Sp1 i Sp3 pertanyen a la família de factors de transcripció Sp que controla la transcripció de gens implicats en gairebé tots els processos cel.lulars. Estudis previs al nostre grup van estudiar la regulació del promotor del gen Sp1 i van demostrar que la transcripció de Sp1 estava regulada principalment de forma positiva per Sp1 i NF-Y, i que Sp3 era capaç de contrarrestar l'activació produïda per Sp1 sobre el seu propi promotor. Donat que la relació Sp1/Sp3 a la cèl·lula és important per a la regulació dels gens diana, en aquest treball ens vam proposar estudiar la regulació del promotor de Sp3.Vam clonar una regió de 546 bp que corresponia al promotor de Sp3 i vam procedir a la seva caracterització. Sp3 presenta múltiples inicis de transcripció localitzats entre les posicions -132 i -70 respecte de l'inici de traducció i la seva màxima activitat promotora es localitza a la regió fins a -281bp respecte de l'inici de traducció. Mitjançant les tècniques de retardament de la movilitat electroforètica (EMSA) i Immunoprecipitació de la Cromatina (ChIP) hem demostrat la unió dels factors Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb i c-Jun al promotor de Sp3. D'altra banda hem estudiat l'efecte de la sobreexpressió i la inhibició d'aquestes proteïnes sobre l'activitat d'aquest promotor utilitzant assajos d'activitat luciferasa, i sobre els nivells endògens de mRNA utilitzant RT-Real Time-PCR. Sp3 activa la transcripció del seu propi promotor. El promotor de Sp3 també és activat de forma més potent per Sp1, Sp3 i NF-Y; tot i que NF-1, c-Myb, B-Myb, c-Jun i c-Fos també poden activar aquest promotor. Un altre fet remarcable és que E2F1 es comporta com a repressor del promotor de Sp3. Tots els resultats observats a nivell de l'activitat del promotor es van confirmar amb la mesura dels nivells endogens de mRNA per Sp3.Addicionalment, s'ha estudiat la interacció de Sp1 amb diferents proteïnes implicades en la regulació del cicle cel·lular i s'ha caracteritzat l'efecte de la seva sobreexpressió sobre l'activitat del promotor de Sp1, ja que està regulat per Sp1. Utilitzant un array d'anticossos, es va fer un cribatge de proteïnes que poguessin interaccionar amb Sp1, i algunes d'elles es van confirmar per co-immunoprecipitació. Això ens va permetre demostrar que Sp1 és capaç d'interaccionar amb CDK4, p21, SKP2 i BRCA2. Posteriorment, vam analitzar l'efecte d'aquestes i altres proteïnes que interaccionen amb Sp1 sobre el promotor de Sp1, i vam observar que el promotor de Sp1 és regulat de forma positiva per la sobreexpressió de CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 i Stat3; mentre que és reprimit per la sobreexpressió de p53 i NFB. Per tal d'analitzar si hi havia una correlació entre els efectes sobre el promotor de Sp1 i una alteració dels nivells endogens de Sp1, vam confirmar tots els efectes observats a nivell de l'activitat del promotor tot emprant la tècnica de RT-Real Time-PCR. A més, els efectes sobre el promotor de Sp1 es produeixen mentre aquestes proteïnes estan unides, directa o indirectament, al promotor tal com van demostrar els assajos de ChIP. També vam estudiar l'efecte de la sobreexpressió d'aquestes proteïnes sobre un promotor que només contenia caixes Sp1 i, en general, vam observar efectes equivalents als observats per al promotor de Sp1. La interacció entre Sp1-p21 va ser objecte d'estudi en més detall i vam determinar que l'expressió de p21 en cèl·lules de fibrosarcoma indueix el promotor de Sp1 així com els nivells de mRNA, però, al mateix temps, indueix la degradació de Sp1.Com a conclusió final, hem vist que el procés de transcripció és un mecanisme molt complex que involucra un gran número de factors de transcripció, així com d'altres proteïnes que puguin interaccionar amb aquests factors. / Sp1 and Sp3 belong to the Sp family of transcription factors that controls transcription of genes involved in almost all processes in the cell. We performed a detailed analysis of the promoter region of the Sp3 transcription factor, including the identification of its transcriptional start sites and the putative binding sites for transcription factors. Multiple transcriptional starts sites were located at position sranging from -70 to -132 relative to the translational start of the gene. We defined the minimal promoter region cooresponding to 281 bp relative to the translational start. Along the promoter sequence we demonstrated the binding of Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb and c-Jun. Moreover, we studied the effect of the overexpression or knocking down of these factors on the Sp3 promoter activity and the endogenous mRNA levels. Sp3 is positively autoregulated and it is also activated by Sp1, NF-Y, Myb, AP-1 and NF-1. On the contrary, Sp3 transcription is repressed by E2F/DP1 overexpression.Additionally, we studied the interaction of Sp1 with other proteins involved in the cell cycle regulation and we characterized the effect the overexpression of these proteins on the Sp1promoter activity, given that this promoter is regulated by Sp1. Sp1 is able to interact with CDK4, p21, SKP2 and BRCA2. The Sp1 promoter is positively regulated by the overexpression of CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 and Stat3 whereas the overepression of p53 and NFB represses the promoter. The effects of all these proteins were also analyzed at the Sp1 mRNA level and by using an artificial promoter containing only Sp1 binding sites. The interaction between Sp1 and p21 was further analyzed and we demonstrated that, in fibrosarcoma cells, p21 induces the Sp1 promoter and its mRNA expression but, at the same time, it induces the degradation of Sp1 protein.The process of transcription is a very complex mechanism that involves a great number of transcription factors and other proteins interacting with these factors.

El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de dos factores genéticos implicados en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales: Nolz1 e Ikaros. Además se ha estudiado el potencial de estos factores de transcripción en la diferenciación de células madre neurales in vitro hacia un fenotipo estriatal para entender mejor los mecanismos que regulan la aparición de este tipo de neuronas.Hemos demostrado que Nolz1 es un gen que interviene en la especificación de los precursores neurales de la SVZ de la eminencia ganglionar lateral (LGE), los llamados progenitores basales. Las células Nolz1 positivas provienen de precursores positivos para Gsh2, y su expresión contribuye a la aparición de la señalización de ácido retinoico en el núcleo estriado durante el desarrollo. Nolz1, además, regula la vía de Notch en precursores neurales i promueve la aparición de precursores oligodendrogliales mediante un mecanismo no autónomo en la LGE. Por otra parte, demostramos que la isoforma de Ikaros Ik1 es esencial para la correcta generación de las neuronas encefalinérgicas estriatales a partir de la diferenciación de precursores neurales Dlx2 positivos de la LGE. Mostramos que Ik1 es necessario para sacar de ciclo los precursores que formarán el núcleo estriado mediante el incremento de los niveles del inhibidor de ciclinas p21. En consonancia con esta observación, la falta de Ikaros durante el desarrollo, afecta la neurogénesis tardía en el estriado. Esto se traduce en que el animal deficiente de Ikaros presenta un núcleo estriado más pequeño debido a una disminución en el número de neuronas de proyección encefalinérgicas de la matriz. Así, Nolz1 e Ikaros intervienen en diferentes momentos del desarrollo estriatal, siendo el papel de Nolz1 anterior y centrado en el control de precursores neurales, y el de Ikaros algo posterior, centrado en la diferenciación de neuronas estriatales de proyección encefalinégicas / The main goal of this work has been the study of two genetic factors implied in the differentiation of the striatal GABAergic projection neurons: Nolz1 and Ikaros. Moreover, we have studied the potential of these transcription factors to direct the differentiation of neural stem cells in vitro towards a striatal phenotype, in order to understand some aspects of the generation of this kind of neurons.We have demonstrated that the action of Nolz1 is involved in the specification of the neural precursors which reside in the SVZ ol the lateral ganglionic eminencie (LGE), the so-called basal progenitors. The cells positive for Nolz1 come from Gsh2 positive neural precursors, and its expression contributes to the inititation of a source of retinoic acid signalling within the striatum during development. Nolz1, in addition, regulates the Notch pathway in neural precursors an promotes the appearance of oligodendrocyte precursors in the LGE by a non-autonomous mechanism. On the other hand, we demostrate that the Ikaros isoform Ik1 is essential for the correct generation of the striatal enkephalinergic neurons from the differentiation of Dlx2 positive neural precursors of the LGE. We show that Ik1 is necessary for the cell-cycle exit of the neural precursors which will populate the striatum by the increase of the cyclin inhibitor p21. According with this observation, Ikaros absence during development specifically affects late striatal neurogenesis.This is translated in the adult Ikaros deficient animal in a reduced striatum due to a reduced number of matrix enkephalinergic projection neurons. Thus, Nolz1 and Ikaros exhert its actions during different times in striatal development, being Nolz1 role earlier and focused in the control of neural precursors, and Ikaros role occurs later, focused in the differentiation of the enkephalinergic projection neurons.

Yeast cells are exposed to a wide variety of environment stresses, among them changes in the osmotic conditions. An osmolar upshift leads to fast loose of intracellular water, so living cells have developed mechanisms to counteract this lost. In Saccharomyces cerevisiae changes in the osmotic conditions are sensed by the HOG pathway. The HOG pathway is a MAPK signalling pathway and the functional homolog of the stress activated MAPK JNK MAPK and p38 present in mammals. Because there is a high degree of conservation of these cascades, the HOG pathway is a good model to study osmotic adaptation processes.Recent reports have shown that the Hog1 MAPK can regulate several processes such as cell cycle control, metabolic adaptation or regulation of gene expression.At the beginning of this work, the mechanisms by which the Hog1 MAPK was controlling gene expression were unclear because transcription factors under the control of the MAPK were not well characterized. Our goal was the identification of new transcription factors under the control of the MAPK. Therefore, we designed a genetic screen and selected clones from a multicopy genomic library that were able to induce the expression of Hog1 dependent genes in non stress conditions. One of these clones was the SMP1 gene. Smp1 encodes for a MEF2-like transcription factor. Its overexpression induced the expression of osmoresponsive genes such as STL1, whereas smp1 cells were defective in their expression. smp1 cells showed reduced viability upon osmotic shock. Smp1-Hog1 interaction was checked by coprecipitation. Moreover, Smp1 was phosphorylated upon osmotic stress in a Hog1-dependent manner and in vitro phosphorylation experiments showed that Hog1 phosphorylated Smp1 at the C-terminal region. This phosphorylation was important for Smp1 osmoadaptation functions.Moreover Hog1 was implicated in cell adaptability to stationary phase through Smp1.On the other hand, microarrays studies showed that HXT1 hexose transporter was upregulated upon an osmotic shock in a Hog1 dependent manner. Expression of the HXT1 gene, which encodes a low affinity glucose transporter in Saccharomyces cerevisiae, is induced in response to glucose by the general glucose induction pathway, involving the Snf3/Rgt2 membrane glucose sensors, the SCF-Grr1 ubiquitination complex and the Rgt1 transcription factor. In addition to the glucose signalling pathway, we have found that, regulation of HXT1 expression also requires the HOG pathway. Deletion of components on both pathways results in impaired HXT1 expression. Genetic analyses identified Sko1 as the transcription factor under the control of Hog1 that was modulating HXT1 expression.Our studies here have shown that both Smp1 and Sko1 are transcription factors under the control of the MAPK.

Las especies reactivas del oxígeno (ROS), superóxido (O2o-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y radical hidroxilo (OHo), se generan a partir de la reducción parcial del oxígeno molecular durante procesos metabólicos como la respiración o tras la exposición a ciertos agentes ambientales como las radiaciones UV. Estas ROS pueden reaccionar con biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA e inactivar su función, por lo que las células han desarrollado actividades enzimáticas que se encargan de mantener niveles no-tóxicos de estos oxidantes. Se llama estrés oxidativo a la situación en la cual se produce un incremento en la concentración intracelular de ROS como consecuencia de un aumento en la generación o una disminución en la degradación de las mismas. En respuesta a estrés oxidativo, la célula activa rutas de señalización y factores de transcripción específicos que activan la expresión de proteínas antioxidantes encargadas de reestablecer los niveles redox intracelulares y de reparar los desperfectos causados por estos oxidantes. La levadura Schizosaccharomyces pombe es un organismo modelo ideal para el estudio de las respuestas a estrés oxidativo en las células eucariotas ya que posee sensores específicos a estrés oxidativo como el factor de transcripción Pap1 (pombe AP-1-like) y rutas de respuesta global a estrés, como las descritas en las células de mamífero, que son activadas por diferentes tipos de estrés. En el centro de esta ruta de respuesta global a estrés se encuentra la MAPK (Mitogen-activated protein kinase) Sty1. El factor de transcripción Pap1, de localización citoplasmática basal, se acumula en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo. Este cambio de localización subcelular es debido a la inhibición del exporte nuclear dependiente de Crm1, aunque se desconocía el mecanismo molecular utilizado por este factor de transcripción para sensar y responder a oxidantes como H2O2 y dietilmaleto (DEM). Los resultados obtenidos indican que H2O2 oxida de forma reversible dos residuos de cisteína de Pap1 induciendo, seguramente, la formación de un puente disulfuro intramolecular, mientras que, DEM actúa como un agente alquilante que modifica de forma irreversible los residuos de cisteína del dominio C-terminal de Pap1. El gen que codifica para el factor de transcripción Pap1 fue aislado inicialmente como un gen que, en elevado número de copias, confería a las células un fenotipo de resistencia a ciertas drogas como estaurosporina. Esto es debido a que, tras acumularse en el núcleo en respuesta a estrés oxidativo, Pap1 activa la transcripción de genes implicados tanto en la respuesta antioxidante como en la resistencia a multidrogas. Todos aquellos genes que, al igual que pap1 fueron identificados por su implicación en la resistencia a multidrogas, codifican para proteínas que regulan la actividad del factor de transcripción Pap1. hba1 fue el único gen relacionado con resistencia a multidrogas, cuyo producto génico, una proteína con un dominio de unión a Ran (Ran-binding domain), Hba1, no había sido relacionado con la actividad de Pap1. Uno de los objetivos de mi trabajo experimental era el de determinar si Hba1 tenía un papel en la regulación de la actividad de Pap1. Nuestros resultados indican que la proteína Hba1, localizada en el nucleoplasma de la célula, participa en el exporte nuclear mediado por Crm1 de ciertas proteínas como el factor de transcripción Pap1 y la MAPK Sty1, aunque no de otras como la proteína PKI. Por ello, la pérdida de función de Hba1, por sobreexpresión o deleción del gen hba1, induce la localización nuclear constitutiva de Pap1 y Sty1 en ausencia de estrés. Esta localización nuclear de Pap1 es suficiente para la activación transcripcional de sus genes diana. Por lo tanto, el fenotipo de resistencia aumentada a multidrogas de las cepas en las que se ha perdido la actividad de la proteína Hba1, es debido a la acumulación de Pap1 en el núcleo en condiciones de no-estrés.

La caquexia es un síndrome frecuentemente asociado al crecimiento tumoral, así como también a otros estados patológicos como son sepsis, SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), diabetes, etc. La caquexia se caracteriza por una importante y progresiva pérdida de peso corporal debida principalmente a la desaparición de las reservas de grasa y a la disminución de masa muscular. Está acompañada también de anorexia, náuseas, astenia, debilidad, alteración de la homeostasis hormonal e inmunodepresión.Sobre los factores de transcripción que podrían estar involucrados en el proceso de desgaste muscular observado en la caquexia (in vivo), se sabe muy poco, pero aparecen algunos factores como posibles candidatos tanto en el desencadenamiento como en la regulación de este proceso. NF-kappa-B y AP-1 son dos factores de transcripción que están activados en distintos tejidos en procesos inflamatorios. Se ha descrito que NF-kappa-B y AP-1 tienen una regulación diferencial en músculo esquelético de rata durante el proceso de sepsis. El mismo grupo ha determinado que C/EBP, otro factor de transcripción involucrado en el proceso de inflamación, aumenta su actividad de unión al DNA en músculo de ratas sépticas, y que este proceso es dependiente de glucocorticoides.Los objetivos de este estudio son: 1) analizar la regulación de algunos factores de transcripción en el músculo esquelético durante la caquexia inducida por el crecimiento tumoral. 2) revertir el desgaste muscular asociado al crecimiento tumoral mediante estrategias basadas en factores de transcripción desde un punto de vista farmacológico. 3) aproximaciones a una terapia contra la caquexia mediante un adenovirus para la transferencia génica de un dominante negativo de AP-1. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el factor de transcripción AP-1 presenta una regulación diferencial en el músculo esquelético durante el crecimiento tumoral, lo que sugiere que este factor está implicado en el desarrollo de la caquexia asociada al cáncer. Por el contrario, otros factores de transcripción estudiados (NF-kappa-B, C/EBP y Sp-1) no parecen estar implicados directamente en el desarrollo del proceso caquéctico, al menos a nivel muscular. El factor miogénico MyoD presenta importantes cambios en sus niveles en el músculo esquelético de diferentes modelos experimentales de tumores caquécticos, así como en el músculo de pacientes con cáncer de páncreas. La administración aguda de LPS a ratas también afecta marcadamente los niveles musculares de MyoD. Estos datos sugieren una implicación de dicho factor en el desarrollo de la caquexia asociada al crecimiento tumoral y otros procesos patológicos. La administración de SP100030, inhibidor de NF-kappa-B y AP-1, logra revertir parcialmente los efectos asociados al crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Este efecto está asociado a una inhibición de la actividad de unión de AP-1 al DNA, un aumento en la expresión de MyoD, y una disminución en la proteólisis muscular. El tratamiento con GW1929, agonista de PPAR-gamma, induce una recuperación en el peso de los músculos extensor digitorum longus de ratones portadores de carcinoma pulmonar de Lewis, asociado a un restablecimiento de los niveles de MyoD. Este compuesto también induce una disminución en la proteólisis de estos músculos in vitro. La sobreexpresión de Tam67, dominante negativo de AP1, revierte totalmente los efectos causados por la adición de TNF-alfa al medio de cultivo de mioblastos C2C12 en diferenciación. Este efecto es producido por el restablecimiento del programa de diferenciación muscular, mediado por una disminución de ciclina D1, una recuperación de los niveles de MyoD y un aumento de la proteína MHC en estas células. La transferencia génica in vivo de dominante negativo de AP-1 Tam67 mediante adenovirus, produce una recuperación en el peso de los músculos y una atenuación en la caída de los niveles de MyoD en el músculo gastrocnemius de animales portadores de tumor. / (ENGLISH)One of the most common manifestation of advanced malignant disease is the development of cancer cachexia. Indeed, cachexia occurs in the majority of cancer patients before death, and it is responsible for the death of 22% of cancer patients. The abnormalities associated with cancer cachexia include anorexia, weight loss, muscle loss and atrophy, anemia and alterations in carbohydrate, lipid and protein metabolism. The degree of cachexia is inversely correlated with the survival time of the patient and it always implies a poor prognosis. Perhaps one of the most relevant characteristics of cachexia is that of asthenia (or lack of muscular strenght), which reflects the important muscle waste that takes place in the cachectic cancer patient. Asthenia is also characterized by a general weakness as well as physical and mental fatigue. In addition, lean body mass depletion is one of the main trends of cachexia and it involves not only skeletal muscle but it also affects cardiac proteins, resulting in important alterations in heart performance.Little is known about the transcription factors that may be involucrated in cancer cachexia at the level of skeletal muscle. Among the main candidates that could have a role in such pathological state are nF-kB abd AP-1. These two transcription factors have already been involucarted in skeletal muscle during sepsis. The objectives of the present study were: 1) to analyze the regulation of some transcription factors in skeletal muscle during cancer cacchexia. 2) reverse muscle wasting associated with tumour burden using strategies based on transcription factors. 3) to introduce an approximation to a therapy against cachexia based on the introduction of an adenovirus using the gene transfer of a dominant negative of AP-1.The results obtained clearly demonstrate that while AP-1 and Myo D are clearly associated with muscle wasting during cancer cachexia, others such as NF-kB,C/EBP and Sp-1 do not seem do be involved.Daily treatment of rats bearing the cachectic Yoshida AH-130 ascites hepatoma with the double inhibitor (NF-kB and AP-1) SP 100030 at a dose of 1 mg/kg of body weight resulted in a clear amelioration of the cachectic effect, especially at the level of skeletal muscle. Thus, tumour-bearing rats treated with SP100030 showed a significant recovery in the weights of gastrocnemius, EDL, tibialis and cardiac muscles. In addition, treatment with the inhibitor also affected both liver and kidney weights. The amelioration in muscle weight was accompanied by an increase in MyoD gene expression -the main transcription factor of muscle tissue involved in muscle differentiation-- in gastrocnemius muscle. At the dose used in this study SP 100030 was an effective inhibitor of AP-1, however, the nF-kB transcription factor was not affected. Interestingly, the effects of the inhibitor seem to be at the level of proteolysis since lower total proteolytic rates were found when incubating of isolated rat muscles in the presence of SP100030. Interestingly, the inhibitor influenced the gene expression of the E2 enzyme in skeletal muscle of tumour-bearing rats; this protein seems to be the main regulator of the activity of the main proteolytic system during cancer cachexia, the ubiquitin-proteasome system. In conclussion, treatment of cachectic tumour-bearing rats with SP 100030 results in an amelioartion of the muscle wasting effect suggesting that the AP-1 signalling cascade plays a very important role in the signalling of muscle wasting associated with disease.The aim of the overexpression of TAM-67 study was to investigate a possible role of the AP-1 signaling cacscade in the process of wasting associated with cancer cachexia at the level od skeletal muscle. Bearing this in mind, an experimental design involucrating adenoviral trasnduction of the TAM-67 protein -a blocker of the AP.1 protein was used in both in vivo and in vitro experimental setups. Interestingly, the injection of virus expressing the TAM-67 protein to tumour-bearing rats, resulted in a significat recovery of the muscle mass -which is dramatically reduced as a result of tumour burden--, therefore suggesting that AP-1 is certainly involved in the signalling associated with muscle protein accretion. Although, several mediators have been suggested for the muscle wasting associated with cancer cachexia, many investigations suggest an important role for TNF (Tumour Necrosis factor). Indeed, addition of TNF to C2C12 cells resulted in a decreased content of both MyoD and MHC. Interestingly, in this muscle cell system, it was also observed that blockage of the AP-1 signalling cascade buy means of adenovirus (containing TAM-67) infection resulted in an improvement in the amount of myofibrillar protein (MHC) following TNF treatment, therefore suggesting that AP-1 signalling is involved in the intraceellular action of the cytokine oin skeletal muscle. In fact, from the results presented here, it may be suggested that AP-1 is involved in skeletal muscle proliferation since blocking the trancription factor sems to lead to an increased differentiation. In conclussion, the gene therapy approach presented here clearly suggests an important role for AP-1 in muscle signalling during catabolic states and may constitute the basis for a future sucessful therapeutic approach.

El desenvolupament post-embrionàri dels insectes està controlat per dos hormones, les esteroidals i l’hormona juvenil (HJ). La 20-hidroxiecdisona (20E), és la principal hormona esteroidal dels insectes, indueix i controla el procés de la muda. En canvi, l’HJ determina la naturalesa d’aquesta muda. En presencia d’HJ, el pic de 20E produeix una muda entre estadis juvenils. En canvi, quan desapareix l’HJ, la 20E indueix una muda a l’estadi adult. A nivell molecular, la 20E actua mitjançant la unió a un heterodímer format per dos membres de la família dels receptors nuclears, el receptor d'ecdisona (EcR) i ultraespiracle (USP). El receptor activat inicia una cascada gènica de resposta a la 20E coneguda com a model d’Ashburner. Els gens activats per la 20E són principalment receptors nuclears, com ara E75, HR3, HR4 i Ftz-F1 i factors de transcripció, E74 o BR-C. Aquest via de senyalització ha estat àmpliament estudiada en insectes holometàbols com D.melanogaster, pel contrari, la caracterització dels mecanismes moleculars d'acció dels ecdisteroides en els insectes hemimetàbols, o de desenvolupament directe, és pràcticament inexistent. La caracterització de la funció i mecanismes d’acció d’aquestes hormones en insectes hemimetàbols permetrà entendre els canvis que s’han produït en aquestes vies que han permès l’evolució fins a una metamorfosi completa. La panerola Blattella germanica s'utilitza com a model per estudiar el desenvolupament, hemimetàbol. Prèviament, i amb l'objectiu d'estudiar la cascada gènica de resposta a la 20E a B. germanica, s'han clonat i caracteritzat els dos membres del receptor de la 20E en aquest insecte (BgEcR-A i BgRXR) i els receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1 i el factor de transcripció Br-C. Gràcies al silenciament de l'expressió gènica mitjançant RNAi in vivo s'han pogut estudiar les funcions d'aquests gens, i s'ha demostrat l’existència d’un eix gènic que regula els processos controlats per la 20E. En la present tesi doctoral s’ha clonat i caracteritzat l’últim gens primerenc que manca a B.germanica, el factor de transcripció E74. A més, també s’ha clonat i caracteritzat Seven Up, un receptor nuclear que regula la via de senyalització de la 20E en insectes holometàbols. Així, s’ha clonat dos isoformes d’E74 anomenades BgE74A i BgE74B i s’ha demostrat que són necessàries per tal que es produeixi correctament l’ècdisi. La interferència d’aquest factor durant la darrera fase nimfal produeix problemes greus en el desplegament de les ales i tegmines, en la integritat de les quetes i en les estructures d’adhesió i afecta el procés de pigmentació. L’enzim dopa decarboxilasa (BgDdc) està implicat en pigmentació i la seva interferència durant la sisena fase nimfal fa que emergeixin adults amb pigmentació més clara. BgE74 és necessari perquè BgDdc s’expressi correctament. S’han clonat dos isoformes del receptor nuclear Seven up: BgSvpA i BgSvpB. Les seves funcions no són redundants. BgSvpB regula la síntesi d’HJ en els corpora allata durant l’estadi adult de B.germanica a traves de la regulació de dos gens claus de la via, BgHMG-S i BgHMG-R. A més, BgSvpB és necessari per al desenvolupament dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. La interferència del receptor nuclear produeix una clara disminució en la divisió cel•lular dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. Aquestes dues funcions de BgSvpB s’ha demostrat que són independents. / In insects, post-embryonic development is under the control of ecdysteroids and juvenile hormones. At the molecular level, 20-hydroxyecdysone (20E) acts through binding to its receptor, a heterodimer of the ecdysone receptor (EcR) and Ultraspiracle (USP). Both proteins belong to the nuclear receptor family. Once 20E binds to its receptor, activates a subset of genes that mediate and amplify the hormonal response. The mechanism of action of ecdysteroids in hemimetabolan insects is poorly understood. To study at the molecular level the 20E response, the Ecdysone receptor (BgEcR-BgRXR), and the nuclear receptors, BgHR3, BgFTZ-F1, BgHR4 and E75A-D of the hemimetabolan insect Blattella germanica have been cloned and characterized using RNAi in vivo. Here, first we report the cloning of two isoforms of E74 from the hemimetabolous direct developing insect Blattella germanica, namely BgE74A and BgE74B. Although BgE74 knockdown nymphs ecdysed properly into adults, they all showed clear deficiencies in the extension of the fore- and hindwings, as well as malformations in their leg bristles and locomotor structures. In addition to the described morphological abnormalities, all BgE74 knockdown nymphs that molted into adults presented defects in the cuticle pigmentation. The expression of BgDdc, an enzyme involved in insect cuticle pigmentation, was reduced in the BgE74 knockdowns. Secondly, we have cloned and characterized two isoforms of Seven-up, another nuclear receptor involved in 20E response in Drosophila, and named them BgSvpA and BgSvpB. Surprisingly, using RNAi in vivo we show that BgSvpB is not related with 20E action but is necessary to produce juvenile hormone (JH) in the corpora allata during the adult stage, through the regulation of two key enzims of JH biosynthesis, BgHMG-S and BgHMG-R. Moreover, BgSvpB is required for cell proliferation of the corpora allata during nymphal development.

En los insectos, las diferentes transiciones que se producen a lo largo del desarrollo, tanto embrionario como post-embrionario, se encuentran reguladas por pulsos de ecdisteroides, en particular por la 20 hidroxiecdisona (20E). Esta señal se transduce mediante factores de transcripción de la família de los receptores nucleares, en concreto, la 20E se une al heterodímero formado por el receptor de la ecdisona (EcR) y el producto del gen ultraespiraculo (USP) y, una vez unida, activa una pequeña serie de genes tempranos, que, a su vez, amplifican esta señal mediante la inducción de los denominados genes tardíos que controlan la respuesta biológica a la hormona. Dentro de esta cascada génica, cabe destacar el eje funcional formado por los receptores nucleares EcR-HR3-FTZ F1 el cual interviene en la coordinación de las mudas larvarias, así como en el inicio de la metamorfosis en Drosophila melanogaster. Es importante subrayar que no se conoce si la jerarquía de factores nucleares inducidos por la 20E también existe y opera en insectos más primitivos con un desarrollo hemimetábolo como es nuestro insecto modelo Blattella germanica. En la presente tesis doctoral iniciamos la caracterización del eje funcional EcR-HR3-FTZ F1 en el dictióptero Blattella germanica. Así pues, hemos llevado a cabo el clonaje de los ortólogos de los receptores nucleares HR3 y FTZ-F1 en B. germanica obteniendo tres isoformas de HR3 (BgHR3 A, BgHR3 B1 y BgHR3 B2) y dos de FTZ F1 (BgFTZ F1A y BgFTZ F1B). Hemos caracterizado los patrones de expresión de estos transcritos y del receptor de la ecdisona (BgEcR A), que se había clonado previamente en nuestro laboratorio, en las dos últimas fases ninfales así como durante la embriogénesis de B. germanica. Además, analizamos el papel regulador que estos receptores nucleares desempeñan durante el desarrollo ninfal de B. germanica, y especialmente en el proceso de la muda. Para ello, hemos utilizado la técnica del RNA de interferencia (RNAi) in vivo mediada por la inyección intraabdominal de RNAs de doble cadena (dsRNA) de cada uno de los genes a estudiar. Cuando estos dsRNAs eran inyectados en hembras recién emergidas a sexto estadio ninfal, la mayoría de las ninfas interferidas no eran capaces de completar la écdisis y morían transcurridas 24-48 h. El análisis fenotípico de estos individuos mostró que presentaban duplicación de las estructuras de origen ectodérmico y que presentaban alteraciones en los niveles de ecdisteroides hemolinfáticos. No obstante, un cierto porcentaje de las ninfas tratadas con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 eran capaces de completar la muda imaginal, esto nos permitió estudiar procesos que se ven afectados por estos dos factores de transcripción durante la vida adulta. Los individuos interferidos con dsBgEcR A que mudaban a adulto presentaban claros defectos en la extensión de los dos pares de alas, por su parte, las ninfas tratadas con dsBgFTZ F1 también presentaban alas mal posicionadas, aunque correctamente extendidas. El segundo fenotipo observado en todos los individuos tratados con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 que mudaban a adulto es que la glándula protorácica no degeneraba. Ampliamos el análisis funcional de cada uno de los receptores nucleares que estamos analizando, BgEcR A, BgHR3 y BgFTZ F1 al periodo embrionario de B. germanica. El análisis de los embriones interferidos para BgEcR A y BgFTZ F1 mostró que estos individuos progresaron hasta las 48 h de desarrollo embrionario, presentando, sin embargo, considerables malformaciones que impidieron su posterior desarrollo. Mientras que aquellos que eran silenciados para BgHR3, que fueron capaces de progresar hasta las 96 h de desarrollo, presentaron defectos en el desarrollo de la región cefálica, desde un nivel poco severo en el que únicamente se apreció una cierta reducción o pérdida de los lóbulos cefálicos hasta embriones que presentaban la pérdida de todos los segmentos cefálicos. / Ecdysteroids control molting in insects. The active form of ecdysteroids, 20 hydroxyecdisone (20E), exerts its function through the activation of a small set of transcription factors. In turn, these genes induce the expression of a larger set of other genes that control the biological response to the hormone. The orphan nuclear receptors EcR, HR3 and FTZ F1 have been shown to act as crucial members of the 20E-regulatory hierarchy in coordinating molting in the holometabolous insects Drosophila melanogaster and Manduca sexta. However, little is known on the role of these factors on primitive insects. Here, we report the cloning and characterization of BgHR3 and BgFTZ F1 in the hemimetabolous species Blattella germanica. Moreover, we use in vivo RNAi mediated by double-strand RNA (dsRNA) treatment to define BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during molting in B. germanica. When dsRNAs were injected at the beginning of the last larval instar, treated larvae had normal appearance and movements until the end of the instar. However, by the molting time most of them did not molt, became motionless and became arrested. Phenotypic analysis reveal that treated specimens had two pairs of mouth appendages, double tubular tracheae and produce a new cuticle. Moreover, the dsBgHR3-treated animals have higher ecdysteroids levels, whereas those of dsBgEcR A and dsBgFTZ F1-treated are lower than controls. Some of the nymphs treated with dsBgEcR A and dsBgFTZ F1 progressed through a complete molting. Interestingly, these knockdowns showed defects in wing extension and the prothoracic gland did not degenerated. Also, we have studied BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during B. germanica embryogenesis. Using RNAi parental we found that dsBgEcR-A and dsBgFTZ-F1 treated animals progress up to the 12% of development and resulted in germ bands showing severe phenotypes. While, those interfered with dsBgHR3 could progress up to the 25% of development but they shown defects in the cephalic regions which ranged in severity from reduction or loss of cephalic lobes to the complete loss of the cephalic segments.

El procés de regeneració permet als organismes refer parts o teixits del seu cos que han sofert algun dany. Els discs imaginals de Drosophila melanogaster, primordis larvaris de les estructures adultes, tenen capacitat de promoure processos de cicatrització i proliferació, regenerant el teixit i donant lloc a estructures adultes completament normals. Hem estudiat el perfil d’expressió de discs d’ala a 0, 24 i 72h de regeneració. Els resultats obtinguts mostren un enriquiment significatiu de l’expressió de Factors de Transcripció lligats a importants vies de senyalització com Wingless (Wg), Notch (N) i Jun N-terminal Kinasa (JNK). Mitjançant la cerca computacional de motius d’unió d’AP-1 (factor de transcripció de la via de la JNK) en els promotors dels gens amb canvis d’expressió, hem descrit els gens diana d’aquesta la via procés durant la regeneració. Entre aquests gens es troba cabut (cbt), l’expressió del qual augmenta durant les primeres 24h i disminueix a les 72h, recuperant els seus nivells basals. Hem confirmat aquests resultats per qRT-PCR i amb tècniques d’hibridació in situ, demostrant a més, que l’increment de l’expressió de cbt està associat a cèl•lules del blastema. També hem comprovat que l’expressió de cbt augmenta per sobreactivació de la via de la JNK en el disc d’ala, tal i com s’havia vist prèviament en embrió. Mitjançant la tècnica EMSA hem validat la unió in vitro de les proteïnes Jun i DFos (que formen el dímer AP-1) a la seqüència predita en el promotor del gen cbt confirmant la regulació directe de la via de la JNK. L’anàlisi de discs mutants per cbt indica que l’expressió d’aquest gen és necessària per al tancament de la ferida i proliferació durant la regeneració. Cabut (Cbt) és un factor de transcripció Zn finger de la família dels Krüpple like Factors i els seus ortòleg en vertebrats són els gens TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). Aquest gen s’ha descrit com a modulador de les vies Dpp i JAK/STAT en el disc d’ala. Una aproximació per descriure les funcions d’un factor de transcripció com Cbt és determinar els seus gens diana. Amb aquest objectiu hem realitzat un ChIP-Seq amb un anticòs contra la proteïna Cbt. Els resultats obtinguts mostren que Cbt es troba localitzat principalment als promotors dels gens. Aquest estudi ha reportat 2060 gens diana de Cbt en el disc d’ala. Les categories funcionals GO associades a aquest grup de gens són: Regulació de la transcripció, cicle cel•lular, desenvolupament dels discs imaginals i desenvolupament neuronal. També hem trobat un enriquiment en gens lligats a vies de senyalització com la JNK, Wg i N. L’anàlisi de les seqüències de les dianes de Cbt i altres estudis publicats apunten els factors Sin3A i GAF com a possibles cofactors de Cbt. Finalment hem analitzat el paper de Cbt en la regulació de la via de N, els resultats obtinguts mostren que Cbt regula positivament la via de N promovent el creixement i la formació del marge Dorso/Ventral del disc d’ala. Per tal d’establir quins factors de transcripció s’uneixen al promotor de cbt i regulen la seva expressió, hem realitzat un cribratge a gran escala utilitzant la tècnica de Yeast-One-Hybrid, que permet descriure la unió de factors de transcripció a una seqüència concreta. Hem obtingut factors de transcripció lligats al desenvolupament neural, a la segmentació i a la resposta immune amb capacitat d’unir-se al promotor de cbt. Aquestes dades no només ens donen informació sobre la regulació de Cbt sinó que també suggereixen la seva implicació en aquests processos. En conjunt el nostre treball mostra que Cbt regula el creixement i l’homeòstasi del disc d’ala durant el desenvolupament. I que quan es produeix un dany en aquest teixit l’expressió de Cbt incrementa, de manera depenent de la via de la JNK, per garantir la restauració del teixit perdut. / Regeneration is the ability to rebuild a body part that has been damaged or amputated. Drosophila imaginal discs are able to undergo wound healing and regenerative growth after ablation. Genome-wide expression profiling of regenerating wing discs at 0, 24 and 72 hours after fragmentation have revealed a significant enrichment of transcription factors and chromatin regulators. To identify JNK target genes among the differentially expressed genes we performed a computational search of AP-1 binding sites in the promoter regions of these gens. Among them we identified cabut (cbt), the Drosophila ortholog of TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). During regeneration cbt expression is induced between 0 and 24 and down-regulated between 24 and 72 hours, suggesting a tight and controlled mechanism of regulation. qRT-PCR and in situ hybridization experiments confirmed cbt expression changes and highlighted that cbt upregulation is associated to cells located in the blastema region. Moreover the analysis of regenerated cbt mutant discs demonstrated that cbt upregulation is required for wound healing and growth during regeneration. Cbt is a Zn finger transcription factor related to JNK and Dpp pathways, but few is known about its target genes. In order to identify Cbt target genes in development, we performed a Cbt ChIP-Seq analysis of wing discs from larvae III. This study reveal that Cbt is located mostly in the promoter regions of its target genes. We identified 2060 Cbt target genes which were related to functional categories such imaginal disc development, transcription regulation, neuron development or cell cycle. Furthermore several Cbt target genes were associated to signaling pathways like JNK, Wg or Notch (N). The analysis of cbt targets and previous reports pointed the factors GAF and Sin3A as a possible cofactors of Cbt. Finally, genetic interactions between cbt and N mutants demonstrated that Cbt regulates positively N signaling contributing to growth and Dorso/Ventral wing margin regulation. Although we have demonstrated that JNK is upstream of cbt, there is no much data available about cbt regulation in normal development. To approach this question we performed a high throughput Yeast-One-Hybrid screening that allowed us to defined factors that bind to cbt proximal promoter. The identified factors were related to immune response, neuron development and segmentation. Our results contributed to decipher cbt regulation network and suggested possible new roles for Cbt. In summary Cbt regulates growth and homeoastasis of wing disc during development. However in front of injury cbt is upregulated in a JNK dependent manner to ensure complete regeneration.