Made available in DSpace on 2016-06-02T19:28:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVC.pdf: 1088057 bytes, checksum: 9a67e9f55a435c2b6dc52f3f3da3b0cc (MD5) Previous issue date: 2006-06-14 / Release of extracellular polysaccharides can occur from healthy and active cells and has been demonstrated to be an important carbon source for bacteria. In eutrophic environments where large blooms are formed by efficient extracellular polysaccharide producers such as Microcystis aeruginosa and Anabaena spiroides, these organic materials (high molecular weight extracellular polysaccharides) may support planktonic bacterial growth. The aim of this study was to evaluate the extracellular glycolytic enzyme activity during a seasonal cycle and a possible regulation of the corresponding enzymes in response to variation of polysaccharides in Barra Bonita Reservoir. The majority of enzymes exhibited a significant decrease during the dry season (April to September). The content of total dissolved carbohydrates varied from 0.5 to 6.83 mg L-1 and was mainly (92%) constituted by polysaccharides. Phytoplanktonic community showed a marked succession with cyanobacteria typically dominating during the rainy season (Microcystis sp, Microcystis aeruginosa and Anabaena spiroides), whereas diatoms (mostly Aulacoseira granulata) and cryptophytes (Cryptomonas sp) were dominant through the dry season. Four algal blooms were observed during the experimental period, and after each bloom the release of combined carbohydrates was followed by high enzymatic activities, thus the production of extracellular enzymes for microheterotrophic microorganisms was related to the influx of polymeric organic substances. Even the monosaccharides composition of reservoir samples after each bloom roughly revealed the extracellular polysaccharide composition of dominant phytoplanktonic population. Experiments of polysaccharide degradation from Barra Bonita Reservoir and produced by dominant phytoplanktonic organisms (A. granulata e M. aeruginosa) assayed in laboratory conditions had confirmed the interpretation of data measured in field. / A liberação de polissacarídeos extracelulares pode ocorrer a partir de células saudáveis e ativas e tem sido demonstrado ser uma importante fonte de carbono para as bactérias. Em ambientes eutróficos onde grandes florações são formadas por eficientes produtores de polissacarídeos extracelulares como Microcystis aeruginosa e Anabaena spiroides estes substratos orgânicos podem, por exemplo, suportar o crescimento bacteriano planctônico. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade glicolítica extracelular durante o ciclo sazonal e os possíveis ajustes das enzimas correspondentes em resposta a variações dos polissacarídeos do Reservatório de Barra Bonita. A maioria das enzimas exibiu uma diminuição significativa durante a estação seca (abril a setembro). O conteúdo de carboidratos totais dissolvidos variou de 0,5 a 6,83 mg L-1 e foi composto principalmente de polissacarídeos (92%). A comunidade fitoplanctônica mostrou uma sucessão evidente com cianobactérias dominando durante a estação chuvosa (principalmente Microcystis sp, M. aeruginosa e Anabaena spiroides) enquanto que as diatomáceas (principalmente Aulacoseira granulata) e criptofíceas (Cryptomonas sp) estiveram presentes em maiores densidades durante a estação seca. Quatro florações foram verificadas durante o período experimental e, após cada floração a liberação de carboidratos combinados foi seguida por elevadas atividades enzimáticas, dessa forma a produção de enzimas extracelulares pelos microorganismos microheterotróficos esteve relacionada ao influxo de matéria orgânica polimérica. Mesmo a composição dos monossacarídeos das amostras do reservatório após cada floração aproxima-se da composição do polissacarídeo extracelular da população fitoplanctônica dominante. Também foram realizados experimentos de degradação do polissacarídeo proveniente de Barra Bonita e do polissacarídeo extracelular produzido por organismos dominantes do fitoplâncton (A. granulata e M. aeruginosa) em laboratório que confirmaram a interpretação dos dados obtidos em campo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:29:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseSA.pdf: 1708612 bytes, checksum: 06c2e3fe4b37d4baf50bfedcac06331b (MD5) Previous issue date: 2006-09-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / O presente estudo foi realizado com freqüência mensal, nos períodos de julho /03 a dezembro /03 e de fevereiro a agosto /04. Foi usada a técnica de 14C para quantificar a matéria orgânica dissolvida excretada por populações fitoplanctônicas e também para quantificar a parte da produtividade primária canalizada para a produção de PEC. Para isso, amostras de água coletadas, no ponto, em quatro profundidades (superfície; 1,0; 3,0 e 5,0 m) da zona eufótica, foram incubadas (frascos claros e escuros) in situ por 4 horas com NaH14CO3. O ponto de coletas fica localizado no corpo central da represa, a cerca de 3 km a montante da barragem. As variáveis bióticas e abióticas apresentaram em geral uma distribuição vertical homogênea com variabilidade significativa apenas em escala temporal (sazonal e anual). Os maiores valores de produtividade primária de carbono total assimilado recém fotossintetisado foram obtidos em dezembro /03, fevereiro /04 e março /04, meses que correspondem ao verão (chuvoso). Nesses meses, foram também registrados os maiores valores de radiação PAR (Photosyntetic Available Radiation). Esses altos valores de radiação fotossintética ativa, observados principalmente na superfície, podem ter sido a causa principal que desencadeou os mecanismos de perda de carbono e perda de excreção por fotoinibição que ocorreu na superfície da água. A porcentagem relativa de carbono orgânico particulado recém fotossintetisado representou 93,5 % do carbono total assimilado recém fotossintetisado. De igual modo, a porcentagem relativa de carbono orgânico dissolvido também recém fotossintetisado representou 6,8 % do carbono total assimilado no ponto de coletas. As concentrações mais elevadas de MOD excretada foram registradas no verão (dezembro /03, fevereiro /04 e março /04) enquanto que no inverno as concentrações verificadas foram menores. No verão, as porcentagens relativas de colóides extracelulares totais (COET) representaram entre 1,9 a 51,2 % do Fixtotal recém fotossintetisado, enquanto que no inverno as contribuições relativas representaram entre 1,5 a 10,6 %. Nesse mesmo período (verão), as porcentagens relativas de colóides extracelulares totais (COET) representaram entre 4,6 a 84,9 % da MOD total excretada. No inverno, as porcentagens relativas de COET representaram entre 74,0 a 93,6 % da MOD total excretada. A produção de biomassa fitoplanctônica em forma de clorofila-a e a produtividade primaria acompanharam o padrão geral de excreção de matéria orgânica dissolvida, indicando a existência de uma relação direta (paralelismo) entre essas funções. As concentrações de clorofila-a, a concentração da produtividade primária e a produção de PEC excretados relacionaram-se positivamente e apresentaram uma variabilidade temporal significativa (p 0,05) e uma homogeneidade espacial não significativa (p < 0,05). As condições de equilíbrio (estabilidade da coluna de água, radiação solar, temperatura, TR) e as de distúrbio (precipitação pluviométrica, vazão, vento e TR) favoreceram o surgimento de florescimentos algais de espécies consideradas como grandes produtoras de PEC. Os resultados do presente estudo permitem inferir que o reservatório de Barra Bonita pode ser considerado um ambiente eutrofizado e polimítico, cujo processo de eutrofização vem aumentando ao longo dos anos. Com uma produção de PEC estimada em torno de 15852 ton / ano (0,488 ton / ha / ano) o mesmo reservatório pode ser considerado como de alta produtividade.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3192.pdf: 3896666 bytes, checksum: 9e7ce3de8ef146dad46027cfc0847c63 (MD5) Previous issue date: 2010-07-12 / Universidade Federal de Minas Gerais / The organism Planktothrix agardhii belongs to one of the two most abundant genera in the world among the phytoplankton (the other is Microcystis sp.). Nevertheless, the genus Planktothrix is potentially toxic, producing microcystins and anotoxinas, which makes relevant knowledge of the biology of species that produce large biomass, as the case of P. agardhii, and the relationships with the communities that coexist with them. Knowledge of the composition of EPS was fundamental to the understanding of possible correlation with bacteria based on the use of EPS as a substrate. The EPS excreted by P. agardhii grown in axenic culture is a heteropolymer rich in glucose (17.04%), whose composition also have the monosaccharides: glucuronic acid 13.78%, 12.65% of fucose, from 10.95 n-acetyl galactosamine, 10.48% n-acetyl glucosamine, 7.78% of rhamnose, galactose 7.04%, 4.89% arabinose and 15.39% from other types of sugars. EPS is composed of only one fraction slightly acidic. The degradation of EPS by the bacteria in natural population of Barra Bonita reservoir started at 12 hours and was totally consumed on the 31st day of exposure. The degradation of the polysaccharide followed by gas chromatography showed a quick decrease in the amount of glucose followed by an increase in the same after the 12th day. As for glucuronic acid occurs primarily an increase in concentration, followed by a sharp decline after the 12th day. The other monosaccharides present degradation to a minimum concentration or were completely exhausted. / O organismo Planktothrix agardhii é uma das espécies pertencentes a um dos dois gêneros mais abundantes no mundo inteiro entre o fitoplancton (o outro é Microcystis sp.). Não obstante, o gênero Planktothrix é potencialmente tóxico, produtor de microcistinas e anotoxinas, o que torna relevante o conhecimento da biologia de espécies produtoras de grande biomassa, como é o caso de P. agardhii, e as relações que possa ter com as comunidades que coabitam com elas. O conhecimento da composição dos EPS (polissacarídeo extracelular) foi fundamental para o entendimento das possíveis relações com bactérias baseadas na utilização dos EPS como substrato. EPS excretado por Planktothrix agardhii cultivada em cultura axênica é um heteropolímero rico em glicose (17%), cuja composição também apresenta os seguintes monossacarídeos: 14% de ácido glicurônico, 13% de fucose, 11% de ácido siálico, 11% de N-acetil galactosamina, 10% de N-acetil glicosamina, 8% de ramnose, 7% de galactose, 5% de arabinose e 4% de outros tipos de monossacarídeos não identificados. O EPS é composto por apenas uma única fração ligeiramente ácida. A degradação do EPS pelas bactérias da população natural do reservatório de Barra Bonita iniciou-se a partir das 12 horas sendo no 31º dia de exposição totalmente consumido. A degradação do polissacarídeo acompanhada por cromatografia gasosa mostrou rápida diminuição na quantidade de glicose seguida de um aumento da mesma, após o 12 º dia. Já para ácido glicurônico primeiramente ocorre um aumento na concentração, seguido de uma diminuição acentuada após o 12º dia. Os demais monossacarídeos apresentam degradação até uma concentração mínima ou foram completamente exauridos.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas aquáticas. Algumas espécies deste gênero são patógenos oportunistas de muitos animais aquáticos e terrestres, inclusive o homem. Vários fatores de virulência, tais como enterotoxinas, hemolisinas e outras enzimas, tem sido associados com a sua patogenicidade. As proteases extracelulares devem ser vistas como importantes enzimas envolvidas na versatilidade metabólica que possibilitam as Aeromonas persistir nos ambientes aquáticos, interagir com outros organismos, e causar doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar: as diferenças nas atividades de proteases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados de Aeromonas, a especificidade por substratos de poteases de Aeromonas, e a clonagem e expressão heteróloga da elastase de Aeromonas. Os resultados mostraram que A. hydrophila apresenta maior atividade proteolítica, sem, entretanto exibir diferenças significativas entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas proteolíticos dos isolados de Aeromonas demonstraram diferentes perfis com 0 a 5 bandas, correspondendo a metalo, serino ou outras proteases. Duas proteases (56K Da e 22 KDa) apresentaram atividade sobre um grande espectro de substratos. A atividade caseinolítica de A. hydrophila IBAer 109 mostra um típico comportamento de "quorum sensing", sendo induzida por gelatina e reprimida por glicose, citrato e amônio. O gene da elastatse (ahyB) de A. hydrophila ATCC7966 foi clonado e expresso em E. coli sob controle do promotor lac. O transformante apresentou bandas proteolíticas de 63 e 38 KDa no espaço periplasmático e extracelular, indicando maturação parcial e dificuldade de secreção desta enzima. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-29T18:00:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jucimar Zacaria.pdf: 849191 bytes, checksum: 9baac0dee3cdbd7a5567a40e82068fff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T18:00:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jucimar Zacaria.pdf: 849191 bytes, checksum: 9baac0dee3cdbd7a5567a40e82068fff (MD5) / Aeromonas are ubiquitous water-borne Gram-negative bacteria. Some species of this genus are opportunistic pathogens of a variety of aquatic and terrestrial animals, including humans. Several virulence determinants, such as enterotoxins, hemolysins and hydrolytic enzymes, have been implicated in their ability to cause diseases. Extracellular proteases may be regarded as important enzymes in the mechanisms that confer the metabolic versatility that allow Aeromonas to persist in aquatic habitats, to interact with other organisms, and to cause diseases. In this context, the objective of this work was to assess the extent of differences in extracellular proteases activity and electrophoretic profiles among Aeromonas strains, the substrate specificity among Aeromonas proteases, and the cloning and heterologous expression of Aeromonas elastase. The results showed that A. hydrophila has the highest proteolytic activity with no significant difference between clinical and environmental isolates. Protease zymograms of Aeromonas isolates showed different profiles with 0 to 5 bands, corresponding to metallo, serine and other proteases. Two proteases (56 KDa and 22 KDa) showed activity against a large spectrum of substrates. Caseinolytic activity of A. hydrophila IBAer 109 showed a typical "quorum sensing" behavior, and was induced by gelatin and repressed by glucose, citrate and ammonium. The elastase gene (ahyB) of A. hydrophila ATCC7966 was cloned and expressed in E. coli under the control of lac promoter. The transformant showed both periplasmic and extracellular proteolytic bands of 63 and 38KDa, indicating partial maturation and secretion difficulties.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas aquáticas. Algumas espécies deste gênero são patógenos oportunistas de muitos animais aquáticos e terrestres, inclusive o homem. Vários fatores de virulência, tais como enterotoxinas, hemolisinas e outras enzimas, tem sido associados com a sua patogenicidade. As proteases extracelulares devem ser vistas como importantes enzimas envolvidas na versatilidade metabólica que possibilitam as Aeromonas persistir nos ambientes aquáticos, interagir com outros organismos, e causar doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar: as diferenças nas atividades de proteases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados de Aeromonas, a especificidade por substratos de poteases de Aeromonas, e a clonagem e expressão heteróloga da elastase de Aeromonas. Os resultados mostraram que A. hydrophila apresenta maior atividade proteolítica, sem, entretanto exibir diferenças significativas entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas proteolíticos dos isolados de Aeromonas demonstraram diferentes perfis com 0 a 5 bandas, correspondendo a metalo, serino ou outras proteases. Duas proteases (56K Da e 22 KDa) apresentaram atividade sobre um grande espectro de substratos. A atividade caseinolítica de A. hydrophila IBAer 109 mostra um típico comportamento de "quorum sensing", sendo induzida por gelatina e reprimida por glicose, citrato e amônio. O gene da elastatse (ahyB) de A. hydrophila ATCC7966 foi clonado e expresso em E. coli sob controle do promotor lac. O transformante apresentou bandas proteolíticas de 63 e 38 KDa no espaço periplasmático e extracelular, indicando maturação parcial e dificuldade de secreção desta enzima. / Aeromonas are ubiquitous water-borne Gram-negative bacteria. Some species of this genus are opportunistic pathogens of a variety of aquatic and terrestrial animals, including humans. Several virulence determinants, such as enterotoxins, hemolysins and hydrolytic enzymes, have been implicated in their ability to cause diseases. Extracellular proteases may be regarded as important enzymes in the mechanisms that confer the metabolic versatility that allow Aeromonas to persist in aquatic habitats, to interact with other organisms, and to cause diseases. In this context, the objective of this work was to assess the extent of differences in extracellular proteases activity and electrophoretic profiles among Aeromonas strains, the substrate specificity among Aeromonas proteases, and the cloning and heterologous expression of Aeromonas elastase. The results showed that A. hydrophila has the highest proteolytic activity with no significant difference between clinical and environmental isolates. Protease zymograms of Aeromonas isolates showed different profiles with 0 to 5 bands, corresponding to metallo, serine and other proteases. Two proteases (56 KDa and 22 KDa) showed activity against a large spectrum of substrates. Caseinolytic activity of A. hydrophila IBAer 109 showed a typical "quorum sensing" behavior, and was induced by gelatin and repressed by glucose, citrate and ammonium. The elastase gene (ahyB) of A. hydrophila ATCC7966 was cloned and expressed in E. coli under the control of lac promoter. The transformant showed both periplasmic and extracellular proteolytic bands of 63 and 38KDa, indicating partial maturation and secretion difficulties.

Uma propriedade fundamental dos seres vivos é a condução de sinais elétricos através de seus tecidos. Mas esse fato pouco é lembrado quando se trata de organismos vegetais. Outro item fundamental é a geração de sinais que possam transmitir informações entre os tecidos e órgãos para um ajuste fino do metabolismo. Nas plantas esses sinais podem ser de natureza química, hidráulica e elétrica. Nesse último caso são conhecidos potenciais de ação (PA), de variação (PV), de ferimentos (WP) e sistêmicos (SP), cada um com sua particularidade quanto à amplitude, velocidade e rotas de propagação, bem como seu papel no metabolismo. Os sinais elétricos podem afetar a respiração, fotossíntese, absorção de água, ativação de genes e fechamento de folhas de plantas insetívoras. PAs podem se propagar com velocidade relativamente constante e sem decréscimo. Eles seguem a lei do tudo-ou-nada, ou seja, todo estímulo que desencadeia um PA deve atingir um limiar de excitação para desencadear o sinal. Assim que o limiar é atingido o sinal se autoperpetua ao passo que estímulos supra limiares desencadeiam PAs de amplitude constante. A via de propagação do PA é o vaso do floema. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a sinalização elétrica em resposta à irrigação em plantas de girassol sob déficit hídrico e caracterizar esse sinal quanto à amplitude, duração, velocidade e direção de propagação. Para tanto 37 plantas foram avaliadas por meio de eletrodos extracelulares. Elas foram monitoras eletrofisiologicamente durante um período em que eram irrigadas e em um período sob déficit hídrico. Desse montante, onze responderam à irrigação pela geração de potenciais de ação (PA), ou seja, 30% delas. Oito delas geraram PAs em direção ao ápice (propagação acrópeta) enquanto duas geraram na direção basípeta. Uma delas gerou nos dois sentidos. O PA foi gerado também pós-irrigação mesmo com a planta não tendo passado por déficit hídrico, porém só aconteceu em uma das onze plantas. Os sinais se propagaram no caule, pecíolo e nervura central das folhas. O potencial de ação é gerado após irrigação em plantas de girassol com maior frequência quando elas passam por período de déficit hídrico e se propagam por toda a planta. Isso evidencia o papel do PA na sinalização de longa distância nos vegetais. / A fundamental property in the leaving beings is the conduction of electrical signals through their tissues. However, this fact is not always remembered when it comes to plant organisms. Another key process is the generation of signals that can transmit information among tissues and organs to a fine-tuning of the metabolism. In plants, these signals can be chemical, hydraulic and electrical. Concerning the last one, action potentials (AP), variation potentials (VP), wound potentials (WP) and system potentials (SP) are known; each one with its particularity regarding amplitude, velocity and propagation routes as well as its role in metabolism. The electrical signals may affect respiration, photosynthesis, water uptake, activation of genes and leaf closure in insectivorous plants. APs can spread with relatively constant speed and no decrement. They follow the all-or-nothing law, in another words, every stimulus that triggers an AP must reach a threshold to trigger the signal. Once the threshold is reached, the signal is self-perpetuating while stimuli above threshold trigger APs with constant amplitude. The propagation path of the AP is the phloem vessel. The aim of this work was to evaluate the electrical signaling in response to irrigation in sunflower plants under water deficit and characterize the AP regarding its amplitude, duration, velocity and propagation direction. Thirty seven plants were analyzed using extracellular electrodes. They were electrophysiologically monitored during a period when irrigated and in a period under drought. Eleven plants generated AP after irrigation, i.e. 30%. Eight of them generated AP that propagated acropetally while two generated in basipetal direction. One generated in both directions. The action potential was also generated in a plant that was not under drought stress, however it just happened in one of the eleven plants. The signals propagated in the stem, petiole and midrib of the leaves. The action potential is generated after irrigation in sunflower plants more frequently when they go through a period of water deficit and propagate throughout the plant. This highlights the role of AP in long-distance signaling in plants.

This document refers to research whose main objective was to investigate the relationship among hydraulic, chemical and electrical signals in poor tomato plants ABA production. The document is organized into three chapters: The first chapter presents a detailed extracellular measurement protocol of electrical signals in plants and how to associate these measurements to determine gas exchange using the Infrared gas analyzer (IRGA) and turgor pressure using the patch clamp pressure probe (ZIM-probe). The second chapter refers to recording of the action potential generated spontaneously and evoked by electrical stimulation in ABA-deficient tomato, mutant sitiens. The final chapter presents the results for turgor pressure, gas exchange and electrical signals measurements in mutants notabilis and sitiens in the re-irrigated after a period of drought. The possible role of electrical signals in the plant signalling under stress conditions is discussed. The main conclusions related to chapters 1, 2 and 3 were: Measurement of extracellular electrical signals can be performed with gas exchange and turgor pressure measurements using IRGA ZIM-probe equipment; Electrical signals generated spontaneously in sitiens mutants propagate with amplitude and speed higher than in wild plants. Mutant is less responsive to electrical stimulation showing higher excitation threshold and longer refractory period than wild plants; The mutant plants are more responsive electrically to re-irrigation after drought than wild plants. The electrical signals precede changes in gas exchange in all genotypes, post irrigation. The ZIM-probe was not efficient to evaluate the turgor pressure in mutant plants under stress conditions, but is a promising tool for studies involving hydraulic and electrical signalling in wild plants. / O presente documento refere-se a pesquisa cujo principal objetivo foi investigar a relação entre sinais hidráulicos, químicos e elétricos em plantas de tomate deficientes da produção de ABA. O documento foi organizado em três capítulos: O primeiro capítulo apresenta um detalhado protocolo de medição extracelular de sinais elétricos em plantas e como associar estas medições a determinação de trocas gasosas usando o Analisador de gás por infravermelho (IRGA) e pressão de turgor usando a sonda de pressão (ZIM-probe). O segundo capítulo refere-se ao registro de potenciais de ação gerados espontaneamente e evocados por estímulo elétrico em tomateiro deficiente na produção de ABA, mutante sitiens. O último capítulo apresenta os resultados referentes a medições de pressão de turgor, trocas gasosas e sinais elétricos nos mutantes notabilis e sitiens, deficientes na produção de ABA reirrigadas após um período de déficit hídrico. O possível papel dos sinais elétricos na sinalização em plantas em condições de estresse é discutido. As principais conclusões referentes aos capítulos 1, 2 e 3 foram, respectivamente: As plantas mutantes são mais responsivas eletricamente a re-irrigação, após déficit hídrico com que as plantas selvagens. Medições extracelulares de sinais elétricos podem ser realizadas com medidas de trocas gasosas e pressão de turgor utilizando os equipamentos IRGA e ZIM-probe; Sinais elétricos gerados espontaneamente nos mutantes sitiens se propagam com amplitude e velocidade maiores do que nas plantas selvagens. sitiens é menos responsivo a estímulo elétrico do que plantas selvagens apresentando maior limiar de excitação e período refratário; Os sinais elétricos precedem as alterações nas trocas gasosas pós irrigação em todos os genótipos estudados. A sonda ZIM-probe não se mostrou eficiente para avaliar a pressão de turgor em plantas mutantes sob condições de estresse, mas para as plantas selvagens é uma ferramenta promissora para estudos envolvendo sinalização hidráulica e elétrica.

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_ErikaDurao_M.pdf: 3130433 bytes, checksum: a9b8f1b36ccecb2daf18896dac4b39fa (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Este traballio teve como objetivo isolar e selecionar linhagens potencialmente produtoras de goma presentes na cana-de-açúcar. Gomas são biopolimeros de origem vegetal (e.g., gomas guar, carragena) ou microbiana (e.g., gomas xantana, dextrana). As linhagens produtoras de goma do tipo dextrana são freqüentemente encontradas em amostras de cana deteriorada. A dextrana é um biopolimero constituído de unidades monoméricas de a-Dglicose. A enzima dextrana-sacarase, responsável por sua síntese, é extracelular e tem a sacarose com principal indutor. Na indústria farmacêutica é que a dextrana tem a sua maior aplicabilidade: a dextrana de baixa massa molecular é utilizada como substituto do plasma sanguíneo e facilitador do fluxo sanguíneo. O microrganismo Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, utilizado na maioria das indústrias produtoras de dextrana no mundo, serviu de referência para a seleção dos isolados. Para o isolamento, foram colhidas amostras de canade-açúcar deteriorada de 4 diferentes regiões e o caldo foi plaqueado em meio rico em sacarose, específico para produtores de goma. Colônias que apresentaram formação gomosa foram purificadas e estocadas em Litmus Milk a -15°C. Foram realizados ensaios em frascos agitados a 150 rprn, 28:tl°C por 12 horas para produção da enzima onde cada isolado foi incubado em meio contendo 5% de sacarose. A atividade enzimática do caldo centrifugado foi determinada medindo-se a velocidade de liberação de frutose. A goma foi produzida em meio contendo 15% de sacarose em frascos agitados a 150 rpm e 28:f:l°C por 15 horas. Etanol foi adicionado ao caldo bruto para precipitar a goma. As linhagens foram caracterizadas quanto à massa molecular média da dextrana produzida e à capacidade produtiva. A distribuição de massa molecular foi determinada por meio de cromatografia de permeação em gel (GPC). As análises de açúcares foram feitas em HPLC utilizando coluna de troca iônica com detecção por amperometria pulsada. Foram isolados cinqüenta e seis microrganismos e atividade enzimática foi evidenciada no caldo de vinte e oito linhagens. Destas, cinco foram selecionadas para produção e separação da goma. As atividades variaram de 33 a 131 UDS contra 49 UDS da linhagem referência nas condições do ensaio. Entre as cinco linhagens selecionadas, três são diplococos e produzem goma solúvel e duas são streptococos e produzem goma insolúvel. A análise de distribuição de massa molecular evidenciou que as linhagens selecionadas produzem goma de alta massa molecular, chegando a quase 2 milhões de Daltons / Abstract: The aim of this work was to isolate and select potentia1ly gum producing strains present in sugar cane. Guns are biopolymers carne 1Tom vegetal (e.g., guar gurn, carragen gum) or microbian (e.g., xantan gum, dextran gum) source. Dextran producing bacteria are 1Tequently found in damaged sugar cane. Dextran is a biopolymer that consists of a-Dglucose monomeric units. The enzyme dextransucrase, responsible for dextran synthesis, is extracellular and has sucrose as its main inductor. ln the pharmaceutical industry is where dextran has its larger applicability: low molecular weight dextran, clinical dextran, is used as blood-plasma substitute and blood flow improver. Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F strain, used in the majority of dextran producing industries around the world, was used as reference for the isolated microorganisms selection. Damaged sugar cane sarnples, :ITom four di:fferent regions, were used as the microorganisms isolation source and the cane juice was inoculated in a 10% sucrose solid medium. Strains that had presented gummy colony formation were purmed and maintained in Litmus Milk broth at -15°C. Assays were conducted for enzime production in Erlenmyer flasks on a rotatory shaker at 150 rprn, 28::tl°C for 12 hours where each isolated microorganism was incubated in a 5% sucrose medium. The enzymatic activity of the centrifugated broth was determined by measuring :fi:uctose production rate. Gum was produced in Erlenmyer flasks containing of 15% sucrose medium on a rotatory shaker at 150 rprn, 28::tl°C for 15 hours. Etanol was added to the crude broth for gum precipitation. The strains were characterized by the produced dextran average molecular weight and by the productive capacity. The molecular weight distribution was determined by gel permeation chromatography (GPC). The sugar determination analyses were made by HPLC using an ion exchange column with amperiometric detention. Fifty six microorganisms were isolated and enzymatic activity was found in centrifugated broth of twenty eight strains. From these, tive had been selected for gum production. The activities varied 1Tom 33 to 131 UDS against 49 UDS :ITom the reference strain in the assay conditions. Among the tive selected strains, three are diplococci and produce soluble gum and the other two are streptococci and produce insoluble gum. The molecular weight distribution analysis showed that the selected strains produce high molecular weight gurn, one ofthem reaching almost 2 million Daltons / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

Orientador: Fernando Broetto / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres / Banca: José Soares do Nascimento / Banca: Renato Mamede de C. Montini / Resumo: O cultivo de cogumelos comestíveis, em subprodutos energéticos, representa o principal exemplo da conversão direta de resíduos lignocelulósicos em um artigo com alto valor agregado, com benefício para o gênero humano e uma fonte de energia biosintética comercialmente importante. O objetivo do trabalho foi verificar a atividade de enzimas lignocelulolíticas do Lentinula edodes crescendo em resíduos agrícolas, utilizando-se três tipos de incubação: meio líquido, sistema estacionário e bioreator. As linhagens LE 95/17, LE 96/22 e Leax foram incubadas em substratos compostos de casca de arroz (CA), serragem de eucalipto (SE), bagaço de mandioca (BM) e bagaço de cana-de-açúcar (BC), suplementado com 20% de farelo de arroz e 1% de CaCO3. Foram avaliados a velocidade de crescimento miceliano e a atividade de enzimas oxidativas e hidrolíticas. As linhagens em meio de cultura líquido não apresentam atividades expressivas de manganês peroxidase e lacase. SE e BC, utilizados no sistema estacionário, mostraram ser os mais eficientes para as atividades de MnP, enquanto que para a atividade da lacase apenas SE. O sistema estacionário, em SE, foi melhor que o bioreator para atividade de enzimas hidrolíticas. O bagaço de mandioca pode ser uma alternativa viável como substrato, ou na forma de complemento à outros substratos, por propiciar um rápido crescimento miceliano. A lignina peroxidase não foi detectada em nenhum dos experimentos. / Abstract: The cultivation of mushrooms in by-products represents the main example of the direct conversion of lignocellulosic residues in an article with high attached value with benefit for the mankind and source of commercially important biosynthetic energy. The aim of this work was verify the activity of the Lentinula edodes lignocellulolitic enzymes growing in agricultural residues utilizing three kinds of incubation: liquid culture medium, solid static state and bioreactor. The LE 17/95, LE 22/96 and Leax strains were incubated in substrates composed of peel of rice (PR), eucalyptus sawdust (ES), cassava bagasse (CB) and sugar cane bagasse (SB), supplemented with 20% of rice brans and 1% of CaCO3. The mycelium growth velocity, the oxidative and hydrolytic enzymes activity were evaluated. The strains in liquid culture medium don't presented expressive activities of manganese peroxidase (MnP) and laccase. SE and BC utilized in solid static state system showed to be more efficient to MnP activity while laccase only SE. The solid static state system was better than bioreactor to hydrolytic enzymes activity in SE. The cassava bagasse can be a substrate alternative for having a fast mycelium growth. The lignin peroxidase was not detected in the experiments. / Doutor