l'expansió cel·lular massiva. En aquest treball hem intentat solucionar els principals esculls de la teràpia amb EVs incrementant el seu potencial immunosupressor i reduint per tant la dosi efectiva. Aquest increment s'ha aconseguit gràcies a la sobreexpressió del factor induïble per hipòxia 1-alpha i a el desenvolupament d'un mitjà de condicionament en cultiu basat en citoquines. A més, la immortalització de les cèl·lules secretores mitjançant la transducció del gen de la telomerasa humana ha permès tant l'estandardització del producte com la seva producció a gran escala. L'eficàcia d'aquestes EVs ha estat testada en diferents poblacions cel·lulars in vitro: limfòcits T, monòcits, cèl·lules Natural Killer, macròfags, cèl·lules endotelials i fibroblasts; i en dos models de ratolí: hipersensibilitat retardada i colitis aguda induïda per TNBS. En conclusió, hem desenvolupat una font de EVs de llarga durada que secreta grans quantitats de vesícules amb major capacitat immunosupressora i antiinflamatòria, facilitant un producte terapèutic més estàndard i fàcil de produir per al tractament de malalties inflamatòries inmunomediades. / [EN] Mesenchymal stromal cells (MSC) possess several immunological, pro-angiogenic and regenerative qualities that make them an excellent candidate for the treatment of various pathologies. Despite compelling evidence from preclinical models demonstrating the therapeutic activity of MSCs, clinical trials have so far failed to show consistent benefit, probably due to methodological shortcomings and lack of standardisation, as well as the genetic variability intrinsic to human studies. As a result, it has been necessary to further investigate the mechanisms responsible for therapeutic benefit and to redesign clinical strategies. In recent years, it has been observed that MSC-mediated tissue repair occurs in a paracrine pathway, and it has been confirmed that extracellular vesicles (EVs) secreted by MSC (EVMSC) are able to recapitulate the immunosuppressive properties of the parental cells. Moreover, vesicle-based therapeutic strategies have great advantages in terms of biosafety and production under clinical-grade conditions, significantly reducing the cost of such therapies. However, the effective dose in large mammals, including humans, is quite high and the industrial production of EVs is hampered in part by the proliferative senescence that affects MSC during massive cell expansion. In this work, we have attempted to overcome the main challenges of EVs therapy by increasing their immunosuppressive potential and thus reducing the effective dose. This increase has been achieved by overexpression of hypoxia-inducible factor 1-alpha and the development of a cytokine-based culture conditioning medium. In addition, immortalization of secretory cells by transduction with the human telomerase gene has allowed both product standardisation and large-scale production. The efficacy of these EVs has been tested in different cell populations in vitro: T lymphocytes, monocytes, Natural Killer cells, macrophages, endothelial cells and fibroblasts; and in two mouse models: delayed-type hypersensitivity and TNBS-induced acute colitis. In conclusion, we have developed a long-lasting source of EVs that secretes large amounts of vesicles with enhanced immunosuppressive and anti-inflammatory capacity, providing a more standard and easier-to-produce therapeutic product for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. / Gómez Ferrer, M. (2022). Terapias innovadoras basadas en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales modificadas genéticamente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182560

<p dir="ltr">Cells within our bodies communicate with each other through various mechanisms, one of which is through the use of small vesicles generically referred to as ‘extracellular vesicles’ (EVs). Notably, EVs are secreted by nearly all types of cells and harbor in them biomolecules that they derive from the parent cells. Our first study from the lab in the field of EV biology revealed that EVs from non-small cell lung cancer cells induce invasive phenotype in non-tumorigenic bronchial epithelial cells. Remarkably, RNA component of EVs stands out as a significant contributor to EV-related function. To determine specifics about the RNA subsets functional in the invasive phenotype in recipient cells, we performed an RNA sequencing analysis of total RNA from EVs of NSCLC and non-tumorigenic cells. Indeed, there were unique patterns of enrichment of RNA subsets in the EVs from the NSCLC cells. Amongst the RNAs uniquely enriched in Calu6 EVs, miR-10b, miR-100 and miR-155 were the most prominent. Interestingly, further studies leading to defining the cargo most crucial for driving invasive potential in non-tumorigenic cells, revealed the combinatorial impact of these three miRNAs. Our RNA sequencing analysis not only revealed unique patterns of enrichment of RNAs in NSCLC EVs, but also revealed something unexpected, that is the presence of miRNA subsets in EVs that are lost from NSCLC cells. We hypothesized that the export of miRNAs in EVs is a mechanism that cancer cells use to deplete themselves of specific subsets of miRNAs. To begin to delineate the pathway of export, we discovered a five-nucleotide RNA motif in the miRNAs enriched in NSCLC cell-derived EVs. Notably, this motif was not identified in EVs from non-tumorigenic cells. Interestingly, the motif was found to be necessary for the export of miRNAs into EVs. Not only that but the identified motif is also exported out into EVs through a mechanism that is specific to cancer cells. This further leads us to delineate the process of sequence-based export into EVs by identifying the cellular machinery that recognizes this motif in miRNAs and/or ‘marks’ them for export into EVs. To delve deeper into the understanding of the dynamics of RNA export into EVs, we successfully developed a method using flow cytometry to analyze the export of fluorescently labeled miRNAs by the cells into the EVs. The power of the developed tool will be used in fluorescence based CRISPR Cas9 screening to identify cellular features of miRNA export into EVs.</p>

La leishmaniose est une maladie zoonotique vectorielle, causée par le parasite protozoaire Leishmania, affectant des millions de personnes dans le monde. Il n'existe pas de vaccin pour la forme humaine, et les médicaments actuels, y compris la miltéfosine (MF), rencontrent une résistance croissante. Des découvertes récentes montrent que les vésicules extracellulaires (VEs) de Leishmania contribuent à la propagation des gènes de résistance aux médicaments in vitro. Il est donc crucial d'explorer de nouvelles méthodes pour lutter contre cette résistance, notamment à la MF. Nous avons étudié la capacité de Leishmania génétiquement sensibilisée, par la surexpression du complexe de transport d'internalisation de la MF (MT-Ros3), à produire des VEs et à moduler la sensibilité du parasite après un contact in vitro. La co-inoculation de parasites et de VEs de différentes souches a été évaluée à travers quatre approches différentes. Les analyses physiologique, protéomique et génomique des VEs ont caractérisé leur profil et guidé l'interprétation de la sensibilité aux médicaments. Les résultats montrent que les VEs sensibilisent la souche résistante (Li MF200.5) à la MF après un contact in vitro, surtout lorsqu'elles sont produites et transférées physiologiquement via la méthode Membrane semi-perméable. Ainsi, lorsque les VEs sont pré-incubées avec la MF pendant 3 jours, la sensibilité au médicament augmente significativement. Nous démontrons, pour la première fois, le rôle de "cheval de Troie" des VEs dans la réduction de la résistance à la MF, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies pour combattre la résistance aux médicaments chez Leishmania et d'autres microorganismes. / Leishmaniasis is a vector-borne zoonotic disease caused by the protozoan parasite Leishmania, affecting millions of people worldwide. There is no vaccine for the human form, and current drugs, including miltefosine (MF), are facing increasing resistance. Recent discoveries show that Leishmania extracellular vesicles (EVs) contribute to the spread of drug resistance genes in vitro. Therefore, it is crucial to explore new methods to combat this resistance, particularly to MF. We studied the ability of genetically sensitized Leishmania, through the overexpression of the MF internalization transport complex (MT-Ros3), to produce EVs and modulate the parasite's sensitivity after in vitro contact. The co-inoculation of parasites and EVs from different strains was evaluated through four different approaches. Physiological, proteomic, and genomic analyses of the EVs characterized their profile and guided the interpretation of drug sensitivity. The results show that EVs sensitize the resistant strain (Li MF200.5) to MF after in vitro contact, especially when they are produced and transferred physiologically via the Transwell method, a method involving the passage of EVs through a semi-permeable membrane. Additionally, when EVs are pre-incubated with MF for 3 days, sensitivity to the drug significantly increases. For the first time, we demonstrate the "Trojan horse" role of EVs in reducing MF resistance, thus paving the way for new strategies to combat drug resistance in Leishmania and other microorganisms.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des vésicules membranaires de taille majoritairement submicrométrique présentes dans les fluides biologiques et émises par les cellules en réponse à divers stimuli. Les VEs sont impliquées dans de nombreux phénomènes physiologiques mais également dans des pathologies telles que cancers ou maladies cardiovasculaires. Elles pourraient donc être utilisées comme biomarqueurs de ces pathologies. Bien que les VEs soient aujourd’hui largement étudiées, nos connaissances sur le sujet demeurent limitées. Ceci est principalement dû aux difficultés de caractérisation des VEs et à l’absence de standardisation de leurs méthodes d’étude et d’isolation. La première partie de mon travail de thèse a porté sur le développement d’une méthode de thiolation de protéines. Des anticorps ont été modifiés pour exposer des thiols et ont été conjugués à des nanoparticules d’or fonctionnalisées par des maléimides. Le couplage des anticorps thiolés aux nanoparticules d’or a été étudié de manière quantitative et des conditions de conjugaison optimales ont été déterminées par des approches biochimiques. La seconde partie de ce travail a concerné la caractérisation des VEs du plasma sanguin de sujets sains par microscopie électronique à transmission (MET). La morphologie, la taille et le phénotype des VEs ont été déterminés par cryo- MET combinée au marquage par des nanoparticules d’or conjuguées à des protéines. La quantification objective des VEs du plasma sanguin a été réalisée à l’aide d’une méthode originale de MET basée sur la sédimentation de VEs sur grille de MET. La troisième partie de cette étude a consisté à mettre au point une méthode d’isolation de VEs à l’aide de particules magnétiques conjuguées à de l’AnxA5. Des conditions permettant d’extraire la totalité des VEs exposant la phosphatidylsérine contenues dans un plasma sanguin ont été déterminées par cytométrie en flux (CF). Ce travail a permis d’apporter une caractérisation détaillée des VEs du plasma sanguin du sujet sain et peut servir de référence pour des études ultérieures concernant les VEs contenues dans des plasmas ou autres liquides biologiques pathologiques. / Extracellular vesicles (EVs) are submicrometric membrane vesicles found in body fluids and produced by cells in response to various stimuli. EVs are involved in numerous physiological processes but also in pathologies as cancers or cardiovascular diseases. Even if EVs are largely studied, our knowledge about them remains limited. This is mainly caused by the difficulties to characterize EVs and by the lack of standardized methods allowing their characterization. The first part of my PhD work focused on the development and optimization of a protein thiolation method. Antibodies modified to expose few thiols were conjugated to gold nanoparticles functionalized with maleimides. The binding of thiolated antibodies to gold nanoparticles was quantitatively studied and optimal conjugation conditions were determined using biochemical methods. The second part of my PhD work concerned the characterization of blood plasma EVs from healthy subjects using transmission electron microscopy (TEM). EVs morphology, size and phenotype were determined by cryo-TEM combined with labelling with protein-conjugated gold nanoparticles. The near-absolute quantification of blood plasma EVs was achieved using an original TEM method based on the direct sedimentation of EVs onto TEM grids. The third part of this study consisted in developing an EV isolation method using AnxA5-conjugated magnetic particles. Conditions allowing total extraction of blood plasma phosphatidylserine-exposing EVs were determined using flow cytometry (FC). This study presents a detailed characterization of blood plasma EVs from healthy subjects and can serve as a reference for future studies on EVs contained in pathological plasmas or other body fluids.

L'athérosclérose est la principale cause de maladies coronariennes, affectant les artères de grand et moyen calibre. C'est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par des plaques situées dans la couche de l’intima, composées de cellules inflammatoires, de cellules musculaires lisses, de composants fibreux et de lipides. Qu'il provienne de source alimentaire ou hépatique, le cholestérol qui s'accumule dans les macrophages des tissus périphériques, comme la paroi artérielle, engendre une réaction inflammatoire et doit être conséquemment mobilisé à l'aide d’accepteurs de cholestérol comme les lipoprotéines de haute densité (HDL). Ce processus spécifique est appelé transport inverse du cholestérol (mRCT). Des études ont démontré que l'apolipoprotéine A-I (apoA-I) pourrait être un acteur clé dans la régulation du mRCT, exerçant des effets différents de ceux du HDL. Plus important encore, le système lymphatique a récemment été identifié comme un nouvel acteur essentiel dans l'élimination du cholestérol de la lésion athérosclérotique (Martel et al., JCI 2013). Il a été démontré que sans vaisseaux lymphatiques fonctionnels, la mobilisation du cholestérol hors de la plaque ne peut pas être réalisée correctement et aggrave la maladie. Le réseau lymphatique est parallèle au système sanguin et il est présent dans presque tous les tissus du corps. C'est un acteur essentiel dans le maintien de l'homéostase des fluides, dans le transport des cellules immunitaires de la périphérie vers les ganglions lymphatiques correspondants, ainsi que dans l’absorption des lipides alimentaires de l'intestin vers la circulation sanguine. Le système lymphatique comprend les vaisseaux lymphatiques (LVs) initiaux et collecteurs, ainsi que les ganglions lymphatiques, qui ont une anatomie spécifique et des rôles distincts. La lymphe, le liquide clair qui circule dans les LVs, se jette dans la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Les plaquettes sont responsables de la régulation de cette séparation des vaisseaux sanguins et lymphatiques via la formation d’un thrombus formé lors de l’interaction de leur récepteur CLEC-2 avec la podoplanine présente sur les cellules endothéliales lymphatiques. Il a également été démontré que l’activité plaquettaire était nécessaire tout au long de la vie pour maintenir l’intégrité des jonctions des LVs. L'athérosclérose est également caractérisée par une activation cellulaire et une apoptose accrue. Par conséquent, ces activités cellulaires peuvent entraîner la formation de particules submicroniques appelées vésicules extracellulaires qui ont des effets variables, mais souvent néfastes, sur l'endothélium sanguin et l'évolution de la plaque. La maladie cardiovasculaire a été associée à une augmentation du nombre des vésicules extracellulaires (EVs) en circulation, et nous croyons que ces véhicules pourraient être impliqués dans le dysfonctionnement lymphatique lié à l'athérosclérose. D'après des données récentes publiées au cours de ma maîtrise, l'amélioration du transport lymphatique pourrait limiter la progression de l'athérosclérose et favoriser la régression de la plaque. Nous avons montré que le transport lymphatique est altéré chez les jeunes souris prédisposés à développer l'athérosclérose, même avant l'apparition de la plaque. Nous avons prouvé que cet effet est d’abord associé à un défaut au niveau des vaisseaux collecteurs et nous suggérons que l'amélioration de la liaison du VEGF-C/ VEGFR3 puisse supprimer ce défaut spécifique. L'objectif global de cette thèse était de poursuivre dans cette voie et de mieux définir le rôle de l’important facteur de croissance lymphatique, VEGF-C, et de la lipoprotéine apoA-I dans la maintenance de l’intégrité et la fonction des vaisseaux lymphatiques. En outre, une meilleure description des composants de la lymphe, en particulier des agents libérés par les cellules, a été jugée nécessaire. La première publication nous a permis de montrer que, lorsqu'elles étaient injectées avec un mutant du facteur de croissance VEGF-C ciblant spécifiquement le récepteur VEGFR-3 (VEGF-C 152s), avant l'administration d'une diète pro-athérogène, les souris Ldlr-/- étaient protégées contre l’accumulation excessive dans la plaque et celle-ci était plus stable à long terme. La capacité de contraction soutenue des vaisseaux lymphatiques collecteurs et l'expression accrue de VEGFR-3 et de FOXC2 observée chez ces souris traitées avec VEGF-C-152s ont contribué à la clairance des composants nocifs contenus dans les tissus périphériques tels que les macrophages et le cholestérol. La deuxième publication a montré que des souris Ldlr-/- athérosclérotiques traitées à faible dose avec de l’apoA-I, présentaient un transport lymphatique accru et une hyperperméabilité des vaisseaux lymphatiques collecteurs abrogée, possiblement par une modulation de l’activité plaquettaire. La troisième publication est la première à démontrer la présence de vésicules extracellulaires d'origines hétérogènes dans la lymphe des souris et que le nombre de différents sous-types augmente chez les souris athérosclérotiques. Collectivement, ces études confirment la présence d'un dysfonctionnement lymphatique chez la souris avant même l'apparition de la plaque, et il est intéressant de noter que ce dysfonctionnement est principalement associé à un défaut des vaisseaux lymphatiques collecteurs, limitant ainsi le transport de la lymphe des tissus périphériques vers le sang. Différents traitements avec des facteurs de croissance et des lipoprotéines peuvent potentiellement moduler l’apparition et la progression de la lésion en améliorant la fonction lymphatique à différents stades de la maladie athérosclérotique. Nos découvertes concernant la présence de EVs dans la lymphe représentent leur potentiel en tant que biomarqueurs, mais également une nouvelle cible pour mieux comprendre la dysfonction lymphatique. / Atherosclerosis is the principal cause of coronary artery disease (CAD), affecting large- and medium-sized arteries. It is a chronic inflammatory disease characterized by intimal plaques composed of inflammatory cells, smooth muscle cells, fibrous components and lipids. Cholesterol that accumulates within macrophages in peripheral tissues, like the arterial wall, whether from dietary or synthetic sources, promotes inflammatory responses and needs to be excreted with the help of the cholesterol acceptor high density lipoprotein (HDL). This specific process is termed macrophage reverse cholesterol transport (mRCT) and studies have demonstrated that lipid free apolipoprotein A-I (apoA-I) could be a key player in mRCT regulation, exuding different effects than HDL. More importantly, recently, the lymphatic system has been identified as a novel prerequisite player in the removal of cholesterol out of the atherosclerotic lesion (Martel et al., JCI 2013). It has been demonstrated that without functioning lymphatic vessels cholesterol mobilization from the plaque cannot be properly achieved and aggravates the disease. The lymphatic network runs in parallel to the blood vasculature and is present in almost all the tissues of the body. It is a crucial player in maintaining fluid homeostasis, trafficking immune cells from the periphery to corresponding lymph nodes, as well as transporting lipids from the intestine to the circulation. The lymphatic system comprises the initial and collecting lymphatic vessels (LVs), as well as lymph nodes, all with a specific anatomy and distinctive roles. Lymph, the clear fluid that circulates within LVs drains towards the bloodstream at the level of the subclavian vein. Platelets are responsible to regulate this blood/lymphatic vessel separation by forming a clog, upon the interaction of their C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) with podoplanin, present on lymphatic endothelial cells. Platelet activity has also been shown to be required throughout life in order to maintain LV junction integrity. Atherosclerosis is also characterized by increased cellular activation and apoptosis. Consequently, these cellular activities may result in the formation of submicron particles called extracellular vesicles (EVs) that have variable effects on the blood endothelium and subsequent plaque evolution. CAD has been associated with increased circulating EVs, and we suspect that these EVs might be involved in atherosclerosis-related lymphatic dysfunction. Based on recent data collected during my master’s degree, there is evidence that enhancing lymphatic transport could limit atherosclerosis progression and favour plaque regression. We showed that lymphatic transport is impaired in young, atherosclerosis-prone mice, even before atherosclerosis onset. We believe it to be potentially associated with a defect in the lymphatic pumping capacity, and we suggest that enhancing VEGF-C/VEGFR-3 binding can abolish this specific defect. The global objective of this thesis was to pursue along this path and better delineate the role of the important lymphatic-specific growth factor, VEGF-C and the lipoprotein apoA-I, on collecting LVs function. Furthermore, a better understanding of lymph components, especially cellular releasants was deemed necessary. The first publication allowed us to show that when injected with VEGF-C 152s, before the administration of a pro-atherogenic regimen, Ldlr-/- mice were protected from excessive plaque formation and long-term, had a more stable plaque. The sustained contraction capacity of the collecting lymphatic vessels and the enhanced expression of VEGFR-3 and FOXC2 observed in these VEGF-C-152s treated mice contributed to the clearance of harmful components contained in peripheral tissues such as the macrophages and cholesterol. The second publication showed that atherosclerotic Ldlr-/- mice treated with low-dose lipid-free apoA-I had enhanced lymphatic transport and abrogated collecting LV permeability possibly through modulation of platelet activity. The third publication is the first ever to demonstrate the presence of extracellular vesicles of heterogeneous origins in the lymph of mice, and that their levels differ in atherosclerosis. Collectively, these studies confirm that lymphatic dysfunction is present before the onset of atherosclerosis, and particularly of interest, that this dysfunction is primarily associated with a defect in the collecting vessels, thereby limiting the lymph transport from peripheral tissues to the blood. Different treatments with growth factors and lipoproteins have the potential to modulate the lesion onset and progression through the enhancement of lymphatic function, while our findings regarding the presence of EVs in lymph represents their potential as biomarkers, but also a new venue to better understand lymphatic dysfunction.