Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340472.pdf: 1604573 bytes, checksum: 6d68448ac93a65d0247f15b3195119bd (MD5) Previous issue date: 2016 / O plano de ensino e a metodologia pedagógica são alicerces para um curso de graduação. No entanto, parece existir um débito nas instituições brasileiras em relação a esses dois pilares. A Farmacologia sendo uma ciência dinâmica que estuda como o fármaco interage com o corpo humano, é umas das mais importantes disciplinas na formação do profissional na farmacoterapia. O propósito deste estudo é identificar e atualizar os conteúdos do plano de ensino e avaliar a metodologia pedagógica empregada na disciplina de Farmacologia do curso de graduação em Farmácia da UFSC. Para esta investigação foram utilizados questionários aplicados aos profissionais, que atuam na farmacoterapia, e aos discentes da disciplina de Farmacologia do curso de Farmácia nos semestres 2015/1 e 2 com o objetivo de definir o perfil atual do plano de ensino da disciplina. Em adição, testes de progresso para avaliar a metodologia pedagógica foram utilizados na disciplina, que atualmente utiliza uma adaptação da aprendizagem com base em problemas. Os resultados obtidos sugerem, 1) aumentar a ênfase nos assuntos Antibióticos, Farmacologia Gastrointestinal e Contraceptivos; 2) atualizar os assuntos abordados no plano de ensino da disciplina como Geriatria, Obesidade e Dermatologia; 3) diminuir a distância entre a disciplina Fisiologia, pré requisito para a Farmacologia. A pesquisa conclui ainda sobre a necessidade de melhor acompanhamento e investimento nas metodologias pedagógicas e planos de ensino condizentes com as necessidades atuais da saúde brasileira. <br> / Abstract : The teaching plan and the pedagogical methodology are pillars for an undergraduate program. However, there seems to be a debt in the Brazilians institutions in relation to these two pillars. These pillars must be strong, as foundation, as well as flexible to the constant updates of the market and adaptations in the learning methodology. The pharmacology being a dynamic science which studies the way the drug interacts with the human body, is one of the most important disciplines in the professional formation at pharmaceutics care. The purpose of this research is to identify, to adequate and to update the content of the teaching plan and the pedagogical methodology developed in the discipline of pharmacology of the undergraduate program in Pharmacy at UFSC. For this research surveys were applied to professionals that work at the pharmaceutical care and to students of the discipline of Pharmacology the undergraduate program Pharmacy in the first and second semesters of the year 2015, aiming to define the current profile of the teaching plan of the discipline and progress tests to measure the pedagogical methodology used at the discipline, which currently utilizes the methodology of problematization and the Problem-Based Learning (PBL). The obtained results suggest, 1) to improve the study about Antibiotics, Gastrointestinal Pharmacology and Contraceptives; 2) to update the matters covered at the teaching plan such as Geriatrics, Obesity and Dermatology and 3) to reduce the distance between the discipline Physiology, prerequisite to Pharmacology. The research concludes the necessity of better monitoring and investments on the pedagogical methodologies and teaching plans suited to the current needs of Brazilians health.

Orientador : Claudio da Cunha / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / Pacientes com Doença de Parkinson apresentam prejuízos sensoriais, motores e cognitivos devido à degeneração dos neurônios dopaminérgicos da substância negra que projetam para o estriado. Estudos anteriores relatam que ratos com lesão bilateral parcial da Substância Negra parte compacta apresentam prejuízos no aprendizado de hábito e na memória de trabalho visuo-espacial, mas não apresentam anormalidades motoras. No presente estudo, ratos com lesão total na substância negra parte compacta esquerda e direita (SNpc-L e SNpc-R, respectivamente) induzidas por 6-hidroxidopamina foram testados no labirinto radial de 7 braços. Neste modelo, os animais são liberados do braço de saída com o objetivo de correr para um dos braços iluminado a fim de encontrar a recompensa (comida). Ambos os ratos SNpc-L e SNpc-R apresentaram prejuízo nas tarefas de aprendizado de hábito e memória de trabalho quando comparados aos animais do grupo sham. Eles também apresentaram um viés ao entrar na arena central do labirinto realizando uma rotação ao lado da lesão. Quando o braço iluminado estava localizado do lado oposto à lesão eles apresentaram uma tendência a fazer voltas para corrigir a direção para entrar no braço iluminado. Na maioria das vezes que os ratos SNpc-L se deparava com o braço iluminado localizado ao lado direito, eles escolheram entrar no braço não iluminado localizado a dois braços à esquerda do iluminado. A propensão oposta simétrica foi observada para os ratos SNpc-R quando o braço iluminado estava localizado em seu lado esquerdo. Estes resultados sugerem que o labirinto radial de sete braços é sensível para medir anormalidades motoras, sensoriais e perceptuais, assim como déficits na memória de hábito e de trabalho observados nestes ratos semilesionados na SNpc e que possivelmente pode servir de modelo para estudo das anormalidades similares que ocorrem em pacientes com doença de Parkinson. / Parkinson’s disease patients are known to present sensory, motor, and cognitive impairments, most of them due to the degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra that projects to the striatum. Previous studies reported that rats with partial bilateral lesions of the SNpc present habit learning and visuospatial working memory impairments but do not present gross motor abnormalities. In the present study, rats with almost total loss of the left or right substantia nigra pars compacta (SNpc-L or SNpc-R, respectively) induced by 6-hydroxidopamine were tested in the 7-arm radial maze task. In this task the animals are left in one of the arms to run to a lighted arm in order to find a food reward. Both SNpc-L and SNpc-R rats presented poor scores in habit learning and in a working memory test of this task, compared to sham-operated animals. They also presented a bias to enter the central arena of the maze making a turn to the side of the lesion. When the lighted arm was located on the side of the arena that was opposite to the animals’ lesion, they tended to make turns that corrected the direction of their paths to the side of the lighted arm. Most times that the SNpc-L rats faced a lighted arm located to their right side, they chose to enter an unlighted arm located two arms to the left of the lighted one. The symmetrically opposite bias was observed for the SNpc-R facing a lighted arm located to their left side. These results suggest that the 7-arm radial maze task is sensible to measure possible motor and/or sensory perceptual abnormalities as well as habit and working memory deficits observed in these hemilesioned SNpc rats and that it possibly models similar abnormalities that occur in Parkinson’s disease patients.

Made available in DSpace on 2018-04-20T12:03:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000488663-Texto+Completo-0.pdf: 2662669 bytes, checksum: 73c86d6d555c94d57c1f0714b5c2ccbc (MD5) Previous issue date: 2018 / Tuberculosis (TB), caused mainly by Mycobacterium tuberculosis, is an infectious disease responsible for a significant number of deaths worldwide. IQG-607 is an analog of isoniazid (INH). According to several experiments carried out by our research group, IQG-607 showed both in vitro and in vivo anti-TB activity. Initial studies showed that the compound INCT-TB551 (a quinoline derivative) also presents in vitro anti-TB activity. The aim of this study was to develop analytical methods by high performance liquid chromatography (HPLC-UV) for quantification of IQG-607 and INCT-TB551 in mice plasma, and therefore to perform pharmacokinetic studies. The analytical method for the determination of IQG-607 in mice plasma showed linearity (r = 0.9992) in 0.5– 50 μg/mL concentration range. Intra- and inter-day precision was < 15%, and the recovery ranged from 92.07 to 107.68%, showing that the method provides a precise and accurate analysis of the compound. In addition, IQG-607 was stable in plasma for at least 30 days at −80 °C, and after plasma processing, for 4 h in the auto-sampler (6 ºC) and maintained on ice (recovery > 85%). The applicability of the method for pharmacokinetic studies was determined after intravenous (i.v.) and oral (fasted and fed conditions) administrations to mice. IQG-607 levels in plasma were quantified at time points for up to 2.5 h. A short half-life (t1/2) (1.14 h), a high clearance (CL) (3.89 L/h/kg), a moderate volume of distribution at steady state (Vdss, 1.22 L/kg), were observed after i.v. (50 mg/kg) administration. Similar results were obtained for oral administration (250 mg/kg) under fasted and fed conditions. The oral bioavailability (F), approximately 4%, was not altered by feeding.Plasma protein binding was 88.87 ± 0.9%. Recently, experiments in mice infected with M. tuberculosis have shown that the compound INCT-TB551 has no in vivo activity, unlike previous in vitro activity studies. An analytical method was developed for the determination of INCT-TB551 in mice plasma to assess compound absorption, if any, after oral administration. The analytical method presented linearity from 0.1-10 μg/mL (r = 0.9999). After development of the analytical method, the compound was orally administered in mice and the plasma levels were quantified at time points for up to 1 h. The compound INCT-TB551 was detected in the plasma of animals, which indicated that INCT-TB551 was absorbed. Although absorbed when orally administered, the compound is not exhibiting activity against M. tuberculosis in this animal model. This finding may be associated with the formation of inactive metabolites and/or the plasma concentration of INCT-TB551 achieved may be inadequate to exert its therapeutic effect. However, these points require further investigations. The protocols described here may serve as support to initiate pharmacokinetic studies of promising compounds, collaborating to advance in earlier stages of drug development. / A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, responsável por um número considerável de mortes em todo o mundo. O composto IQG-607 é um análogo da isoniazida (INH) que, de acordo com diversos experimentos realizados pelo grupo de pesquisa envolvido no seu estudo, apresenta atividade anti-TB in vitro e in vivo. Estudos iniciais do mesmo grupo demonstraram que o composto INCT-TB551 (um derivado quinolínico) também apresenta promissora atividade anti-TB. O objetivo deste estudo foi desenvolver metodologias analíticas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV) para a quantificação do composto IQG-607 e do INCT-TB551, em plasma de camundongos, para a realização de estudos de farmacocinética. O método analítico para a determinação do composto IQG-607 em plasma de camundongos apresentou linearidade (r = 0.9992) na faixa de 0.5–50 μg/mL. Os valores de precisão intra e interensaio (CV < 15%) e de recuperação (92.07-107.68%) demonstram que o método é preciso e exato para a análise do composto. Além disso, o IQG-607 se mostrou estável no plasma por até 30 dias, quando armazenado no freezer -80 °C, e estável após o tratamento da amostra do plasma, por até 4 horas (h) na bancada (gelo) e no autosampler do equipamento (6 °C). A aplicabilidade do método analítico para o estudo de farmacocinética foi determinada após a administração i.v. e oral em camundongos (animais em jejum e animais alimentados). As concentrações plasmáticas de IQG-607 foram quantificadas por até 2,5 h após a administração nos animais.Quando administrado pela via i.v. foi observado um tempo de meia vida (t1/2) curto (1,14 h), elevado clearance (CL) (3,89 L/h/kg), e um moderado volume de distribuição (Vdss) (1,22 L/kg). Resultados similares foram obtidos após a administração oral (250 mg/kg) em camundongos que estavam em jejum ou alimentados. A biodisponibilidade oral (F) foi de aproximadamente 4 %, valor que não foi alterado pela alimentação. A taxa de ligação a proteínas plasmáticas do IQG-607 é de aproximadamente 88 ± 0.9%. Experimentos recentes em camundongos infectados com M. tuberculosis demonstraram que o composto INCT-TB551 não apresentou atividade neste modelo in vivo, ao contrário dos estudos de atividade in vitro realizados anteriormente. Um método analítico para a determinação do composto INCT-TB551 em plasma de camundongos foi desenvolvido para avaliar se o composto estava sendo absorvido após a administração oral. O método analítico apresentou linearidade na faixa de 0.1-10 μg/mL (r = 0.9999). Após o método ter sido padronizado, o composto foi administrado por via oral em camundongos, e as concentrações plasmáticas foram quantificadas por até 1 h após a administração. O composto INCT-TB551 foi detectado no plasma dos animais, indicando que estava sendo absorvido. Apesar de absorvido quando administrado por via oral, o composto não está apresentando atividade contra M. tuberculosis neste modelo animal, o que pode estar relacionado, por exemplo, com a formação de metabólitos inativos e/ou ainda, o nível plasmático atingido pode ser inadequado para que o composto consiga exercer o seu efeito terapêutico, e isto precisa ser melhor investigado. Os protocolos apresentados neste trabalho poderão servir como suporte para estudos de farmacocinéticoa de compostos que se apresentam promissores, colaborando para o avanço nas etapas necessárias para o desenvolvimento de possíveis fármacos.

Orientador: Oswaldo Vital Brazil / Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-22T02:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neder_AntonioCarlos_LD.pdf: 1427123 bytes, checksum: 32d51c37818fbd27317236e5f854e836 (MD5) Previous issue date: 1970 / Resumo: No presente trabalho foi investigada a atividade do metampireno sobre as pressões intraocular (P.I.O.), arterial e venosa, em 33 cães anestesiados pelo pentobarbital sódico (30 mg/kg).Em outros 12 procedeu-se a determinação da concentração de sódio e potássio no humor aquosa e no plasma. 0 metampireno foi injetado por via venosa, em doses de 50 a 200 mg/kg e as experiências se prolongaram até 1 hora após a sua administração. 0 metampireno nao alterou a pressão arterial. Causou diminuição significante das pressões venosa e intraocular. A intensidade tanto 'da hipotensão ocular come da venosa foram diretamente proporcionais à dose utilizada. Foram estabelecidas as equações de regressão dose-efeito em relação a pressão arterial e venosa. 0 metampireno não causou alterações dos teores de sódio e potássio no humor aquoso e no plasma. 0 metampireno não causou modificações da pressão intraocular decorrentes de sua osmolalidade / Abstract: This action of varied doses (50 to 200 mg/kg) of methampyrone, on the arterial, venous and intraocular pressure of 33 dogs anesthetized with pentabarbital sodium (30 mg/kg) was measured during one hour after drug was given intravenously. Methampyrone influence on sodium and potassium concentration of the aqueous humor was determined on another lot of 12 dogs under the same onditions. Progressive falls on the venous and ocular tensions were detected as a function of increased doses of the drug upper to the maximum dosB used. On the other hand, variation on arterial pressure and intraocular pressure (as a function of osmolality) was not detected / Tese (livre-docencia) - Univer / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Livre-Docente em Odontologia

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / O principal enfoque desta pesquisa direcionou-se no sentido de isolar uma substÃncia com forte poder convulsivante, presente nas secreÃÃes obtidas das glÃndulas parotÃides do sapo Bufo paracnemis, Lutz, determinar sua estrutura quÃmica e realizar estudos farmacolÃgicos centrais deste composto. AtravÃs de processos de fracionamento, utilizando o sistema de cromatografia lÃquida de alta eficiÃncia (HPLC), acoplado a uma coluna preparativa C-18 de fase reversa (shim-pack prep. ODS 2,5 x 30 cm), obtivemos essa substÃncia pura em grandes quantidades. Sua estrutura quÃmica foi elucidada atravÃs da tÃcnica de RessonÃncia MagnÃtica Nuclear. Trata-se de um esterÃide cardiotÃnico, um BufadienolÃdeo, contendo um anel esterÃide clÃssico, acoplado a um grupo lactÃnico, denominado Marinobufogenina (14beta -15beta - epoxi - 3beta - 5beta-dihidroxi - 20, 22 - bufadienolÃdeo). Nossos resultados, baseados em anÃlise comportamental e eletrogrÃfica, mostraram efeitos centrais induzidos pela administraÃÃo sistÃmica de Marinobufogenina em ratos e em camundongos. Os animais apresentaram severos efeitos neutÃxicos, tais como movimentos circulares, automatismos gustatÃrios, taquipnÃia, clonias de cabeÃa e de patas, tremores, convulsÃes tÃnico-clÃnicas generalizadas, status epilepticus e morte. A DL50 de Marinobufogenina foi de 10,5 Â1,5 mg/kg para camundongos e de 25,0  2,0 mg/kg para ratos, ambos por via intraperitoneal. A administraÃÃo de Marinobufogenina tambÃm foi efetiva atravÃs de outras vias (subcutÃnea, oral, endovenosa, intramuscular). A forte atividade convulsivante dessa substÃncia à dose-dependente e doses de 5,0 mg/kg para camundongos e de 20,0 mg/kg para ratos , ambos por via intraperitoneal, jà evidenciam alteraÃÃes comportamentais que evoluem para convulsÃes tÃnico-clÃnicas generalizadas, acompanhadas do registro eletroencefalogrÃfico que apresenta descargas epilÃpticas no cÃrtex e hipocampo. Marinobufogenina induziu o aparecimento de crises convulsivas culminando em status epilepticus que persistiu por mais de uma hora. Observou-se uma reduÃÃo das convulsÃes em aproximadamente 80% dos animais tratados com Diazepam (10,0 e 12,5 mg/kg, i.p.), enquanto no registro eletroencefalogrÃfico as crises epilÃpticas permaneceram em alguns dos animais submetidos a esse tratamento. O Fenobarbital (50 mg/kg, i.p.) nÃo bloqueou as crises comportamentais induzidas por Marinobufogenina . A FenitoÃna foi capaz de reverter as convulsÃes tÃnico-clÃnicas generalizadas em todos os animais do grupo, sugerindo uma aÃÃo atravÃs de envolvimento na alteraÃÃo de cÃtions monovalentes. Estudos bioquÃmicos e eletrofisiolÃgicos mais aprofundados deverÃo ser realizados para confirmar essa hipÃtese. Nossos resultados sugerem que a Marinobufogenina pode constituir-se numa ferramenta farmacolÃgica para o desenvolvimento de um modelo experimental de epilepsia, uma vez que preencheu requisitos importantes, tais como : i) demonstrou a presenÃa de atividade epileptiforme nos registros eletroencefalogrÃficos; ii) as crises convulsivas foram bloqueadas por anticonvulsivantes como o Diazepam e FenitoÃna, requisito essencial para a avaliaÃÃo do efeito de novas drogas a serem utilizadas no tratamento da epilepsia. / The main focus of this research was the isolation of a substance with a strong convulsant action from the secretions of the toad Bufo paracnemis, Lutz, parotid glands, determination of its chemical structure and its behavioral and electrographic effects on central nervous system. This substance was purified in large amounts using a reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC), with a C-18 preparative column (shim-pack prep. ODS 2,5 x 30 cm). Its chemical structure was elucidated using high resolution Nuclear Magnetic Resonance analysis, allowing its identification as a steroid of the bufodienolide type, already known in the literature as Marinobufagin (14beta-15beta-epoxy-3beta,5beta-dihidroxy-20,22-bufadienolide). Our results based on behavioral and electrographic analysis showed central effects induced by systemic administration of Marinobufagin in rats and mice. The animals presented severe neurotoxic effects as circle-like movements, tachypnea, mild tremor of the head , a whole body tremor , myoclonic movements of the fore or hindlimbs, tonic-clonic seizures and death. Marinobufagin DL50 was 10.5  l.5 mg/kg for mice and 25.0  2.0 mg/kg for rats, both through intraperitoneal injection. This strong convulsant activity is dose-dependent and 5.0 mg/kg doses for mice and 20.0 mg/kg for rats, both intraperitoneal (IP), already showed behavioral changes that evolved to generalized tonic-clonic seizures. Marinobufagin induced seizures that ended up in status epilepticus that lasted more than an hour. Seizures decreased in almost 80% of the animals treated with Diazepan (10.0 and 12.5 mg/kg, IP) even though some of these animals continued to show seizures in the electrographic recordings. Phenobarbital didnât block seizures induced by Marinobufagin. Phenitoin was able to block generalized tonic-clonic seizures in all animals of the group, suggesting an action involving changes in monovalent cations. Our results suggest that Marinobufagin could represent a pharmacological tool for the development of an epilepsy experimental model, since it had fulfilled the following requirements: i) showed epileptiform activity in electrographic recordings; ii) seizures were blocked by anticonvulsant drugs such as Diazepan and Phenitoin, an essential requirement for the evaluation of the effects of new drugs to be used in epilepsy treatment.

O presente trabalho teve como objetivo comparar fármacos utilizados como antihistamínicos na terapêutica de patologias alérgicas em pequenos animais. O modelo empregado foi órgão isolado in vitro (íleo de Cavia porcelus), o qual permitiu avaliar as variáveis farmacológicas DE50, Emáx, pD2, pD’2 e pA2. Comparamos as ações produzidas em curvas concentração-efeito para histamina e acetilcolina frente a diferentes concentrações de clemastina e pirilamina. Difenidramina foi empregada como controle. Os resultados permitiram confirmar que os dois fármacos atuaram efetivamente como antihistamínicos no íleo isolado de Cavia porcelus. O principal efeito foi de antagonismo competitivo, porém, em concentrações maiores, apresentaram efeito não-competitivo e perderam a especificidade aos receptores da histamina. A clemastina com pA2 de 8,63 foi 10 vezes mais potente do que a pirilamina (pA2 = 7,61) como anti-histamínico, mas também apresentou significativo (P<0,05; ANOVA, Bonferroni) efeito anticolinérgico, o qual não foi observado com a pirilamina. Entretanto, em concentrações mais elevadas, ambos apresentaram efeito anticolinérgico por mecanismo não-competitivo: clemastina a partir de 10-7 mol/L e pirilamina com 10-5 mol/L, resultando em pD’2 de 5,66 e 5,36; respectivamente. Da comparação com difenidramina, concluiu-se que a clemastina foi cerca de 10 vezes mais potente no efeito competitivo enquanto a pirilamina foi menos potente. Quanto ao componente não-competitivo, a clemastina foi mais eficaz que a difenidramina enquanto a pirilamina foi menos eficaz. Se os efeitos obtidos com a clemastina e pirilamina no íleo isolado também se observarem quando empregados na terapêutica, in vivo, é de se esperar que a clemastina apresente mais efeitos adversos (anticolinérgicos) do que a pirilamina.

O presente trabalho teve como objetivo comparar fármacos utilizados como antihistamínicos na terapêutica de patologias alérgicas em pequenos animais. O modelo empregado foi órgão isolado in vitro (íleo de Cavia porcelus), o qual permitiu avaliar as variáveis farmacológicas DE50, Emáx, pD2, pD’2 e pA2. Comparamos as ações produzidas em curvas concentração-efeito para histamina e acetilcolina frente a diferentes concentrações de clemastina e pirilamina. Difenidramina foi empregada como controle. Os resultados permitiram confirmar que os dois fármacos atuaram efetivamente como antihistamínicos no íleo isolado de Cavia porcelus. O principal efeito foi de antagonismo competitivo, porém, em concentrações maiores, apresentaram efeito não-competitivo e perderam a especificidade aos receptores da histamina. A clemastina com pA2 de 8,63 foi 10 vezes mais potente do que a pirilamina (pA2 = 7,61) como anti-histamínico, mas também apresentou significativo (P<0,05; ANOVA, Bonferroni) efeito anticolinérgico, o qual não foi observado com a pirilamina. Entretanto, em concentrações mais elevadas, ambos apresentaram efeito anticolinérgico por mecanismo não-competitivo: clemastina a partir de 10-7 mol/L e pirilamina com 10-5 mol/L, resultando em pD’2 de 5,66 e 5,36; respectivamente. Da comparação com difenidramina, concluiu-se que a clemastina foi cerca de 10 vezes mais potente no efeito competitivo enquanto a pirilamina foi menos potente. Quanto ao componente não-competitivo, a clemastina foi mais eficaz que a difenidramina enquanto a pirilamina foi menos eficaz. Se os efeitos obtidos com a clemastina e pirilamina no íleo isolado também se observarem quando empregados na terapêutica, in vivo, é de se esperar que a clemastina apresente mais efeitos adversos (anticolinérgicos) do que a pirilamina.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:25:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451791-Texto+Completo-0.pdf: 11131527 bytes, checksum: 73b1d535d96f83c30dd5fb46e7f2af5d (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. Despite 50 years of available drug treatments, TB continues to cause considerable mortality worldwide. The TBHIV co-infection and the emergence of multidrug and extensively-resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Advances in the identification of new TB drug targets have been driven by the availability of the genome sequence of M. tuberculosis H37Rv, and include elucidation of the role played by proteins of essential biochemical pathways for mycobacterial growth. Inosine Monophosphate Dehydrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) catalyzes the penultimate and rate-limiting step in guanine nucleotide biosynthesis, the oxidation of inosine 5’-monophosphate (IMP) to xanthosine 5’- monophosphate (XMP), with concomitant reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to NADH. This reaction controls the guanine nucleotide pool and IMPDH inhibitors are used as immunosuppresive, anticancer, and antiviral agents. Recently, IMPDH from M. tuberculosis (MtIMPDH) has gained attention as a promising anti-mycobacterial target, associated with a number of distinct inhibitor scaffolds. In the present work, the guaB2- encoded MtIMPDH has been cloned, expressed and purified to homogeneity. The recombinant MtIMPDH has a subunit molecular weight of 54,775 Da and Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES) and Flame Atomic Absorption Spectroscopy (FAAS) identified a K+ ion per subunit. Glutaraldehyde cross-linking analysis suggests that MtIMPDH predominates as a tetramer. Steady-state kinetics showed that MtIMPDH optimal activity is dependent on the presence of a monovalent cation, mainly K+. Initial velocity and product inhibition patterns suggested a steady-state ordered Bi Bi kinetic mechanism in which IMP binds first followed by NAD+, and hydride transfer is not the ratelimiting step in the MtIMPDH catalyzed reaction. In addition, NAD+ substrate inhibition implies that product release is ordered, with NADH released first. The pH-rate profile indicated one deprotonated group essential for catalysis and that groups with pK values of 7. 5 and 9. 0 are important for NAD+ binding. The data presented here are discussed in light of the kinetic and structural information available for IMPDHs investigated to date and should inform us on how to better design inhibitors targeting this enzyme. Additionaly, a vital part of drug development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this regard, we have performed site-directed mutagenesis by gene replacement in order to evaluate the importance of the guaB2 gene for mycobacteria growth. Our results suggest that this gene is essential for M. tuberculosis H37Rv in vitro growth, and the confirmation of gene essentiality will point out the guaB2-encoded IMPDH as a potential drug target. Data resulting from enzyme’s characterization and gene replacement were the starting point for MtIMPDH inhibitors planning, selection and testing. A compound was identified as promising lead molecule, with Ki values in nanomolar range and it was characterized as noncompetitive and uncompetitive inhibitor towards MtIMPDH substrates NAD+ and IMP, respectively. MtIMPDH characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for TB treatment. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the biology of M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient therapeutic strategies, aiming TB control. / A tuberculose (TB) permanece entre as principais causas de morte por doenças infectocontagiosas e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Apesar de existirem tratamentos disponíveis há mais de 50 anos, a TB é responsável por causar altas taxas de mortalidade em todo o mundo. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e têm estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Avanços na identificação de novos alvos para drogas contra a TB têm sido possíveis graças ao sequenciamento do genoma do M. tuberculosis H37Rv e incluem a elucidação da função de proteínas envolvidas em rotas bioquímicas essenciais para o crescimento micobacteriano. A enzima Inosina Monofosfato Desidrogenase (IMPDH, EC 1. 1. 1. 205) é uma enzima chave na biossíntese de nucleotídeos de purina, pois participa de uma etapa limitante na síntese de novo de nucleotídeos de guanina, a partir de inosina 5’-monofosfato (IMP). Ela catalisa a oxidação de IMP a xantosina 5’-monofosfato (XMP), com concomitante conversão de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) à sua forma reduzida, NADH. Essa reação controla os níveis de nucleotídeos de guanina e inibidores da IMPDH têm sido utilizados como agentes imunossupressores, anticâncer e antivirais. Recentemente, a IMPDH de M. tuberculosis (MtIMPDH) foi descrita como um alvo antimicobacteriano promissor e inibidores desta enzima têm sido reportados. Neste trabalho, foi realizada a clonagem da região codificante do gene guaB2, a expressão e a purificação da proteína MtIMPDH. A MtIMPDH recombinante apresentou uma massa molecular média de 54. 775 Da e a análise através de Espectroscopia de Absorção Atômica em Chama (FAAS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES) identificou um íon K+ por subunidade. Os experimentos de reação cruzada, utilizando glutaraldeído, mostraram que a MtIMPDH pode existir como um tetrâmero em solução. Os estudos de cinética em estado estacionário revelaram que a atividade catalítica da MtIMPDH é dependente de cátions monovalentes, principalmente K+.Os estudos de velocidade inicial e inibição pelos produtos sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo cinético sequencial Bi Bi ordenado, no qual o IMP associa-se primeiramente à MtIMPDH, seguido pela ligação do NAD+, e que a transferência do hidreto não é a etapa limitante da reação catalisada pela enzima em estudo. Além disso, a inibição pelo substrato NAD+ indica que a liberação dos produtos é ordenada, onde o NADH é o primeiro produto a ser liberado. Os estudos de perfil de pH indicaram que a desprotonação de um grupamento com valor de pK em torno de 8,2 é essencial para a atividade catalítica da MtIMPDH e, que aminoácidos cujas cadeias laterais possuem valores de pK próximos de 7,5 e 9,0 estão envolvidos na ligação ao NAD+. Os dados aqui apresentados são discutidos com base em estudos cinéticos e estruturais disponíveis de IMPDHs de diferentes organismos e podem auxiliar no desenvolvimento de compostos inibidores para a enzima em estudo. Além disso, a identificação de genes essenciais para o crescimento bacteriano representa uma etapa importante no desenvolvimento de drogas. Assim, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida por substituição gênica, a fim de avaliar a importância do gene guaB2 no crescimento do M. tuberculosis H37Rv. Nossos resultados sugerem que este gene é essencial para o crescimento in vitro do M. tuberculosis H37Rv e a confirmação da essencialidade permitirá a validação do produto deste gene como um alvo para inibidores. Os dados obtidos a partir da caracterização cinética da enzima e da substituição gênica representaram o ponto de partida para o planejamento, seleção e testes de possíveis inibidores da MtIMPDH. Entre os compostos químicos sintetizados, um deles apresentou valores de Ki na faixa de nanomolar e apresentou perfis de inibição não-competitivo e incompetitivo em relação aos substratos NAD+ e IMP, respectivamente. A caracterização da MtIMPDH e os resultados preliminares de inibição desta enzima representam passos cruciais no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da TB. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre o metabolismo do M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas objetivando o controle da TB.

O presente trabalho teve como objetivo comparar fármacos utilizados como antihistamínicos na terapêutica de patologias alérgicas em pequenos animais. O modelo empregado foi órgão isolado in vitro (íleo de Cavia porcelus), o qual permitiu avaliar as variáveis farmacológicas DE50, Emáx, pD2, pD’2 e pA2. Comparamos as ações produzidas em curvas concentração-efeito para histamina e acetilcolina frente a diferentes concentrações de clemastina e pirilamina. Difenidramina foi empregada como controle. Os resultados permitiram confirmar que os dois fármacos atuaram efetivamente como antihistamínicos no íleo isolado de Cavia porcelus. O principal efeito foi de antagonismo competitivo, porém, em concentrações maiores, apresentaram efeito não-competitivo e perderam a especificidade aos receptores da histamina. A clemastina com pA2 de 8,63 foi 10 vezes mais potente do que a pirilamina (pA2 = 7,61) como anti-histamínico, mas também apresentou significativo (P<0,05; ANOVA, Bonferroni) efeito anticolinérgico, o qual não foi observado com a pirilamina. Entretanto, em concentrações mais elevadas, ambos apresentaram efeito anticolinérgico por mecanismo não-competitivo: clemastina a partir de 10-7 mol/L e pirilamina com 10-5 mol/L, resultando em pD’2 de 5,66 e 5,36; respectivamente. Da comparação com difenidramina, concluiu-se que a clemastina foi cerca de 10 vezes mais potente no efeito competitivo enquanto a pirilamina foi menos potente. Quanto ao componente não-competitivo, a clemastina foi mais eficaz que a difenidramina enquanto a pirilamina foi menos eficaz. Se os efeitos obtidos com a clemastina e pirilamina no íleo isolado também se observarem quando empregados na terapêutica, in vivo, é de se esperar que a clemastina apresente mais efeitos adversos (anticolinérgicos) do que a pirilamina.

L’insorgenza di fenomeni coinvolti nello sviluppo della farmacoresistenza costituisce al momento la principale causa di mancata risposta al trattamento chemioterapico nell’osteosarcoma. Questo è in parte dovuto ad una sovraespressione di diversi trasportatori ABC nelle cellule tumorali che causano un aumento dell’efflusso extracellulare del chemioterapico e pertanto una ridotta risposta al trattamento farmacologico. L'oncogene C-MYC è coinvolto nella resistenza al metothrexate, alla doxorubicina e al cisplatino ed è un fattore prognostico avverso, se sovraespresso al momento della diagnosi, in pazienti affetti da osteosarcoma. C-MYC è in grado di regolare l'espressione di diversi trasportatori ABC, probabilmente coinvolti nella resistenza ai farmaci nell’osteosarcoma, e questo potrebbe spiegare l’impatto prognostico avverso dell’oncogene in questo tumore. L’espressione genica di C-MYC e di 16 trasportatori ABC, regolati da C-MYC e / o responsabili dell'efflusso di diversi chemioterapici, è stata valutata su due diverse casistiche cliniche e su un pannello di linee cellulari di osteosarcoma umano mediante real-time PCR. L'espressione della proteina è stata valutata per i 9 trasportatori ABC risultati più rilevanti.Infine l'efficacia in vitro di un inibitore, specifico per ABCB1 e ABCC1, è stata valutata su linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 e ABCC1 sono i trasportatori più espressi nelle linee cellulari di osteosarcoma. ABCB1 è sovraespresso al momento della diagnosi in circa il 40-45% dei pazienti affetti da osteosarcoma e si conferma essere un fattore prognostico avverso se sovraespresso al momento della diagnosi. Pertanto ABCB1 diventa il bersaglio di elezione per lo sviluppo di strategie terapeutiche alternative, nel trattamento dell’osteosarcoma, atte al superamento della farmacoresistenza. L’inibizione dell'attività di tale trasportatore causa un aumento della sensibilità al trattamento chemioterapico nelle linee cellulari di osteosarcoma farmacoresistenti, indicando questo approccio come una possibile strategia per superare il problema della mancata risposta al trattamento farmacologico nei pazienti con osteosarcoma che sovraesprimono ABCB1. / Resistance to chemoterapeutic agents is a major obstacle for successful treatment of high grade osteosarcoma. This is in part caused by disregulation of the activity of ATP-binding cassette transporters (ABC) responsible for the efflux of chemotherapeutic agents in cancer cells. Studying how these transporters are regulated at transcription level is a crucial step to understanding multidrug resistance in cancer. The C-MYC oncogene has been identified to be related to resistance against methotrexate, doxorubicin and cisplatin and to be a prognostic factor for high grade osteosarcoma. C-MYC can regulate the expression of several ABC transporter genes, possibly related to drug resistance in osteosarcoma, and this may explain its adverse prognostic impact in this tumor. We have analyzed C-MYC and 16 ABC transporters, which are regulated by C-MYC and/or have been found to be responsible for the efflux of conventional drugs used in the treatment of human tumors on two different series of clinical samples and in a panel of human osteosarcoma cell lines by real-time PCR. The protein expression was evaluated for the 9 ABC transporters resulted as the most relevant from gene espression experiments. Finally the efficacy of a specific ABCB1 and ABCC1 inhibitor, was evaluated on osteosarcoma cell lines. ABCB1 and ABCC1 were the most expressed transporters in osteosarcoma cell lines. ABCB1 overexpression at diagnosis was found in about 40-45% of osteosarcoma patients and it was confirmed to be associated with adverse prognosis, being involved in drug resistance of osteosarcoma cells. Because of this, ABCB1 can be considered as a candidate therapeutic target for improving the treatment response of high-grade osteosarcoma patients. Inhibition of ABCB1 activity resulted to increase chemotherapeutics sensitivity of drug resistant human osteosarcoma cell lines, indicating this approach as a possible strategy to overcome treatment unresponsiveness in ABCB1-overexpressing osteosarcoma patients.