Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-08-18T12:47:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 642570 bytes, checksum: 0aed44027bf78f0ea002861db2ed48b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T12:47:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 642570 bytes, checksum: 0aed44027bf78f0ea002861db2ed48b7 (MD5) Previous issue date: 2011-07-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O bicho-mineiro-do-café, Leucoptera coffeella (Lepidoptera: Lyonetiidae) ́e a principal praga do café no Brasil e seu controle ́e feito principalmente por meio de aplicações de inseticidas com características prejudiciais ao homem, cultura e ambiente. Em contraste, o uso de feromônios sexuais no manejo de pragas ́e tido como uma forma de se diminuir a aplicação e os efeitos tóxicos desses inseticidas. Nesse trabalho, avaliou-se a captura de machos de L. coffeella em armadilhas contendo diferentes isômeros e mistura rcêmica de 5,9-dimetilpentadecano, componente majoritário de seu feromônio sexual, em duas localidades de Minas Gerais. Também foi verificado se o componente minoritário, 5,9-dimetilhexadecano, exerce influência na captura de machos em armadilhas de feromônio e se diferentes sínteses da mistura racêmica de 5,9-dimetilpentadecano levam a diferenças na captura de machos em campo. Em todos os casos, a mistura racêmica atraiu mais indivíduos que os isômeros, reforçando a ideia de que uma mistura de isômeros deve ser produzida pela fêmea. O isômero RS atraiu mais machos que os outros isômeros em ambos os locais. Dessa forma, parece não haver variação geográfica do feromônio sexual entre esses lugares. No entanto, populações do México são mais atraídas pelo isômero SR, abrindo margem para se especular que há variação entre essas populações e as encontradas no Brasil. O componente minoritário não influenciou a captura de machos. Portanto, não deve ser considerado parte do feromônio sexual de L. coffeella. Das três misturas racêmicas testadas, apenas uma se mostrou ineficiente, de modo que a razão disso ainda precisa ser investigada. Aspectos da evolução dos sistemas de comunicação química e a possível aplicação dos resultados obtidos são discutidos. / The coffe leaf miner, Leucoptera coffella (Lepidoptera: Lyonetiidae) is the main pest of coffe in Brazil and its control is achieved through application of insecticides with features harmful to man, culture and environment. In contrast, the use of sex pheromones in pest management is seen as a way to reduce the implementation and toxic efects of these insecticides. In this study, was evaluated the capture of males of L. coffella in traps containing diferent isomers and racemic mixtures of 5,9-dimethylpentadecane, a major component of its sex pheromone, in two localities of Minas Gerais. It was observed too if the minor component, 5,9-dimethylhexadecane influences the capture of males in pheromone traps and if diferent syntheses of racemic mix- ture of 5,9-dimethylpentadecane lead to diferences in the capture of males in the field. In all cases, the racemic mixture attracted more individuals than isomers, reinforcing the idea that a mixture of isomers should be produced by the female. The RS isomer attracted more males than the other isomers in both places. Thus, there seems not to be geographic variation of the sex pheromone between these sites. However, Mexico populations are more at- tracted by the SR isomer, opening room to speculate that there is variationxii between these populations and those found in Brazil. The minor component did not influence the capture of males. Therefore, should not be considered part of the sex pheromone of L. coffella. Of the three racemic mixtures tested, only one proved inefficient, but the reason for this remains to be in- vestigated. Aspects of the evolution of chemical communication systems and the possible application of the results obtained are discussed.

[ES] La confusión sexual es el método de control de plagas basado en semioquímicos que ofrece los mejores resultados y tiene mayor aceptación en el mercado. Este método se basa en la liberación al ambiente de la feromona sexual del insecto al que se pretende controlar en una cantidad suficiente para provocar un retraso o una reducción del apareamiento. Los estudios dedicados a la optimización de la feromona utilizada, la cual condiciona en gran medida el precio del uso de esta técnica, se basan en ensayos empíricos sobre parámetros como el número de emisores utilizados y su distribución, la carga inicial de feromona, etc. La cuantificación de la concentración de feromona en aire es un parámetro más directo y ofrece información valiosa tanto para realizar estudios destinados a optimizar el uso de los emisores disponibles, como para el desarrollo de nuevos dispositivos de emisión con un menor uso de feromona. En la presente tesis se ha desarrollado una metodología que permite la cuantificación de la concentración de feromona en aire en condiciones reales de campo basada en la captación de volátiles del aire y su posterior análisis mediante técnicas de cromatografía de gases y espectrometría de masas. Mediante el uso de esta metodología se ha estudiado la cantidad de feromona en aire a lo largo del ciclo de cultivo en campos tratados con confusión sexual para dos especies diferentes de importancia agronómica en los cultivos de la viña y del arroz, la polilla del racimo de la vid (Lobesia botrana Denis & Schiffermüller) y el barrenador del arroz (Chilo suppressalis Walker) tratados con diferentes tipos de emisores. Estos estudios han servido para conocer de qué manera se distribuye la feromona en aire a lo largo del tiempo en relación con la cinética de los emisores y cuáles son los mecanismos implicados en la confusión sexual en condiciones reales. Además, también se ha estudiado la dependencia climática de emisores pasivos en condiciones de campo puesto que tendrá relación con la cantidad de feromona en aire y puede repercutir en la eficacia del método de control. Los resultados obtenidos en las parcelas en las que se instaló la confusión sexual contra L. botrana muestran que la concentración de feromona en aire va cambiando a lo largo del ciclo de cultivo. Además, se observa que la cubierta vegetal produce un efecto tampón, de manera que la presencia de una masa foliar desarrollada actúa regulando la concentración de feromona en el aire y permite una distribución más homogénea. Mediante la correlación de la velocidad de emisión con los parámetros climáticos, se comprobó que la temperatura y velocidad del viento son parámetros determinantes y que esta dependencia es variable entre distintos tipos de emisores. Por otro lado, se determinó mediante bioensayos electrofisiológicos y de comportamiento que las concentraciones de feromona necesarias para desencadenar mecanismos de confusión no competitiva en machos de L. botrana estaban muy por encima de las cuantificadas en campo, por lo que se concluyó que los principales mecanismos que producen la confusión sexual en condiciones reales son los competitivos. En el caso de las captaciones realizadas en el arrozal, los valores obtenidos de la concentración de feromona en aire sirvieron para estudiar por qué con una colocación más temprana de los emisores se conseguía un mayor efecto en el control de la plaga. Además, se observó que, en este caso, la concentración de feromona en aire guardaba una relación más estrecha con la emisión que proporcionan los emisores de confusión sexual. Este hecho apoya la hipótesis de que una densa masa vegetal, menor en los arrozales que en la viña, puede proteger a la feromona de su lavado por efecto del viento. / [CA] La confusió sexual és el mètode de control de plagues basat en semioquímics que ofereix els millors resultats i té una major acceptació en el mercat. Aquest mètode es basa en l'alliberament de la feromona sexual de l'insecte que es pretén controlar a l'ambient en una quantitat suficient per a provocar un retràs o una reducció de l'aparellament. Els estudis dedicats a l'optimització de la feromona utilitzada, que condiciona en gran mesura el preu de l'ús d'aquesta tècnica, es basen en experiments empírics sobre paràmetres com el número d'emissors utilitzats i la seua distribució, la càrrega inicial de feromona, etc. La quantificació de la feromona en l'aire és un paràmetre més directe i ofereix informació valuosa tant per a realitzar estudis destinats a optimitzar l'ús dels emissors disponibles, com per al desenvolupament de nous dispositius d'emissió amb un menor ús de feromona. En aquesta tesis s'ha desenvolupat una metodologia que permet la quantificació de la concentració de feromona en aire en condicions reals de camp basada en la captació de volàtils de l'aire i el seu anàlisis mitjançant tècniques de cromatografia de gasos i espectrometria de masses. Mitjançant l'ús d'aquesta metodologia s'ha estudiat la quantitat de feromona en aire al llarg del cicle de cultiu en camps tractats amb confusió sexual per a dos espècies diferents d'importància agronòmica en els cultius de la vinya i de l'arròs, el corc del raïm (Lobesia botrana Denis & Schiffermüller) i el cucat de l'arròs (Chilo suppressalis Walker) tractats amb diferents tipus d'emissors. Aquests estudis han servit per a conèixer de quina manera es distribueix la feromona al llarg del temps en relació amb la cinètica dels emissors i quins són els mecanismes implicats en la confusió sexual en condicions reals. A més, també s'ha estudiat la dependència climàtica d'emissors passius en condicions de camp donat que tindrà relació amb la quantitat de feromona en aire i pot repercutir en l'eficàcia del mètode de control. Els resultats obtinguts en les parcel·les en les que es va instal·lar la confusió sexual contra L. botrana mostren que la concentració de feromona en aire va canviant al llarg del cicle de cultiu. A més, s'observa que la coberta vegetal produeix un efecte tampó, de manera que la presència d'una massa foliar desenvolupada actua regulant la concentració de feromona en l'aire i permet una distribució més homogènia. Mitjançant la correlació de la velocitat d'emissió amb els paràmetres climàtics, s'ha comprovat que la temperatura i la velocitat del vent són paràmetres determinants i que esta dependència és variable entre diferents tipus d'emissors. D'altra banda, s'ha determinat mitjançant bioassajos electrofisiològics i de comportament que les concentracions de feromona necessàries per a desencadenar mecanismes de confusió no competitiva en mascles de L. botrana estaven molt per damunt de les quantificades al camp, per la qual cosa es va concloure que els mecanismes principals que produeixen la confusió sexual en condicions reals són els competitius. En el cas de les captacions realitzades en els arrossars, els valors obtinguts de la concentració de feromona en aire van servir per a estudiar per què amb una col·locació més primerenca dels emissors s'aconseguia un major efecte en el control de la plaga. A més, es va observar que, en aquest cas la concentració de la feromona en aire guardava una relació més estreta amb l'emissió que proporcionaven els emissors de confusió sexual. Aquest fet suporta la hipòtesi de que una massa vegetal densa, menor en els arrossars que en les vinyes, pot protegir a la feromona del seu llavat per l'efecte del vent. / [EN] Mating disruption is the pest control method with better acceptation in market due to its results. This method is based on the releasing of the pheromone of the target insect into the environment with enough quantity to delay or to reduce their mating. Optimization-pheromone studies, which condition the use price of this technique a lot, are based on empirical essays about parameters such as the number of dispensers deployed and their distribution, pheromone initial content, etc. Airborne pheromone quantification is a more direct parameter that offers valuable information to do studies to optimize dispenser available use as to develop new dispensers with less pheromone emission. In this work, a methodology that allows the airborne pheromone quantification in real field conditions has been developed based on volatiles airborne sampling and their later analysis with gas chromatography techniques and mass spectrometry. Using this methodology, the airborne pheromone throughout the crop cycle in mating disruption treated fields against different agronomic important species, the European Grapevine Moth (Lobesia botrana Denis & Schiffermüller) and the Rice Stem Borer (Chilo suppressalis Walker), has been studied in vineyards and rice paddies treated with different types of dispensers. These studies have been useful to know how the pheromone is distributed along the time in relation to the dispensers' kinetics and which are the mechanisms involved in mating disruption in real conditions. Moreover, the climatic dependency of the passive dispensers in field conditions has also been studied as it will be related to the airborne pheromone quantity and it can affect the efficacy of the control method. The results show that the airborne pheromone concentration in mating disruption treated fields against L. botrana changes throughout the crop cycle. In addition, it is observed that canopy produces a buffer effect, so the presence of a developed foliage regulates the concentration of the airborne pheromone and allows a more homogeneous distribution. The correlation of emission rate with climatic parameters were useful to check that temperature and wind speed have an influence on dispensers' emission. On the other hand, with electrophysiological and behavioral bioassays, it was determined that higher airborne concentrations were needed to trigger non-competitive mechanisms in L. botrana males. In this way, it was concluded that competitive mechanisms are the ones acting in treated fields In rice paddies air samplings, airborne pheromone concentration data were used to study why an earlier dispensers' deployment achieved a better effect controlling the pest. Furthermore, it was observed a more direct relationship between airborne pheromone with dispensers' emission. This fact supports the hypothesis that thicker foliage, lesser in rice fields than in vineyards, can prevent pheromone from its washing by wind. / Gavara Vidal, A. (2021). Cuantificación de feromonas en aire y su aplicación en métodos de control de plagas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/165412 / TESIS

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180