La marbofloxacina (MB) és una fluoroquinolona de tercera generació àmpliament usada en diferents espècies per tractar sobretot infeccions respiratòries. Aquest antibiòtic posseeix un ampli espectre d’activitat que inclou dos dels principals patògens associats al complexe respiratori porcí (CRP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) i Haemophilus parasuis (HP). APP és l’agent etiològic de la pleuropneumònia porcina i pot romandre a les tonsil·les dels porcs sense mostrar cap mena de símptoma durant llargs períodes de temps prolongant així la malaltia dins de l’explotació. HP és una bactèria colonitzadora del tracte respiratori superior dels porcs i l’agent etiològic de la malaltia de Glässer en la mateixa espècie. Una de les maneres per combatre aquestes malalties es tractar els animals infectats amb fluoroquinolones. Actualment, hi ha una gran quantitat d’informació existent en la literatura sobre les relacions entre la farmacocinètica (PK) i la farmacodinàmica (PD) de les fluoroquinolones. Els dos principals paràmetres PK-PD descrits per les fluoroquinolones són les relaciones existents entre els paràmetres PK, la concentració màxima observada en sèrum de l’antibiòtic (Cmax) i l’àrea sota la corba (AUC), amb el paràmetre PD concentració mínima inhibitòria (CMI). L’objectiu de la present tesi doctoral era expandir el coneixement sobre l’ús de la MB per tractar i controlar dos dels agents més comuns del CRP que són sensibles a les fluoroquinolones, APP i HP, i la manera com les relacions PK-PD poden ajudar en l’optimització de la dosi. / La marbofloxacina (MB) es una fluoroquinolona de tercera generación ampliamente usada en diferentes especies principalmente en el tratamiento de infecciones respiratorias. Este antibiótico posee un amplio espectro de actividad que incluye dos de los principales patógenos asociados al complejo respiratorio porcino (CRP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) y Haemophilus parasuis (HP). APP es el agente etiológico de la pleuropneumonia porcina y puede permanecer en las tonsilas de los cerdos durante largos períodos de tiempo sin mostrar ningún síntoma prolongando así la enfermedad dentro de la explotación. HP es una bacteria colonizadora del tracto respiratorio superior de los cerdos y el agente etiológico de la enfermedad de Glässer en la misma especie. Una de las maneras de luchar contra estas enfermedades es tratar los animales infectados con fluoroquinolonas. Actualmente, hay una gran cantidad de información existente en la literatura sobre las relaciones entre la farmacocinética (PK) y la farmacodinamia (PD) de las fluoroquinolonas. Los dos principales parámetros PK-PD descritos para las fluoroquinolonas son las relaciones existentes entre los parámetros PK, la concentración máxima del antibiótico observada en suero (Cmax) y el área bajo la curva (AUC), con el parámetro PD concentración mínima inhibitoria (CMI). El objetivo de la presente tesis doctoral era expandir el conocimiento sobre el uso de la MB para tratar y controlar dos de los agentes más comunes del CRP que son sensibles a las fluoroquinolones, APP y HP, y la manera como las relaciones PK-PD pueden ayudar en la optimización de la dosis. / Marbofloxacin (MB) is a third generation fluoroquinolone widely used in different species to treat mainly respiratory infections. This antimicrobial possesses a wide spectrum of activity that includes two of the main respiratory pathogens associated with the porcine respiratory disease complex (PRDC), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) and Haemophilus parasuis (HP). APP is the causative agent of porcine pleuropneumonia and this bacterium can remain in the tonsils of asymptomatic pigs for a long period maintaining the disease in the herd. HP is a colonizer of the upper respiratory tract of pigs and the causative agent of Glässer’s disease in swine. One of the ways to cope with these diseases is to treat the affected animals with fluoroquinolones. A great deal of information is now available on the literature about the pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) relationships for fluoroquinolones. The two main PK-PD parameters used for fluoroquinolones are the relationship between the PK parameters, the observed maximum drug concentration (Cmax) in serum and the area under the curve (AUC) with the PD parameter the minimum inhibitory concentration (MIC). The present thesis aimed to expand the knowledge on the use of MB to treat and control two of the most common agents of the PRDC which are sensitive to fluoroquinolones, APP and HP, and the way that PK-PD relationships can help with dose optimization.

Malaria is arguably one of the main medical concerns worldwide because of the numbers of people affected, the severity of the disease, and the complexity of the life cycle of its causative agent, the protozoan Plasmodium sp. The clinical, social and economic burden of malaria has led for the last 100 years to several waves of serious efforts to reach its control and eventual eradication, without success to this day. At present, administration methods of antimalarial drugs release the free compound in the blood stream, from where it can be significantly removed by many tissues and organs, thus reducing its availability for Plasmodium-infected erythrocytes. Due to this lack of specificity regarding the target cells, current oral or intravenous delivery approaches for most antimalarial drugs require high doses. However, unspecificity of toxic drugs demands low concentrations to minimize undesirable side-effects, thus incurring the risk of sublethal doses favouring the appearance of resistant pathogen strains. Targeted nanovector systems can fulfill the objective of achieving the intake of total doses sufficiently low to be innocuous for the patient but that locally are high enough to be lethal for the malaria parasite. With the advent of nanoscience, renewed hopes have appeared of finally obtaining the long sought-after magic bullet against malaria in the form of a nanovector for the targeted delivery of antimalarial drugs exclusively to Plasmodium-infected cells. We work on the development of antimalarial drug-carrying nanovectors specifically targeted to Plasmodium-infected red blood cells (pRBCs). Our first immunoliposomal prototype delivers its contents exclusively to pRBCs containing the P. falciparum late forms trophozoites and schizonts, and improves on average tenfold the efficacy of the antimalarial drugs chloroquine and fosmidomycin. Using chloroquine concentrations well below its IC50, and by modifying parameters such as liposome size, density of targeting antibodies on the liposome surface, targeted antigen, and intraliposomal drug concentration, we approach 100% of parasitemia reduction both in vitro and in vivo using a murine model for P. falciparum malaria. We are working in the improvement of the nanovector through modification of (i) the targeting element: better antibodies, non-protein molecules such as DNA aptamers and polysaccharides, (ii) the encapsulated drug(s), and (iii) the type of nanocapsule, making special emphasis on polymeric structures. Our objective in the short term is the design of a nanostructure adequate to enter the preclinical pipeline as an economically affordable new antimalarial therapy. / Desarrollo de nanovectores para la liberación dirigida de antimaláricos Los métodos actuales de administración oral o intravenosa requieren dosis elevadas que a menudo desencadenan efectos secundarios perniciosos. Por el contrario, el riesgo de suministrar dosis subletales a causa de dichas concentraciones terapéuticas críticas o por razones de inestabilidad del compuesto, favorece la aparición de cepas resistentes de Plasmodium. La liberación dirigida de antimaláricos es una aproximación prometedora para evitar ese riesgo. El trabajo presentado en esta tesis doctoral tiene como objetivo principal el desarrollo de un nanovector para la mejora de la eficacia de los antimaláricos existentes y la comprensión de los parámetros fundamentales de su diseño que determinan la eficacia de dicho nanovector. Liposomas con quantum dots en su interior y que han sido funcionalizados con hemi-anticuerpos contra formas tardías del parásito se unen en menos de 90 minutos a eritrocitos infectados por Plasmodium y liberan su contenido en el interior de las células diana. Cuando se encapsulan fármacos antimaláricos en el modelo inmunoliposomal, se incrementa hasta diez veces la eficacia de los fármacos. La formulación para administración oral de anticuerpos y liposomas es complicada, nanovectores adecuados para esta vía de administración serían una contribución valiosa para el tratamiento de la malaria en zonas endémicas, alejadas de centros de salud. Durante la última parte de esta tesis, nos hemos centrado en el desarrollo de nuevos nanovectores poliméricos que liberen de forma específica los fármacos a pRBCs, ya que las nanopartículas poliméricas pueden ser formuladas para administración oral más fácilmente que los liposomas. Las diferentes partes de futuros nanovectores (moléculas direccionalizadoras, formulación liposomal, recubrimiento exterior, fármaco encapsulado) están diseñadas de tal manera que puedan ser sustituidas por nuevos elementos para su utilización contra diferentes especies del parásito o para reconocer diferentes dianas intracelulares.

El objetivo de la presente tesis ha sido el de investigar la posibilidad de utilizar la vía transdérmica (01) como vía alternativa a la vía oral para la administración de alprazolam (02). La vía transdérmica posee una serie de ventajas (03) que en el caso del alprazolam permitirían una pauta terapéutica cómoda por parte del paciente, incrementando los intervalos de administración y un máximo rendimiento terapéutico del fármaco. En primer lugar se estudió la permeabilidad intrínseca"in vitro" del alprazolam a través de piel humana, a fin de determinar la capacidad intrínseca del fármaco para permear a través de la piel. Se determinaron los parámetros característicos de la permeación intrínseca: constante de permeación (Kp), flujo transdérmico (µg/hcm2), tiempo de latencia (Tl) y se predijeron las concentraciones terapéuticas que se alcanzarían en estado de equilibrio estacionario Cee (ng/ml) a partir del valor de flujo intrínseco obtenido de 0.054µg/h.cm2. Estos resultados pusieron de manifiesto la necesidad de la utilización de promotores de absorción(04)(05)(06) para poder alcanzarse concentraciones terapéuticas, comprendidas entre el rango de concentraciones terapéuticamente activas de 5-20 ng/ml (07). En un segundo estadio se procedió a elaborar y diseñar sistemas de administración transdérmicos (SAT) unilaminares o matriciales (08) utilizando diferentes bases acrílicas comerciales: dimetil amino etil metacrilato (Eudragit(C) E-100) (09)(10) o bases de acrilato y acrilato vinil acetato (Durotack(C))(11)(12)(13), formuladas con alprazolam a distintas concentraciones y combinaciones de promotores de absorción. En un tercer estadio se realizó la caracterización de estos prototipos elaborados determinándose los parámetros farmacoténicos(14) "in vitro" de fuerza de adhesión y fuerza de desplazamiento lateral, parámetros representativos de la adhesión del SAT a la superficie de la piel, seguidamente se pasó a evaluarlos biofarmacéuticamente estudiándose la velocidad de liberación del alprazolam a partir de cada uno de los prototipos elaborados. Con objeto de estudiar la cinética de liberación y poder establecer comparaciones estadísticas entre prototipos, se procedió al análisis de las curvas de liberación obtenidas y estimación de los parámetros representativos del proceso mediante aproximaciones modelísticas se ajustaron a las ecuaciones representativas de los modelos de orden uno, orden cero y raíz cuadrada, también se realizaron aproximaciones amodelísticas calculándose los valores de los parámetros amodelísticos eficiencia de liberación (Ef) y tiempo medio de liberación (MDT). Se estudió la permeación transdérmica "in vitro" a partir de los prototipos elaborados a fin de evaluar de forma sistemática la capacidad de la formulación para facilitar el paso de fármaco a través de la piel y predecir si la cantidad de fármaco permeada permitiría alcanzar concentraciones plasmáticas dentro del margen terapéutico. Se calcularon los parámetros descriptivos de la permeación para cada prototipo, flujo (µg/h cm2) transdérmico, tiempo de latencia (Tl), cantidades permeadas a las 44 horas (Qobs44), coeficiente de correlación (r) de la recta que relaciona las cantidades permeadas acumuladas respecto del tiempo y las concentraciones plasmáticas predichas Cee (ng/ml) que se alcanzarían. Con toda la información obtenida en los distintos estudios realizados se procedió a seleccionar el prototipo más operativo y de elección tanto a nivel de los parámetros farmacotécnicos como en referencia al mayor valor de flujo transdérmico obtenido. El prototipo nº 603 puede considerarse como el más operativo desde un punto de vista práctico, por una parte presenta un valor de tiempo de latencia prácticamente nulo Tl -0.45 y el valor de flujo transdérmico más elevado de 1.76 µg/h.cm2, este flujo permite proveer concentraciones plasmáticas de alprazolam de 15.7 ng/ml situadas dentro del margen de concentraciones terapéuticas de 5-20 ng/ml. Dado que la entrada de un fármaco al organismo a partir de un parche tipo matricial tras su aplicación sobre la piel, se asume que es un proceso de orden cero, siendo la constante que rige la velocidad de entrada al organismo el valor del flujo transdérmico obtenido, se procedió a realizar una simulación de los niveles plasmáticos que se alcanzarían a partir de los valores de las constantes farmacocinéticas del alprazolam (15) y substituyendo la constante de velocidad (Ko) de la infusión intravenosa por el mayor valor de flujo experimental obtenido 1.76 µg/h.cm2 para el prototipo nº 603, se puso de manifiesto que tras la aplicación al organismo del prototipo 603 se mantendrían concentraciones terapéuticas de alprazolam durante aproximadamente 6 días (144horas).BIBLIOGRAFIA RESUMEN:01- Barry BW. Dermatological formulations, percutaneous absorption. Drug Pharm.Sci 18. New York, Marcel Dekker 1983.02- Guy, RH Hadgraft, J. Selection of drug candidates for transdermal drug delivery. Development issues and research initiatives, Hadgraft J and Guy R.H. New York, Marcel Dekker 1989.03- Ranade V, Hollinger. Drug delivery Systems. Boca Raton: CRC press, inc. 1996, p 177-208.04- Guy RH, Hadgraft J. the Effect of Penetration Enhancers on the Kinetics of Percutaneous Absorption. J Controlled Release 1987; 5: p 43-5105- Barry BW. Mode of action of penetration enhancers in human skin. J Controlled Release 1987; 6: p 85-97.06- Santus GC, Baker RW. Review of transdermal enhancer patent literature. Journal of controlled release. 25. 1-20. 199307- Handbook of pharmacokinetics and pharmacodinamics 2002. Pharmacokinetic parameters of important drugs p 481.08- Chien YW. Transdermal therapeutic systems. Robinson JR, Lee VHL. Controlled drug delivery. Fundamentals and application. New York and Basel: Marcel Dekker 1988.09- Schurad B, Tack J, Lipp R. Evaluation of the transdermal permeation behaviour of proterguride from drug in adhesives matrix patches through hairless mouse skin. Drud Dev Ind Pharm 2005; 31 (6): 505-51310- Tipre D, Vavia R. Formulation optimisation and stability study of transdermal therapeutic system of nicorandil. Pharm dev and Technology 2002; 7(3) : 325-332.11- Nalluri BN, Milligan C, Chen J, Crooks PA, Stinchcomb AL. In vitro release studies on matrix type transdermal drug delivery systems of naltrexone and its acetyl prodrug. Drud Dev Ind Pharm 2005 ; 31 (9): 871-87712- Zhao H, Chi-Ho L, Chung S, Shim C. In vitro and in vivo evaluation of a novel nonscrotal matrix-type transdermal delivery system of testosterone. Drud Dev Ind Pharm 2005; 31 (3): 257-26113- Aqil M, Sultana Y, Ali A. Matrix type transdermal drug delivery system of metoprolol tartrate: in vitro characterisation. Acta Pharm. 2003; 53: 119-125. 14- FINAT Technical Handbook (Test Methods) 5th Edition.1999 15- Venkatakrishann K, Kerry E, Bruce L and Greenblatt D. Kinetics and Dynamics of Intravenous Adinazolam, N Desmethyl Adinazolam and Alprazolam in Healthy volunteers. J Clin Pharmacol 2005; 45: 529-537.

La presente tesis doctoral se centra principalmente, en aumentar la variabilidad del componente olefínico presente en la reacción multicomponente de Povarov y procesos relacionados, así como en explorar la posible actividad como inhibidores de AChE de los productos de oxidación de los aductos Povarov. Dentro de este trabajo, se estudió la reactividad de un variado grupo de lactamas insaturadas. En este grupo se varió la sustitución sobre el nitrógeno, la posición del doble enlace (endo- o exo- cíclico) y el tamaño del ciclo (5, 6 y 7). De este modo se obtuvieron las correspondientes tetrahidroquinolinas, producto de la reacción de Povarov, con un patrón de sustitución interesante. De los aductos obtenidos se sintetizaron las quinolinas correspondientes a partir de una oxidación con DDQ. Este último proceso es de gran interés, ya que este tipo de compuestos son abundantes en productos naturales y bioactivos. De igual modo, se estudió la reactividad de olefinas heterocíclicas del tipo 1,3-tia-, -oxa-, -imidazolona, obteniendo satisfactoriamente las tetrahidroquinolinas Povarov. Con estas nuevas olefinas se pudo estudiar la regioselectividad de su ataque, observando que este se realiza de manera selectiva. Como consecuencia de esta observación se diseño la versión intramolecular de la reacción y de este modo invertir el ataque de las olefinas sintetizadas. De todos los aductos obtenidos se sintetizó las correspondientes quinolinas. Como se ha comentado anteriormente, las quinolinas son de gran importancia, así que se diseñó un nuevo método para su obtención a partir de los aductos Povarov. Para ello se analizaron un gran número de oxidantes, entre ellos se seleccionó el dióxido de manganeso de la casa comercial Wako, ya que fue el único con el que no se obtenían subproductos de reacción y un rendimiento aceptable. Seguidamente, en el grupo de investigación se descubrió una nueva reacción multicomponente de tipo Mannich-Ritter para obtener amidinas cíclicas. Dentro de este trabajo se estudiarón el rango de olefinas activadas validas para el proceso, observando que este componente es clave y condiciona el mecanismo de la reacción. Por último, se estudió la actividad de quinolinas sintetizadas a partir de los aductos Povarov obtenidos a partir de lactamas insaturadas y enaminas cíclicas, como inhibidores de la acetilcolinesterasa. El objetivo es inhibir la actividad que tiene la enzima como catalizador de la agregación del β-amiloide, uno de los responsables de la enfermedad de Alzheimer. Los resultados obtenidos son esperanzadores, ya que muestran una muy buena actividad para compuestos relativamente pequeños. / This thesis is focus on the variability of the activated olefin component on the Povarov multicomponent reaction and related processes. And, explore the possible activity as AChE inhibitors of the obtained oxidized derivatives. One of the aim of this work was to explore the reactivity of the unsaturated lactams and heterocycles as 1,3-thia-, -oxa-, -imidazolone as activated olefins in Povarov multicomponent reaction. Different types of unsaturated lactams were under study, varying the N substitution, the cycle size and the α-position substituent. All the combinations are successfully and the final tetrahydroquinoline was obtained with good yields except for the α-position replaced. In case of the 1,3-thia-, -oxa-, -imidazolone the desire product was obtain in regioselective manner and good yields. An intramolecular version of the reaction was design to inverse the regiochemistry of the process. Finally, all the Povarov adducts were oxidized in presence of DDQ to obtain the corresponded quinoline. Some problems can be observed in the oxidized process, so the next objective was to find a new methodology to this transformation. For this reason a large number of oxidants were studied and manganese dioxide was found as the best option for this transformation, better than DDQ. Following, a new Mannich-Ritter multicomponent reaction was discovered in the research group to obtain cyclic amidines. My work in this project was to study the scope of the activated olefins reactive in this new multicomponent reaction. The results showed that the reaction mechanism depends on the activated olefin was used, for this reason some computational studies were done trying to explain this behavior. Finally, some unsaturated lactams and enamides derivatives were evaluated as AChE inhibitors. The objective was to inhibit the β-amyloid aggregation which is one of the causes of Alzheimer disease.

L'estrès oxidatiu és el resultat del desequilibri entre la producció d'espècies reactives i l'activitat dels sistemes de defensa antioxidants. Les estratègies químiques i cultius cel•lulars utilitzats habitualment per a l'avaluació de l'activitat antioxidant de compostos presents en els aliments, no tenen la capacitat de predir clarament la seva eficàcia in vivo, ni de determinar els mecanismes d'acció pels quals actuen. L'embrió de peix zebra és un model animal que ha estat utilitzat per a l'estudi de processos oxidatius, ja que presenta gens i enzims antioxidants anàlegs als sistemes dels mamífers. Els objectius de la tesi doctoral han inclòs el desenvolupament d'un model d'estrès oxidatiu basat en l'embrió de peix zebra per a l'avaluació de l'activitat antioxidant de diferents compostos i l'avaluació de l'efecte antioxidant in vivo i l'efecte neuroprotector de compostos polifenòlics presents en el vi negre, mitjançant el model d'estrès oxidatiu establert. Així mateix, s'han estudiat els efectes de l'estrès oxidatiu i d'alguns antioxidants en el model de neuroesferes humanes. Primerament, s'han caracteritzat els efectes de diferents compostos inductors d'estrès oxidatiu en el creixement i el desenvolupament embrionari del peix zebra. La confirmació del mecanisme oxidatiu en els efectes observats en l'exposició als inductors d'estrès oxidatiu, s'ha realitzat mitjançant la modulació de la resposta a estrès oxidatiu amb compostos que poden augmentar o disminuir ('estatus antioxidant. Si el compost estudiat actua per un mecanisme d'estrès oxidatiu s'observen diferències estadísticament significatives en la comparació de les corbes concentració-resposta de la modulació i de l'exposició única als inductors d'estrès oxidatiu. S'han seleccionat els inductors tert-butil hidroperòxid (tBOOH) i 6- hidroxidopamina (6-ONDA) per a ser utilitzats en el model d'estrès oxidatiu. La verificació de la capacitat del model per a detectar l'efecte antioxidant dels compostos s'ha portat a terme amb diferents compostos amb activitat antioxidant coneguda. S'ha confirmat l'efecte antioxidant dels compostos estudiats i la capacitat del model d'estrès oxidatiu establert per a identificar efectes antioxidants in vivo. La identificació dels compostos polifenòlics presents en una mostra de vi negre desalcoholitzada i en una mostra d'homogenat d'embrions de peix zebra que havien estat exposats a aquesta s'ha realitzat mitjançant la tècnica HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. El model d'estrès oxidatiu amb tBOOH s'ha aplicat als compostos polifenòlics identificats amb major intensitat en la mostra de vi negre i s'ha observat un efecte antioxidant in vivo en tots ells. Els compostos polifenòlics de la mostra de vi negre també han produït un augment significatiu de la distància total recorreguda pels embrions i un augment significatiu del nombre de neurones dopaminèrgiques quan s'ha aplicat el model d'estrès oxidatiu amb 6-ONDA, indicant un efecte neuroprotector d'aquests compostos en els embrions de peix zebra. Els efectes de la TCHQ com a inductor d'estrès oxidatiu i dels antioxidants hesperetina i kaempferol s'han estudiat en el model de neuroesferes humanes. La teoria de l'hormesi com a possible estratègia antioxidant, s'ha aplicat en les neuroesferes i s'ha observat que la pre-exposició d'aquestes a una concentració baixa de TCHQ protegeix enfront als efectes oxidants d'aquest compost en les neuroesferes. Així mateix, aquesta teoria s'ha reproduït en el model d'embrió de peix zebra. La pre-exposició dels embrions a una concentració baixa de TCHQ produeix un efecte protector hormètic antioxidant enfront als efectes oxidants d'aquest compost en els embrions de peix zebra. En resum, mitjançant la integració i combinació de diferents procediments experimentals, s'ha establert un model d'estrès oxidatiu en embrió de peix zebra que permet l'avaluació in vivo dels efectes antioxidants dels compostos i d'altres estratègies antioxidants. El model establert s'ha aplicat a l'avaluació dels efectes antioxidants i neuroprotectors de compostos polifenòlics del vi negre. / Oxidative stress is the result of an imbalance between reactive species production and antioxidant defence systems activity. Chemical strategies usually used for the evaluation of antioxidant activity are not able to predict antioxidant efficiency in vivo. The zebrafish embryo is a biological model which has been used in the study of oxidative processes. In the present work, an oxidative stress model in vivo based on the zebrafish embryo technique has been developed. The effects of oxidative stress inducers on the zebrafish embryo development have been characterised and its oxidative mechanism has been confirmed by strategies of modulation of the oxidative stress response. Tert-butyl hydroperoxide (tBOOH) and 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) were selected as the inducers to be used in the oxidative stress model. The capacity of the model to detect in vivo antioxidant effects of the compounds was performed with well-known antioxidant compounds. Polyphenolic compounds present in a red wine sample and in the homogenate of zebrafish homogenate were identified by the HPLC-LTQ-Orbitrap-MS technique. The compounds identified with major intensity were evaluated with the oxidative stress model and an in vivo antioxidant effect in all of them was established. The polyphenolic compounds also produced a neuroprotective effects in dopaminergic neurons and protected them against the neurotoxic effects of 6-OHDA. The human neurosphere model was applied to the study of the effects of oxidative stress inducers and antioxidants. The hormesis paradigm was studied and confirmed as an antioxidant strategy. Pre-exposure of neurospheres to a low concentration of an oxidative stress inducer protected against oxidant effects of the same compound at higher concentrations. This paradigm was also applied and confirmed in the zebrafish embryo model. In summary, an oxidative stress model using the zebrafish embryo model has been established with the integration and combination of different experimental procedures. This model allows the in vivo evaluation of antioxidant effects of compounds and other antioxidant strategies. It has been applied to the evaluation of antioxidant and neuroprotective effects of polyphenolic compounds present in a red wine sample.

La tesis doctoral consta de 3 artículos desarrollados a lo largo de varios años. El primer trabajo tiene el título de “Transdermal delivery of imipramine and doxepin from newly oil-in-water nanoemulsions for an analgesic and anti-allodynic activity: Development, characterization and in vivo evaluation”. Los antidepresivos y más concretamente los antidepresivos tricíclicos por su mayor eficacia y actividad analgésica han sido objeto de numerosos estudios. En este primer artículo, hemos estudiado la actividad analgésica y anestésica de dos antidepresivos tricíclicos (imipramina y doxepina). Con el fin de investigar formulaciones analgésicas de aplicación cutánea, hemos desarrollado una nanoemulsión compuesta por propilenglicol, Transcutol® , agua, Labrasol®, Plurol Oleico®, isostearato de isoestearilo, ácido oleico y D-limoneno. La concentración final de imipramina o doxepina en el sistema de la nanoemulsión fue del 3% (p/p) En este trabajo, las nanoemulsiones han sido caracterizadas en función de su pH, viscosidad, tamaño de gota e índice de polidispersidad y además hemos efectuado un estudio morfológico y estructural mediante microscopía electrónica de transmisión. Además, este trabajo también detalla los estudios de estabilidad realizados en las formulaciones de la nanoemulsión para evaluar la integridad de la formulación, donde se manifiesta que las formulaciones permanecen estables durante un periodo de tres meses. Mediante la utilización de las células de Franz hemos evaluado la permeación ex vivo a través de piel humana y predecido las concentraciones finales en plasma. También se ha evaluado in vivo el efecto analgésico y anti-alodínico de las nanoemulsiónes, después de su administración tópica en ratas, mediante la realización del Plantar Test, tras inoculación subplantar de carragenina. Se ha visto que el mayor efecto se consigue con la nanoemulsión con doxepina, resultando esta formulación con doxepina una prometedora terapia analgésica alternativa con una potencial aplicación clínica sustitutoria de la inyección subcutánea y de fácil aplicación clínica en determinadas patologias y de cara a minimizar efectos indeseables en ciertas aplicaciones de quimioterapia y radioterapia. El segundo trabajo científico lleva por título: An improved cryopreservation method for porcine buccal mucosa in ex vivo drug permeation studies using Franz diffusion cells. Para evaluar la absorción percutánea de moléculas y evitar el sacrificio innecesario de animales, se ha propuesto la utilización de la mucosa bucal porcina para la realización de estudios ex vivo de permeabilidad. Dada la dificultad de obtener mucosa bucal fresca cuando se necesita, se procede a su congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC), no siendo siempre factible este procedimiento. Una alternativa más barata y más simple consiste en congelar la mucosa bucal de cerdos recién sacrificados en un congelador mecánico, utilizando DMSO y albúmina como agentes crioprotectores. Este estudio comparó los parámetros ex vivo de permeabilidad de clorhidrato de propranolol a través de la mucosa bucal porcina, tanto fresca como congelada, utilizando el sistema de células de difusión de Franz y HPLC como método de detección. Se realizaron estudios histológicos y se evaluaron los efectos de la congelación sobre los parámetros de la permeabilidad del fármaco. Además, se utilizó como un indicador de la integridad de la mucosa bucal, el parámetro de la pérdida de agua transmucosa (TMWL) tal como se evalua del mismo modo la pérdida de agua transepidérmica (TEWL) parámetro utilizado para medir la integridad de la piel. Los resultados no mostraron diferencias entre la mucosa fresca y congelada en el flujo, en el coeficiente de permeabilidad y en el tiempo de latencia. Sin embargo, se observó una diferencia estadísticamente significativa en la medición del TMWL entre mucosa fresca y congelada. La tesis concluye con un tercer trabajo experimental: “Transbuccal delivery of doxepin: Studies on permeation and histological investigation”. En anteriores estudios se valoró la acción anestésica y analgésica de la administración tópica oral de doxepina. Este estudio evalúa un modelo de permeación bucal para determinar el alcance del paso de doxepina en mucosa oral porcina después de la aplicación tópica de una solución acuosa saturada de doxepina. Los estudios de permeación a través de la mucosa bucal se realizaron usando las células. de difusión de Franz. La cantidad permeada acumulada de doxepina se representó gráficamente como una función del tiempo. Así mismo se calcularon los parámetros cinéticos de permeación tales como el flujo (Js), tiempo de latencia (T1) y el coeficiente de permeabilidad (Kp). De cara a evaluar el posible potencial efecto terapéutico en el hombre a nivel central o periférico, se procedió a determinar la concentración plasmática teórica en estado de equilibrio estacionario de doxepina y la cantidad de fármaco retenido en la mucosa. También se procedió a estudiar histológicamente la mucosa bucal de cara a evaluar los posibles daños potenciales en su estructura, motivados por el fenómeno de la permeación, no observándose ningún tipo de daño estructural. Los resultados obtenidos muestran una pobre permeación de la solución acuosa de doxepina a través de la mucosa bucal La concentración predictiva de doxepina alcanzaría un valor de 46 ng/ml lejos de la necesaria para tener un efecto sobre el SNC como antidepresivo tricíclico. Sin embargo, la mediana de la cantidad de doxepina remanente en la membrana mucosa fue de 0,24µg/cm2/µg de tejido que evidencia una función de reservorio de la mucosa bucal. Este estudio sienta las bases para profundizar en la investigación en esta área con el fin de adoptar potenciales estrategias alternativas para mejorar la absorción bucal de doxepina en la práctica clínica. / PERMEATION STUDY EX VIVO AND IN VIVO OF TRICYCLIC ANTIDEPRESSANT IN BIOLOGICAL TISSUES. STUDY OF ANESTHETIC AND ANALGESIC ACTIVITY This study is based on three papers published between 2013 and 2014. The first paper has the title: “Transdermal delivery of imipramine and doxepin from newly oil-in-water nanoemulsions for an analgesic and anti-allodynic activity: Development, characterization and in vivo evaluation”. We study the local analgesic and anesthetic properties of nanoemulsions with imipramine and doxepin. The concentration of these tricyclic antidepressants in the nanoemulsion system was 3% (w/w). The composition of optimized nanoemulsion is 45% of aqueous phase, 40% mixture of surfactants and 15% oil phase. The second study was published in 2014 in the European Journal of Pharmaceutical Sciences and has the title:”An improved cryopreservation method for porcine buccal mucosa in ex vivo drug permeation studies using Franz diffusion cells”. We study a cryopreservation method for porcine buccal mucosa based in the mixture of phosphate buffer saline (PBS) with 10% DMSO and 4% albumin as cryoprotective agents. The porcine buccal mucosa has been proposed as a substitute for the buccal mucosa barrier on ex vivo permeability studies avoiding unnecessary sacrifice of animals. We used a Franz diffusion cell system and HPLC as detection method. The freezing effects on drug permeability parameters were evaluated. Equally histological studies were performed. Furthermore, the use of the parameter transmucosal water loss (TMWL) as an indicator of the buccal mucosa integrity was evaluated just as transepidermal water loss (TEWL) is utilized for skin integrity. The results showed no difference between fresh and frozen mucosal flux, permeability coefficient or lag time. However, statistical significant difference in TMWL between fresh and frozen mucosa was observed. The last paper:” Transbuccal delivery of doxepin: Studies on permeation and histological investigation” evaluated a model of buccal permeation to determine the depth of delivery of doxepin into excised porcine buccal mucosa following topical application of a saturated aqueous doxepin solution. Buccal mucosa permeation studies were performed using Franz diffusion cells, Cumulative amounts of doxepin permeated were plotted as a function of time. Finally, a histological evaluation of the buccal mucosa was performed to test potential damage due to the permeation phenomenon. This study lays the foundation for further research within this area with a view to potentially adopting alternative strategies for enhanced buccal absorption of doxepin in clinical practice.

For over eighty years, adamantane ring has interested organic chemists for its simplicity and symmetry. The rigid tricyclo[3.3.1.13,7]decane skeleton has provided a unique structural template for evaluating important theoretical concepts in chemistry. The physical and chemical properties of the adamantane nucleus have largely overshadowed the structure’s contribution to the discovery of human therapeutics. Nevertheless its application in medicinal chemistry has become more and more significant in the last decades, where the adamantane ring was identified as a key structural subunit in several synthetic drugs for multiple targets. Adamantane is often considered as providing just the critical lipophilicity readily available as an add-on for known pharmacophoric units. Although its valuable contribution to medicinal sciences, adamantane ring can lead to solubility and stability problems which compromise the pharmacokinetic profile of the potential drug. Hence many research teams have worked out alternatives on adamantyl-based compounds in order to avert these issues, especially by attaching polar groups at key positions. In the last few years, the research group of Dr. Santiago Vázquez from University of Barcelona has developed new polycyclic scaffolds as surrogates of the adamantane group with encouraging results in multiple targets. So far, we have synthesized ring-contracted, ring-expanded and oxa analogues of the drugs amantadine, rimantadine and memantine with anti-influenza, NMDA receptor antagonist and trypanocidal activities, proving the capacity of these polycycles to substitute the adamantane ring. As described previously, the replacement of the adamantane ring with other polycyclic scaffolds can lead to compounds with better pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles. In particular, my Ph.D. research has focused mainly on the substitution of the adamantane moiety in inhibitors of different targets. 1) NMDA receptor antagonists: design, synthesis, pharmacological evaluation and electrophysiological studies of new compounds. 2) 11β-HSD1: design, synthesis, pharmacological evaluation and computational studies of new compounds. 3) Soluble epoxide hydrolase inhibitors: design, synthesis, pharmacological evaluation and in vitro cellular studies of new compounds. From the results of this dissertation, we have confirmed the ability of the new scaffolds to replace the adamantane nucleus with successful outcomes. The work derived from this thesis have been published in peer scientific journals, as well as in two different patent applications. / La recerca duta a terme durant la meva tesi doctoral ha estat centrada principalment en la substitució de l’anell d’adamantà en inhibidors de diferents dianes. Fins al moment, durant la present tesi, he sintetitzat estructures policícliques de diferent mida i forma com anàlegs de l’adamantà per la seva substitució en múltiples dianes farmacològiques. Concretament, he preparat famílies de compostos que tenen com a diana el receptor NMDA del glutamat per la malaltia d’Alzheimer, l’enzim 11β-HSD1 pel tractament de la diabetis mellitus tipus 2 i malalties cardiovasculars, i l’enzim sEH pel tractament del síndrome metabòlic i estats de dolor i inflamació. El nostre objectiu és proporcionar nous compostos amb propietats fisicoquímiques millorades, mentre mantenen la seva potència biològica. Amb la seva avaluació en assajos in vitro, hem demostrat la capacitat d’aquest policicles de substituir l’anell d’adamantà. Cal destacar que la meva recerca ha inclòs el disseny, la síntesi i la caracterització completa dels compostos finals, així com l’avaluació farmacològica i els assajos in vitro d’una de les famílies de compostos.

El objetivo del presente trabajo fue valorar el impacto de la informatización del proceso de solicitud analítica sobre la seguridad del paciente, en el laboratorio clínico del ICS de Lleida, a partir de indicadores de calidad preanalíticos. Se trata de un estudio descriptivo y transversal que se desarrolló en dos partes: En una primera se llevó a cabo un análisis descriptivo de la población a estudio y en la segunda parte, un estudio analítico de la muestra, en que se estudió la asociación entre los indicadores de calidad del proceso preanalítico antes, inmediatamente después, al año y a los tres años de la implantación de la petición electrónica en grupos independientes. El periodo inmediatamente posterior a la implantación presentó en conjunto el mayor número de errores preanalíticos, para descender en los años siguientes. El impacto de la informatización de la solicitud analítica fue positivo para la seguridad del paciente una vez consolidado el proceso, pero otros factores como la formación del personal extractor y la comunicación bidireccional con el laboratorio deben ser considerados. / L’objectiu d’aquest treball fou valorar l’ impacte de la informatització del procés de sol•licitud analítica sobre la seguretat del pacient, al laboratori clínic del ICS de Lleida, en base indicadors de qualitat preanalítics. Es tracta d’un estudi descriptiu i transversal desenvolupat en dues parts: En una primera es va dur a terme una anàlisi descriptiva de la població a estudi i a la segona part, un estudi analític de la mostra, es va estudiar l’associació entre els indicadors de qualitat del procés preanalític abans, immediatament després, a l’any i als tres anys de la implantació de la petició electrònica en grups independents. El període immediatament posterior a la implantació va presentar en conjunt el major nombre d’errors preanalítics, per a disminuir els anys següents. L’impacte de la informatització de la sol•licitud analítica va ser positiu per a la seguretat del pacient un cop consolidat el procés, però cal considerar altres factors com la formació del personal extractor i la comunicació bidireccional amb el laboratori. / The aim of this study was to assess analytical request computerization impact on patient safety using quality preanalytical indicators, in a Lleida laboratory belonging to the Catalonian Health Institute (ICS). This is a descriptive cross study developed in two parts. In the first, a population descriptive analysis was carried out. In the second part, a sample analytical study, the association between preanalytical quality indicators was studied before, immediately after, one year after and three years after of the implementation of the computerized system in independent groups. Period immediately after implementation was the worst in terms of preanalytical errors. Errors decrease in subsequent years. The impact of computerization of analytical request was positive for patient safety once the process was consolidated, but other factors such as phlebotomy staff training and bidirectional communication with laboratory specialists must also be taken into account.

L’objectiu d’aquest estudi és valorar la utilitat de les troballes de la TC per diferenciar vessament pleural benigne de maligne, per la qual cosa s’ha desenvolupat un sistema de puntuació senzill, que identifica de forma fiable un vessament pleural maligne. La cohort de derivació de l’estudi va incloure 343 pacients consecutius amb vessament pleural (228 benignes i 115 malignes) als quals es va fer una TC. La precisió diagnòstica dels sistemes de puntuació es va calcular per a la cohort de derivació i es va aplicar posteriorment a dues poblacions independents (n=80 y n=42, respectivament) per dos radiòlegs. En el sistema de puntuació generat, que va de 0 a 20 punts, es van incloure 7 variables predictores de malignitat: qualsevol lesió pleural ≥1 cm (5 punts); presència de massa o nòdul pulmonar ≥1 cm; metàstasi hepàtiques o massa abdominal (3 punts cadascun) i absència de loculacions pleurals, vessament pericardíac o cardiomegàlia (2 punts cadascun). / El objetivo de este estudio es valorar la utilidad de los hallazgos de la TC para diferenciar derrame pleural benigno de maligno, para lo que se ha desarrollado un sistema simple de puntuación que identifica de forma fiable un derrame pleural maligno. La cohorte de derivación incluyó 343 pacientes consecutivos con derrame pleural (228 benignos y 115 malignos) a los que se les realizó una TC. La precisión diagnóstica del sistema de puntuación se calculó para la cohorte de derivación y se aplicó posteriormente en dos poblaciones independientes (n=80 y n=42, respectivamente) por dos radiólogos. En el sistema de puntuación generado, que va de 0 a 20 puntos, se incluyeron 7 variables predictoras de malignidad: cualquier lesión pleural ≥1 cm (5 puntos); presencia de masa o nódulo pulmonar ≥1 cm; metástasis hepáticas o masa abdominal (3 puntos cada uno) y ausencia de loculaciones, derrame pericárdico o cardiomegalia (2 puntos cada uno). / The target of this study is to assess the utility of the CT’s findings in order to differentiate between benign and malignant pleural effusion. To achieve our goal, a simple CT scan-based scoring system to predict the probability of malignant pleural effusion has been developed. The conducted analysis’ cohort involved 343 patients with pleural effusion, 228 benign cases and 115 malignant ones. The diagnostic accuracy of the CT scan scoring system was calculated for the derivation set and further evaluated in two independent populations (n=80 and n=42, respectively) by two radiologists. The scoring CT system, from 0 to 20 points, includes 7 variables to predict malignancy: any pleural lesion (i.e., nodule, mass or thickening)> 1 cm (5 points); the presence of mass or lung nodule > 1 cm; liver metastases or abdominal mass (3 points each) and the absence of pleural loculations, pericardial effusions or cardiomegaly (2 points each).

La historia natural de la infección por el VIH se ha modificado drásticamente gracias a los grandes progresos que se han realizado en el campo de los fármacos anti-rretrovirales. En este sentido, se considera tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) a cualquier combinación de tres o más fármacos, que incluyan generalmente a dos inhibidores de la transcriptasa reversa y un inhibidor de la proteasa. Estos regí-menes terapéuticos han mostrado ser muy superiores en eficacia antiviral a la monote-rapia o la biterapia convencional, frenar la progresión de la inmunodeficiencia, dismi-nuir la morbilidad y mortalidad de los infectados y han permitido conocer mejor la etiopatogenia de enfermedad. El término TARGA no es más que una forma de nombrar el tipo de tratamiento que están recibiendo los infectados y es independiente de cual es su respuesta terapéutica. De hecho, la experiencia con muestreos poblacionales extensos indica que sólo un 40-50% de los sujetos tratados consiguen bajar la carga viral plasmática hasta niveles indetectables. Además, en adultos VIH+ con supresión completa de la replicación viral a corto plazo, la reconstitución inmunológica parece ser sólo parcial pues no se consigue recuperar totalmente ni el número de linfocitos CD4+ ni sus funciones perdidas. La información existente en área de la infección pediátrica por el VIH, comparada con la del adulto, es aún muy escasa o poco documentada, especialmente en lo que a los TARGA (eficacia antiviral y reconstitución inmunológica) se refieren.El objetivo del presente trabajo es estudiar la recuperación inmunológica de ni-ños infectados verticalmente por el virus de la inmunodeficiencia humana tras un pe-riodo prolongado de TARGA. Para ello se ha realizado un estudio longitudinal y retros-pectivo en 34 niños infectados verticalmente por el VIH y sometidos a TARGA. Para poder determinar el grado de recuperación desde el momento basal o pre-TARGA has-ta cuatro años después de iniciar el TARGA, hemos agrupado nuestra población de infectados en una categoría evolutiva, su eficacia terapéutica. En ella se ha tenido en cuenta el cambio que han sufrido los valores de carga viral plasmática a lo largo del estudio quedando los niños agrupados en tres categorías, los que presentaron alta, media o baja eficacia. En ellos hemos analizado:- Los subpoblaciones de linfocitos circulantes CD4+ y CD8+. En concreto su ca-pacidad efectora (CD28), y su grado de maduración (CD45RA, CD45R0) o de activación (CD38, HLA-DR).- Las respuestas proliferativas linfocitarias in vitro a estímulos policlonales.- El equilibrio plasmático y la síntesis in vitro. de citocinas de tipo Th1, Th2 y Proinflamatorio El hallazgo inmunológico, que precozmente manifiesta la supresión viral, es el incremento significativo de la subpoblación CD4+CD45RA (vírgenes o no primadas). La linfopenia de las células CD4+CD28+, que se evidenció desde el momento basal, revirtió hasta valores normales secuencialmente y en paralelo al incremento de las células CD4+ vírgenes (con el fenotipo CD3+CD4+CD28+CD45RA). La repoblación de los linfoci-tos CD4+ con estas características, muestra que la alta supresión viral conseguida en estos niños permite la recuperación de la linfopenia CD3+CD4+ con un gran potencial para generar nuevas respuestas inmunológicas específicas y responder ante nuevas agresiones antigénicas. Además, las células analizadas muestran dos característica que definen mejor a los linfocitos emergentes a la sangre periférica. Por una lado, la au-sencia de expresión de HLA-DR, signo evidente de la inmadurez o inactividad celular y, por otro lado, que la mayoría expresan CD38. El fenotipo CD38+HLA-DR- caracterizan a los linfocitos CD4+ recientemente diferenciados de los precursores de origen tímico.La linfocitosis CD8 global no disminuye significativamente a lo largo de los cua-tro años de evolución del TARGA. Sin embargo, los datos observados en esta cohorte de niños muestran que los linfocitos CD8+ también se afectan pero solo a nivel de la reordenación de las subpoblaciones que la componen. Con el TARGA disminuyen las linfocitosis basales de las subpoblaciones de células efectoras con fenotipo CD8+CD45R0 (maduras), CD8+HLA-DR+ (activadas) y CD8+CD28- (citotóxicas). Sin em-bargo, las altas cifras basales de las subpoblaciones complementarias (CD8+CD45RA, CD8+CD28+, CD8+HLA-DR-), se mantienen o incluso aumentan en la evolución TARGA, por lo que los valores de la población de linfocitos CD8+ no se modifica en su conjunto. Altos niveles de células CD8+ con fenotipo maduro, activado y/o citotóxico se ha aso-ciado con altas viremias y linfopenia CD4. En este sentido, en situaciones de alta su-presión de la replicación viral, disminuye la presión ejercida sobre el sistema inmunoló-gico y conduce a descensos en las subpoblaciones CD8+ efectoras circulantes. Los cambios cuantitativos mostrados en este estudio sobre el reequilibrado de las subpo-blaciones de linfocitos CD8+ son poco evidentes en los momentos iniciales del TARGA, pero claramente objetivables en los momentos tardíos, uno o dos años después de que las células CD4+ hayan recuperado sus valores normales.El TARGA, permite una recuperación funcional de los linfocitos de sangre perifé-ricos ya en momentos muy tempranos del tratamiento. Esta recuperación funcional coincide en el tiempo con los incrementos significativos de los linfocitos CD4+ con feno-tipo de célula virgen (CD4+CD45RA), CD4+CD28+, CD4+HLA-DR- y CD4+D38+, sin que en esos momentos se objetiven aún cambios en las subpoblaciones de los linfocitos CD8+. Los intensos déficits proliferativos, a todos los mitógenos, y los déficits de secre-ción de IL-2, observados en las respuestas funcionales del momento basal, revierten a la normalidad en los dos primeros años de TARGA. Aunque en este trabajo no se han realizado estudios funcionales con linfocitos CD4+ purificados, la coincidencia cronoló-gica en su aparición sugiere que las actividades funcionales exploradas se correlacio-nan más con los niveles de linfocitos CD4+ circulantes que con los de linfocitos CD8+, los cuales se mantienen invariables a lo largo de la evolución del TARGA. Es más, la alta repoblación de células CD4+ que se observa en los pacientes con alta eficacia no modifica los niveles plasmáticos ni inducidos in vitro de IFN-. Los linfocitos CD8+, in-crementados en el momento basal y mantenidos en altas tasas, son células hiperpro-ductoras de esta citocina cuya conservación funcional, es inmunológicamente deseable debido a que es un importante mediador para el control viral.Por el contrario, el análisis de las citocinas de tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) pone de manifiesto que los TARGA no incrementan ni modifican el nivel plasmático ni la ca-pacidad de las células periféricas para producirlas in vitro. De esta forma, el predomi-nio Th1 sobre Th2, el cual estaba en desequilibrio por déficit del primero, que no por exceso del segundo, ha sido restaurado en los pacientes. Por otro lado, los niveles plasmáticos e inducidos in vitro de citocinas proinflamatorias (IL-6 y/o TNF-) se en-cuentran incrementados en los momentos basales y se mantienen elevados a lo largo de la evolución del TARGA. Ello es un signo indicativo de que la hiperactivación crónica generada por el VIH aún no está normalizada o de la discreta replicación que puede acontecer a escala tisular y que no se traduce en aumentos de la viremia plasmática.En resumen, tras cuatro años continuados de TARGA, los niños infectados por el VIH+ se benefician inmunológicamente de estos tratamientos. En ellos se puede objetivar una recuperación de los linfocitos CD4+, un reequilibrio de los linfocitos CD8+ circulantes y la normalización de las respuestas funcionales a estímulos policlonales. La calidad de la supresión viral conseguida (intensidad y persistencia) es el factor limitan-te más importante que define la intensidad y la cronología de los eventos inmunológi-cos recuperados. El nivel de eficacia terapéutica observado (virológica e inmunológica) en los pacientes tratados con TARGA, aunque insuficiente para erradicar definitivamen-te el virus, suponen una buena contención de la enfermedad a la espera de que se generen nuevos diseños terapéuticos que lo consigan definitivamente. / The natural history of HIV infection has been dramatically modified thanks to the development of Highly Active Anti-Retroviral Treatment (HAART). This therapeutic strategies have been demonstrated a stronger antirretroviral effect, to delay the progression of the disease and to diminish the morbidity and mortality among HIV positive subject. In order to reduce the decline slope of CD4+ lymphocyte, the main goal of HAART is to reduce the viremia to undetectable levels the longer as possible.We have performed this study to check if there is a real and effective qualitative and quantitative restoration of the immune system in children born to HIV positive mothers that are receiving HAART. Attending to the retrospective changes that have been observed in the plasma viral load, our cohort has been stratified in three groups of antiviral response, high, medium and low efficacy. We have analysed several lymphocyte subpopulations that are present in the peripheral blood, the plasmatic level of cytokines, and the in vitro blastogenic capacity of lymphocytes and also the synthesis of cytokines.Our findings suggest that children acquire immunologic benefits after four years of continuous HAART. In them can be observed a restoration of CD4+ lymphocytes, a balance between different subpopulations of CD8+ lymphocytes and a recover of in vitro functional activity of lymphocytes. The viral suppression achieved is the limiting factor, and this defines the intensity and chronology of the immune restoration. There is also a quantitative and qualitative amelioration of immune functions in spite of only discrete inhibitions of viral replication.The confirmations that even after four years of effective HAART still persist high levels of active CD8+ lymphocytes and that them are continually generated from thymic precursors, evidences an ongoing viral replication even at low levels.HAART is effective in controlling HIV replication and permits a sustained restoration of the immune system but is unable to eradicate definitively the virus.