El procés de regeneració permet als organismes refer parts o teixits del seu cos que han sofert algun dany. Els discs imaginals de Drosophila melanogaster, primordis larvaris de les estructures adultes, tenen capacitat de promoure processos de cicatrització i proliferació, regenerant el teixit i donant lloc a estructures adultes completament normals. Hem estudiat el perfil d’expressió de discs d’ala a 0, 24 i 72h de regeneració. Els resultats obtinguts mostren un enriquiment significatiu de l’expressió de Factors de Transcripció lligats a importants vies de senyalització com Wingless (Wg), Notch (N) i Jun N-terminal Kinasa (JNK). Mitjançant la cerca computacional de motius d’unió d’AP-1 (factor de transcripció de la via de la JNK) en els promotors dels gens amb canvis d’expressió, hem descrit els gens diana d’aquesta la via procés durant la regeneració. Entre aquests gens es troba cabut (cbt), l’expressió del qual augmenta durant les primeres 24h i disminueix a les 72h, recuperant els seus nivells basals. Hem confirmat aquests resultats per qRT-PCR i amb tècniques d’hibridació in situ, demostrant a més, que l’increment de l’expressió de cbt està associat a cèl•lules del blastema. També hem comprovat que l’expressió de cbt augmenta per sobreactivació de la via de la JNK en el disc d’ala, tal i com s’havia vist prèviament en embrió. Mitjançant la tècnica EMSA hem validat la unió in vitro de les proteïnes Jun i DFos (que formen el dímer AP-1) a la seqüència predita en el promotor del gen cbt confirmant la regulació directe de la via de la JNK. L’anàlisi de discs mutants per cbt indica que l’expressió d’aquest gen és necessària per al tancament de la ferida i proliferació durant la regeneració. Cabut (Cbt) és un factor de transcripció Zn finger de la família dels Krüpple like Factors i els seus ortòleg en vertebrats són els gens TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). Aquest gen s’ha descrit com a modulador de les vies Dpp i JAK/STAT en el disc d’ala. Una aproximació per descriure les funcions d’un factor de transcripció com Cbt és determinar els seus gens diana. Amb aquest objectiu hem realitzat un ChIP-Seq amb un anticòs contra la proteïna Cbt. Els resultats obtinguts mostren que Cbt es troba localitzat principalment als promotors dels gens. Aquest estudi ha reportat 2060 gens diana de Cbt en el disc d’ala. Les categories funcionals GO associades a aquest grup de gens són: Regulació de la transcripció, cicle cel•lular, desenvolupament dels discs imaginals i desenvolupament neuronal. També hem trobat un enriquiment en gens lligats a vies de senyalització com la JNK, Wg i N. L’anàlisi de les seqüències de les dianes de Cbt i altres estudis publicats apunten els factors Sin3A i GAF com a possibles cofactors de Cbt. Finalment hem analitzat el paper de Cbt en la regulació de la via de N, els resultats obtinguts mostren que Cbt regula positivament la via de N promovent el creixement i la formació del marge Dorso/Ventral del disc d’ala. Per tal d’establir quins factors de transcripció s’uneixen al promotor de cbt i regulen la seva expressió, hem realitzat un cribratge a gran escala utilitzant la tècnica de Yeast-One-Hybrid, que permet descriure la unió de factors de transcripció a una seqüència concreta. Hem obtingut factors de transcripció lligats al desenvolupament neural, a la segmentació i a la resposta immune amb capacitat d’unir-se al promotor de cbt. Aquestes dades no només ens donen informació sobre la regulació de Cbt sinó que també suggereixen la seva implicació en aquests processos. En conjunt el nostre treball mostra que Cbt regula el creixement i l’homeòstasi del disc d’ala durant el desenvolupament. I que quan es produeix un dany en aquest teixit l’expressió de Cbt incrementa, de manera depenent de la via de la JNK, per garantir la restauració del teixit perdut. / Regeneration is the ability to rebuild a body part that has been damaged or amputated. Drosophila imaginal discs are able to undergo wound healing and regenerative growth after ablation. Genome-wide expression profiling of regenerating wing discs at 0, 24 and 72 hours after fragmentation have revealed a significant enrichment of transcription factors and chromatin regulators. To identify JNK target genes among the differentially expressed genes we performed a computational search of AP-1 binding sites in the promoter regions of these gens. Among them we identified cabut (cbt), the Drosophila ortholog of TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). During regeneration cbt expression is induced between 0 and 24 and down-regulated between 24 and 72 hours, suggesting a tight and controlled mechanism of regulation. qRT-PCR and in situ hybridization experiments confirmed cbt expression changes and highlighted that cbt upregulation is associated to cells located in the blastema region. Moreover the analysis of regenerated cbt mutant discs demonstrated that cbt upregulation is required for wound healing and growth during regeneration. Cbt is a Zn finger transcription factor related to JNK and Dpp pathways, but few is known about its target genes. In order to identify Cbt target genes in development, we performed a Cbt ChIP-Seq analysis of wing discs from larvae III. This study reveal that Cbt is located mostly in the promoter regions of its target genes. We identified 2060 Cbt target genes which were related to functional categories such imaginal disc development, transcription regulation, neuron development or cell cycle. Furthermore several Cbt target genes were associated to signaling pathways like JNK, Wg or Notch (N). The analysis of cbt targets and previous reports pointed the factors GAF and Sin3A as a possible cofactors of Cbt. Finally, genetic interactions between cbt and N mutants demonstrated that Cbt regulates positively N signaling contributing to growth and Dorso/Ventral wing margin regulation. Although we have demonstrated that JNK is upstream of cbt, there is no much data available about cbt regulation in normal development. To approach this question we performed a high throughput Yeast-One-Hybrid screening that allowed us to defined factors that bind to cbt proximal promoter. The identified factors were related to immune response, neuron development and segmentation. Our results contributed to decipher cbt regulation network and suggested possible new roles for Cbt. In summary Cbt regulates growth and homeoastasis of wing disc during development. However in front of injury cbt is upregulated in a JNK dependent manner to ensure complete regeneration.

Regulation of transcription by Stress Activated Protein Kinases (SAPKs) is an essential aspect for adaptation to extracellular stimuli. In mammals, the activation of the p38 SAPK results in the regulation of gene expression through the direct phosphorylation of several transcription factors. However, how p38 SAPK regulates the proper gene expression program of adaptation to stress as well as the basic mechanisms used by the SAPK remains uncharacterized. The results displayed in this manuscript show that the p38 SAPK plays a central role in the regulation of gene expression upon stress, as up to 80% of the upregulated genes are p38 SAPK dependent. Moreover, we also observed that a specific set of genes were upregulated in response to each specific stimuli, and just a small set of genes were commonly up-regulated by several stresses, which involves mainly transcription factors. In addition, we observed that, to proper regulate gene transcription, the p38 SAPK is recruited to stress-induced promoters via its interaction with transcription factors. Additionally, p38 activity allows the recruitment of RNA polymerase II and the MAPKK MKK6 to stress-responsive promoters. The presence of active p38 SAPK at open reading frames also suggests the involvement of the SAPK in elongation. Altogether, the results showed in this manuscript establish the p38 SAPK as an essential regulator in the transcriptional response to stress, as well as define new roles for p38 in the regulation of transcription in response to stress. / La regulación de la transcripción por las Proteínas Quinasas activadas por Estrés (SAPKs) es un aspecto esencial para la adaptación a los estímulos extracelulares. En mamíferos, la activación de la SAPK p38 da lugar a la regulación de la expresión génica a través de la fosforilación de varios factores de transcripción. Sin embargo, cómo p38 SAPK regula el programa de expresión génica de adaptación al estrés así como los mecanismos utilizados por la SAPK permanece sin caracterizar. Los resultados presentados en este manuscrito muestran que p38 SAPK juega un rol central en la regulación de la expresión génica en respuesta a estrés, ya que hasta el 80% de los genes inducidos son dependientes de p38 SAPK. También observamos que en respuesta a cada tipo de estrés se induce un grupo de genes específicos, y sólo hay una pequeña respuesta de genes comunes a los diferentes tipos de estrés la cual engloba principalmente factores de transcripción. Además, hemos observado que para regular la transcripción, p38 se recluta a los promotores de respuesta a estrés a través de su interacción con factores de transcripción. Asimismo, la actividad de p38 permite el reclutamiento de la RNA Polimerasa II y de la MAPKK MKK6 a los promotores inducidos por estrés. La presencia de p38 activa en las regiones codificantes sugiere su participación durante la elongación. En conjunto, los resultados mostrados en este manuscrito establecen a p38 como un regulador esencial de la transcripción en respuesta a estrés, así como definen nuevas funciones de p38 en la regulación de la transcripción en respuesta a estrés.

En este trabajo de tesis doctoral se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar cómo las células eucariotas responden a nivel molecular y se adaptan eficazmente a cambios en la concentración osmótica del medio. Este hecho suscita gran interés en la industria de las fermentaciones; también en la agricultura, dado el creciente problema de salinidad de los suelos. Los resultados obtenidos a través de la utilización de técnicas bioquímicas y de biología molecular demuestran que en situaciones de estrés, las células de levadura ajustan sus niveles de ergosterol a través de la activación de una compleja cascada de regulación transcripcional. Este descubrimiento ha revelado nuevos datos que ayudan a entender mejor la homeostasis de esteroles. Este proceso es fisiológicamente similar al que ocurre en células de mamíferos, donde es fundamental mantener los lípidos a niveles óptimos, ya que alteraciones en los mismos pueden dar lugar a enfermedades como la obesidad, diabetes tipo 2 o arterioesclerosis. Por otra parte, muchas infecciones fúngicas en individuos inmunodeprimidos se tratan mediante el empleo de drogas que actúan sobre enzimas de la ruta de biosíntesis de ergosterol, lo que sostiene la relevancia del estudio de la regulación de la síntesis de este lípido de membrana. Por último, el análisis genómico mediante ensayos ChIP-Chip y ChIP-Seq de algunos de los principales reguladores implicados en la compleja respuesta a estrés osmótico, aporta nueva información para comprender cómo los organismos, a través de la evolución, han organizado diferentes -pero estrechamente vinculados- módulos de regulación para hacer frente rápidamente a situaciones de estrés. / Martínez Montañés, FV. (2010). Adaptación a estrés osmótico en Saccharomyces cerevisiae: Caracterización genómica de factores de transcripción involucrados y represión de la biosíntesis de ergosterol [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9311

Tesis por compendio / [ES] La longevidad de las semillas, o el tiempo durante el cual permanecen las semillas viables, es de gran importancia para la conservación de la biodiversidad, la agricultura y la economía. Además, el estudio de este parámetro puede contribuir a conocer mejor los mecanismos moleculares comunes a todos los organismos para prevenir el envejecimiento. Una de las principales estrategias de las semillas para ralentizar su envejecimiento consiste en detener su metabolismo, a través de su deshidratación. Otros mecanismos moleculares para evitar daños son el aislamiento frente al entorno a través de la cubierta de la semilla, y la producción de antioxidantes y otras moléculas para evitar el daño oxidativo, uno de los principales causantes del envejecimiento de las semillas. Los mecanismos de reparación mitigan parte del daño acumulado. El organismo modelo de plantas Arabidopsis thaliana brinda la oportunidad de la realización de estudios genómicos para el estudio de, en este caso, la longevidad de las semillas para descubrir nuevos factores genéticos y mecanismos moleculares determinantes. Este conocimiento servirá para entender mejor los procesos de deterioro de las semillas y que también será clave para aumentar la longevidad de estas. Mediante el uso de variedades naturales genotipadas de Arabidopsis thaliana y un estudio de asociación del genoma conocido como GWAS, seguido de estudios de genética reversa, se han identificado 12 nuevos genes relacionados con la longevidad de las semillas, relacionados con la protección del embrión, el control del daño oxidativo, y la permeabilidad de la cubierta de la semilla. El desarrollo de la cubierta de la semilla está determinado por factores de transcripción. Plantas mutantes en diversos factores de transcripción involucrados en el desarrollo de la cubierta de la semilla presentan una longevidad alterada. La sobreexpresión de los factores de transcripción AtHB25 y COG1 provoca que las semillas presenten una mayor longevidad debido a una incrementada deposición de poliésteres lipídicos. Estas barreras de poliésteres lipídicos son la cutícula, formada por cutina, y la suberina. Ambas participan positivamente en la protección del embrión frente al ambiente exterior. Estudios genómicos de ambos factores de transcripción han demostrado que AtHB25 regula directamente a enzimas biosintéticos de los monómeros de suberina y cutina, y COG1 regula la expresión de enzimas relacionados con la polimerización de poliésteres lipídicos y lignina. La regulación en la que participa AtHB25 es muy importante debido a la alta conservación de las secuencias genómicas y funciones de AtHB25 en angiospermas, y parece involucrado en la respuesta a bajas temperaturas. Por otra parte, COG1, que está involucrado en la percepción de luz, regula parte del desarrollo del tegumento externo a través de la regulación de AP2, un factor clave en el establecimiento de la identidad de tejido de este tegumento de la cubierta de la semilla, donde se localiza la suberina. AtHB25 y COG1 están involucrados en la adaptación de la longevidad de la semilla a través de señales ambientales como la temperatura y la luz, respectivamente, regulando la deposición de poliésteres lipídicos. / [CAT] La longevitat de les llavors, o el temps que romanen les llavors viables, es de gran importància per la conservació de la biodiversitat, l'agricultura i l'economia. A més a més, l'estudi d'aquest paràmetre pot contribuir a conèixer millor els mecanismes moleculars comuns a tots els organismes per prevenir l'envelliment. Una de les principals estratègies de les llavor per retardar el seu envelliment consisteix detenir el seu metabolisme, mitjançant la seua deshidratació. Altres mecanismes moleculars per evitar danys son el seu aïllament de l'entorn per mitjan de la coberta de la llavor, i la producció d'antioxidants i altres molècules per evitar el dany oxidatiu, un dels principal causants del envelliment de les llavors. Els mecanismes de reparació mitiguen part del dany acumulat. L'organisme model Arabidopsis thaliana brinda la oportunitat de la realització d'estudis genòmics per a l'estudi de, en aquest cas, la longevitat de les llavors per descobrir nous factors genètics y mecanismes moleculars determinants. Aquest coneixement servirà per entendre millor els processos de deteriorament de les llavor i serà clau per augmentar la longevitat d'aquestes. Mitjançant l'ús de varietats naturals genotipades d'Arabidopsis thaliana i un estudi d'associació del genoma conegut com GWAS, seguits d'estudis de genètica inversa, s'han identificat 12 nous gens relacionats amb la longevitat de les llavors, relacionats amb la protecció de l'embrió, el control del dany oxidatiu, y la permeabilitat de la coberta de la llavor. El desenvolupament de la coberta de la llavor està determinada per factors de transcripció. Plantes mutants a diversos factors de transcripció involucrats al desenvolupament de la coberta de les llavors presenten una longevitat alterada. La sobreexpressió dels factors de transcripció AtHB25 i COG1 provoca que les llavors presenten una major longevitat degut a una deposició de polièsters lipídics incrementada. Aquestes barreres de polièsters lipídics son la cutícula, formada per cutina, i la suberina. Ambdues participen positivament la protecció de l'embrió enfront de l'entorn exterior. Estudis genòmics d'ambdós factors de transcripció han demostrat que AtHB25 directament regula a enzims biosintètics dels monòmers de suberina i cutina i COG1 regula enzims relacionats amb la polimerització de polièsters lipídics i lignines. La regulació en la que participa AtHB25 es molt important degut a l'alta conservació de les seqüències genòmiques i funcions de AtHB25 en angiospermes, i parteix estar involucrat en la resposta a baixes temperatures. Per altra banda, COG1, que està involucrat en la percepció de la llum, regula part del desenvolupament del integument extern mitjançant la regulació de AP2, un factor clau en l'establiment de la identitat de teixit de aquest integument de la coberta de la llavor, on es localitza la suberina. AtHB25 i COG1 estan involucrats en l'adaptació de la longevitat de la llavor per mitjan de senyals ambientals com la temperatura i la llum, respectivament, regulant la deposició de polièsters lipídics. / [EN] Seed longevity, or period that seeds remain viable, is important for biodiversity conservation, agriculture and economy. In addition, the study of this parameter could ease the knowledge about molecular mechanisms common to all organisms to prevent aging. One of the main strategies of seeds to reduce their aging consists to stop their metabolism, through drying. Other molecular mechanisms to avoid damages are the isolation from the environment with the seed coat, and the production of antioxidants and other molecules to avoid oxidative damage, one of the main seed aging causes. Repair mechanisms relieve part of the accumulated damage. The model plant Arabidopsis thaliana provides the opportunity to carry out genomic studies for the research of, in this case, seed longevity to discover determinant genetic factors and molecular mechanisms. This will serve to better understand seed deterioration processes and it will be key to increase seed longevity. Using natural genotyped varieties of Arabidopsis thaliana and a genome-wide association study (GWAS) followed by reverse genetic studies, 12 new genes related to seed longevity have been identified. They are related to embryo protection, oxidative damage control, and seed coat permeability. Seed coat development is determined by transcription factors. Mutant plants in some transcription factors involved in the seed coat development present altered seed longevity. The over-expression of the transcription factors AtHB25 and COG1 resulted in seeds with increased longevity due to an increased lipid polyester deposition. These lipid polyesters barriers are the cuticle, formed by cutin, and the suberin layer. Both participate positively in the embryo protection from the external environment. Genomic studies of both transcription factors have revealed that AtHB25 directly regulates biosynthetic enzymes of suberin and cutin monomers, and COG1 regulates the expression of enzymes related to the polymerization of lipid polyesters and lignin. The regulation involving AtHB25 is crucial due to the high conservation of genomic sequences and functions of AtHB25 in angiosperms, and it seems to be involved in the response to low temperatures. On the other hand, COG1, which is involved in light perception, regulates part of the development of the external integument through its regulation by AP2, a key factor in establishing the tissue identity of this seed coat integument, where suberin is located. AtHB25 and COG1 are involved in seed longevity adaptation through environmental signals such as temperature and light, respectively, regulating lipid polyesters deposition. / Agradezco a las instituciones públicas la inversión en investigación. Gracias a ella, los laboratorios, el personal y los distintos equipos se han podido financiar. Gaetano fue quien me ayudó enormemente conseguir la beca FPI del Ministerio de Economía y Competitividad BES-2015-072096, asociada al proyecto de investigación nacional BIO2014-52621-R-AR / Renard Meseguer, J. (2021). Identification of genes related to seed longevity in Arabidopsis thaliana using genomic molecular techniques [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/170554 / Compendio