Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-30Bitstream added on 2014-06-13T20:38:41Z : No. of bitstreams: 1 cruz_mhc_me_jabo.pdf: 449643 bytes, checksum: 0e9dfaf9ccce6d16d2b674ee50050873 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este estudo objetivou avaliar a influência do fluido folicular (FF) e da proteína recombinante humana GDF9 adicionados ao meio de maturação sobre a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados três experimentos utilizando o meio TCM199 como meio básico de maturação. No primeiro experimento, os oócitos foram maturados em cinco diferentes meios (0%, 25%, 50%, 75% ou 100% de FF) em quatro tempos de maturação (22, 24, 26 ou 28 h). No segundo experimento, os oócitos foram maturados nos mesmos meios utilizados no primeiro experimento e fecundados em três diferentes tempos (24, 26 ou 28 h). No terceiro experimento, foram utilizados dois meios: controle (sem FF) ou com 25% de FF e quatro níveis de suplementação (0, 25, 100 ou 200 ng/mL) com GDF9. O FF promoveu retardo da progressão meiótica, afetando a maturação nuclear e a migração de grânulos corticais para a periferia dos oócitos. O FF em altas concentrações influenciou negativamente as taxas de clivagem e de blastocisto. O GDF9, com (25%) ou sem FF, não influenciou as taxas de clivagem e de blastocisto, no entanto, interferiu positivamente sobre o percentual de embriões considerados superiores. O percentual mais elevado (82,22%) de embriões classificados como superiores foi obtido com o uso de 200 ng de GDF9 em meio de maturação acrescido de 25% de FF. Em conclusão, a adição do fluido folicular (75% e 100%) ao meio de maturação in vitro retarda a progressão meiótica, sincronizando a maturação nuclear com a citoplasmática e a suplementação do meio de maturação com proteína recombinante humana GDF9 melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro, baseando-se na avaliação da proporção do número de células da massa celular interna (MCI) em relação ao número total de células / This study aimed to evaluate the effects of follicular fluid (FF) and recombinant human GDF9 added to the maturation media on the quality of in vitro produced bovine embryos. Three experiments using TCM199 medium as basic maturation media were performed. In the first experiment oocytes were matured in five different media (0%, 25%, 50%, 75% or 100% of FF) during four maturation times (22, 24, 26 or 28 h). In the second experiment, the oocytes were matured in the same five media used in the first experiment and fertilized at three different times (24, 26 or 28 h). In the third experiment were used two media: control (without FF) or with 25% FF combined with four levels of supplementation (0, 25, 100 or 200ng/mL) with GDF9. The FF promoted delay of the meiotic progression, affecting nuclear maturation and cortical granules migration to the oocyte periphery. In addition FF influenced the cleavage and blastocyst rates. GDF9, without or added to FF did not affect the cleavage and blastocyst rates, however, a positive influence on the percentage of embryos considered superior was observed. The highest percentage (82.22%) of embryos considered superior was obtained with maturation media added with 25% of FF and supplemented with 200 ng of GDF9. In conclusion, addition follicular fluid (75% and 100%) to the in vitro maturation media delays meiotic progression, synchronizing nuclear to cytoplasmic maturation, and supplementation of maturation media with recombinant human GDF9 improves the quality of bovine embryos in vitro produced, based on inner cell mass cells (ICM) proportion, relative to the total cell number

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-02-19Bitstream added on 2014-06-13T20:19:16Z : No. of bitstreams: 1 resende_mv_me_jabo.pdf: 500037 bytes, checksum: dcdabb9ddd0a9d7b7a657398caa401ff (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Anticorpos anti H-Y foram produzidos em ratas da linhagem isogênica Wistar Furth, e utilizados no sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos, com o objetivo de desviar a proporção sexual. As ratas foram imunizadas com leucócitos do baço de machos de mesma linhagem, e a atividade biológica dos anticorpos verificada por ELISA. Cento e trinta e quatro embriões foram produzidos in vitro e quando atingiram o estádio de mórula foram incubados em meio de cultivo contendo 5% de anticorpos anti H-Y a 38,5 °C com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2 , por um período de 24 horas. Os embriões do grupo controle foram cultivados nas mesmas condições, sem adição de anticorpos anti H-Y. Após o cultivo com anticorpos anti H-Y, os embriões foram classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos que permaneceram no estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e houve a formação de blastocele (classificados como fêmeas). Conseguimos produzir anticorpos anti H-Y com títulos de até 1:2048. Dos 134 embriões produzidos, 79 embriões (58,96%) tiveram o desenvolvimento inibido, e 55 embriões (41,04%) não sofreram inibição. O sexo de 124 embriões pode ser verificado com a PCR para confirmação dos resultados. Das 78 mórulas, 49 (62,82%) eram do sexo masculino e dos 46 blastocistos, 22 (47,83%) eram do sexo feminino. No grupo controle a proporção sexual foi de 55,57% de embriões fêmeas e 44,43% de embriões machos, totalizando 70 embriões. O teste do Qui-quadrado indicou que somente na sexagem de mórulas obteve-se desvio da proporção sexual (P<0,05) em relação ao grupo controle. Os resultados da sexagem foram diferentes dos apresentados na literatura o que pode ser devido à qualidade morfológica inferior dos embriões produzidos in vitro comparada aos embriões produzidos in vivo, ou também, a influência do meio de cultivo. / Anti-H-Y antibodies were produced in female rats of the isogenic strain Wistar Furth, immunized with spleen leukocytes of males of the same strain, and the biological activity of the antibody was verified by ELISA. One hundred and thirty four embryos were produced in vitro and when they reached the morula stage they were incubated with anti-H-Y antibodies at 38.5°C under 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 , for a period 24 hours. The embryos in the control group were cultured under same conditions, without addition of the anti-H-Y antibodies. After culture of the embryos in the medium containing anti H-Y antibodies, they were classified in two groups: 1) arrested embryos that remained in morula stage (classified as male) and 2) embryos that developed and formaed a blastocoele (classified as female). With the isogenic rats used, had been antibodies were obtained with titers up to 1:2048. Of the 124 embryos, 79 of them (58.96%) were arrested, and 55 embryos (41.04%) were not. The sex of 124 embryos was identified by PCR. Of the 78 morulas, 49 (62.82%) were confirmed as being male sex and of the 46 blastocysts, 22 (47.83%) were confirmed as being of the female sex. In the control group the sexual ratio was of 55.57% of femle embryos and 44.43% of male embryos, totalizing 70 embryos. Using the Chi-Square Test it was possible to observe that in the sexing of morulas it was obtained only statistical difference (P<0.05) in relation to the sexual ratio of the control group, while for sexed blastocysts no statistical difference was detected. The different results found compared with those reported in the literature could be due to the poor morphogical quality of the in vitro produced embryos when compared with the in vivo produced ones, or also, to the influence of the culture medium used during the in vitro production of embryos with anti-H-Y antibodies.

Orientadora: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Resumo: Anticorpos anti H-Y foram produzidos em ratas da linhagem isogênica Wistar Furth, e utilizados no sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos, com o objetivo de desviar a proporção sexual. As ratas foram imunizadas com leucócitos do baço de machos de mesma linhagem, e a atividade biológica dos anticorpos verificada por ELISA. Cento e trinta e quatro embriões foram produzidos in vitro e quando atingiram o estádio de mórula foram incubados em meio de cultivo contendo 5% de anticorpos anti H-Y a 38,5 °C com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2 , por um período de 24 horas. Os embriões do grupo controle foram cultivados nas mesmas condições, sem adição de anticorpos anti H-Y. Após o cultivo com anticorpos anti H-Y, os embriões foram classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos que permaneceram no estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e houve a formação de blastocele (classificados como fêmeas). Conseguimos produzir anticorpos anti H-Y com títulos de até 1:2048. Dos 134 embriões produzidos, 79 embriões (58,96%) tiveram o desenvolvimento inibido, e 55 embriões (41,04%) não sofreram inibição. O sexo de 124 embriões pode ser verificado com a PCR para confirmação dos resultados. Das 78 mórulas, 49 (62,82%) eram do sexo masculino e dos 46 blastocistos, 22 (47,83%) eram do sexo feminino. No grupo controle a proporção sexual foi de 55,57% de embriões fêmeas e 44,43% de embriões machos, totalizando 70 embriões. O teste do Qui-quadrado indicou que somente na sexagem de mórulas obteve-se desvio da proporção sexual (P<0,05) em relação ao grupo controle. Os resultados da sexagem foram diferentes dos apresentados na literatura o que pode ser devido à qualidade morfológica inferior dos embriões produzidos in vitro comparada aos embriões produzidos in vivo, ou também, a influência do meio de cultivo. / Abstract: Anti-H-Y antibodies were produced in female rats of the isogenic strain Wistar Furth, immunized with spleen leukocytes of males of the same strain, and the biological activity of the antibody was verified by ELISA. One hundred and thirty four embryos were produced in vitro and when they reached the morula stage they were incubated with anti-H-Y antibodies at 38.5°C under 5% CO2, 5% O2 and 90% N2 , for a period 24 hours. The embryos in the control group were cultured under same conditions, without addition of the anti-H-Y antibodies. After culture of the embryos in the medium containing anti H-Y antibodies, they were classified in two groups: 1) arrested embryos that remained in morula stage (classified as male) and 2) embryos that developed and formaed a blastocoele (classified as female). With the isogenic rats used, had been antibodies were obtained with titers up to 1:2048. Of the 124 embryos, 79 of them (58.96%) were arrested, and 55 embryos (41.04%) were not. The sex of 124 embryos was identified by PCR. Of the 78 morulas, 49 (62.82%) were confirmed as being male sex and of the 46 blastocysts, 22 (47.83%) were confirmed as being of the female sex. In the control group the sexual ratio was of 55.57% of femle embryos and 44.43% of male embryos, totalizing 70 embryos. Using the Chi-Square Test it was possible to observe that in the sexing of morulas it was obtained only statistical difference (P<0.05) in relation to the sexual ratio of the control group, while for sexed blastocysts no statistical difference was detected. The different results found compared with those reported in the literature could be due to the poor morphogical quality of the in vitro produced embryos when compared with the in vivo produced ones, or also, to the influence of the culture medium used during the in vitro production of embryos with anti-H-Y antibodies. / Mestre

Orientador: José Maurício Barbanti Duarte / Coorientador: Eveline dos Santos Zanetti / Banca: Rosana Nogueira de Morais / Banca: Lawrence Charles Smith / Resumo: Assim como outras espécies brasileiras de vida livre, os cervídeos têm sofrido pressões sobre seu habitat, o que provoca segregação entre populações, diminuição de troca gênica e de diversidade genética, aumento da endogamia, e um maior risco de extinção. A produção in vitro de embriões (PIVE) tem ganhado destaque como uma ferramenta a ser utilizada nos programas de conservação de espécies selvagens in situ e ex situ. Entre as etapas da PIVE, a maturação in vitro (MIV) assume grande importância, pois o seu sucesso pode garantir a melhora nas taxas de produção de embriões. Assim, os objetivos do presente trabalho foram: avaliar viabilidade do protocolo de estimulação ovariana para a aspiração folicular, a eficiência da laparoscopia para a aspiração folicular, e a maturação nuclear e a distribuição mitocondrial em oócitos maturados in vitro para a espécie M. gouazoubira. Para isso, foram utilizadas cinco fêmeas, submetidas a repetidas estimulações ovarianas com intervalos de 30 dias. Os oócitos aspirados foram classificados morfologicamente de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 24 horas e, posteriormente, corados para a avaliação da distribuição mitocondrial (Mitotracker Red CMXRos); e do estágio de maturação nuclear (Hoescht 33342). Foram realizados 14 procedimentos cirúrgicos para a colheita de 94 oócitos de fêmeas superestimuladas. A média de folículos visualizados, folículos aspirados e oócitos colhidos por cirurgia foi, respectivamente, de 17,07±9,12, 13,54±6,64 e 7,15±3,72. Dos oócitos maturados in vitro, 64,52% alcançaram a MII e a classificação da distribuição mitocondrial não foi conclusiva. Houve ativação espontânea por partenogênese em 16,13% dos oócitos. Ainda, foi realizada avaliação de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cervids, as well as other free-living brazilian species, have suffered pressures on their habitat, causing segregation between populations and reduced genetic exchange, which may decrease the genetic diversity and generate increased inbreeding and extinction risk. In vitro embryo production (IVEP) has been highlighted as a tool to be used in wild species conservation programs in in situ and ex situ. The maturation process has a great importance among the steps of IVEP, and its success can ensure an improvement in the rate of production of embryos. The objectives of this study were to assess feasibility of the protocol of ovarian stimulation for ovum pick, the efficiency of laparoscopy for oocyte retrieval, and the nuclear maturation and mitochondrial distribution in oocytes matured in vitro for the species M. gouazoubira. Thus, we used five females, submitted to repeated stimulation with intervals of 30 days. After the visualization of the ovaries, the visible follicles were counted and punctured by laparoscopy on day eight (D8). The aspirated oocytes were classified morphologically according the quality, subjected to in vitro maturation for 24 hours and then stained for the evaluation of mitochondrial distribution (Mitotracker Red CMXRos) and nuclear maturation stage (Hoescht 33342). Fourteen surgical procedures were performed on overstimulated females and 94 oocytes were collected in total. The average number of visualized follicles, aspirated follicles, and harvested oocytes was equal to 17.07±9.12, 13.54±6.64 e 7.15±3.72, respectively. Of the in vitro matured oocytes, 64.52% reached the MII stage and 67.74% were classified with homogeneous mitochondrial distribution. There was spontaneous activation by parthenogenesis in 16.13% of the oocyte. Furthermore, 21 non-matured oocytes were evaluated and of these, 81%... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Valquíria Hippólito Barnabé / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Marcelo George Mungai Chacur / Resumo: Este estudo foi dividido em dois experimentos. No exp. 1, investigou-se a influência do sêmen congelado heterospérmico e homospérmico de touros Nelore sobre o movimento de espermatozóides (ME), integridade da membrana plasmática (IMP) e produção de embriões in vitro (PIV). No exp. 2, a substituição de plasma seminal (PS) de touros com sêmen de média congelabilidade (grupo homospérmico, HoM) por PS heterólogo de touros de alta congelabilidade (grupo homospérmico, HoA), foram avaliados através do ME, IMP, PIV, proteína total (PT), concentração de testosterona plasmática (TP) e padrão eletroforético das proteínas do plasma seminal (PE). O plasma seminal heterólogo (grupo PSH) foi composto pela mistura de PS de touros HoA com espermatozóides de touros HoM. As amostras seminais de oito touros foram classificadas, com base em avaliações anteriores. Para o exp. 1, não foi observada diferença significativa para o ME, IMP e PIV entre os grupos, mas, foi observada entre os touros, independentemente do grupo. No exp. 2, não houve diferença, para o ME, PT, TP e embriões produzidos entre os grupos, entretanto, maior número de membranas plasmáticas intactas (P<0,05) foi encontrado no grupo HoA, bem como para a taxa de clivagem (P<0,05) no grupo PSH. Sete padrões de proteínas (20 a 25 frações) foram detectados no PS. A concentração de PT e TP variou pouco, quando comparada com o PE. Concluindo, o sêmen heterospérmico não melhorou nenhuma característica espermática nem aumentou a produção de embriões in vitro, no entanto, o PSH somente mostrou efeito benéfico sobre a taxa de clivagem. Agradecimentos: Central VR e frigorífico Frig, Araçatuba, SP, Brasil / Abstract: This study was divided into two experiments. In exp.1, the influence of frozen heterospermic and homospermic bull semen on sperm motion (SM), plasma membrane integrity (PMI) and in vitro embryo production (IVP) were investigated. In exp.2, the replacement of seminal plasma (SP) of bulls with medium semen freezability (homospermic group, MH) by heterologous SP of bulls with high freezability (homospermic group, HH), as evaluated for SM, PMI, IVP, total protein (TP), plasma testosterone level (PT), and electrophoretic profile of plasma seminal protein (EP). The heterologous seminal plasma (HSP) group consisted of a mixture of SP of bull HH with spermatozoa of bull MH. Sperm samples from 8 Nellore bulls were classified based on previous evaluations. In exp. 1, no significant difference was observed for SM, PMI, and IVP among groups, but it was observed among bulls, regardless of group. In exp.2, there was no difference for SM, TP, PT, and yielded embryos among groups, but more intact plasma membranes (P<0.05) were found in group HH as well as for cleavage rate (P<0.05) in group HSP. Seven protein profiles (20 to 25 protein fractions) were detected in SP. Level of TP and PT varied little when compared to the seminal protein profile. In conclusion, heterospermic semen did not improve any sperm characteristic nor enhanced in vitro embryo production, however, HSP only showed beneficial effect on cleavage rate. Acknowledgement: VR Insemination Station and FRIG slaughterhouse, Araçatuba, SP, Brazil / Doutor

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Jussara Maria Tebet / Banca: Maria Isabel Mello Martins / Banca: Camila de Paula Freitas Dell'Aqua / Resumo: A produção de embrião in vitro (PIV) tem sido uma grande alternativa para os programas de preservação de felídeos selvagens ameaçados de extinção. No entanto, a PIV necessariamente depende de outras técnicas de reprodução assistida como a maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), transferência de embrião (TE), e criopreservação de gametas. Essas técnicas de reprodução assistida já foram transferidas com sucesso do gato doméstico para seus parentes selvagens. Já o uso de sêmen liofilizado também resultou em filhotes vivos de diversas espécies de produção, mas em gatos domésticos isso ainda não ocorreu. O objetivo do presente estudo foi verificar a fragmentação do DNA do sêmen liofilizado e a viabilidade de seu uso através da utilização da ICSI para a PIV de embriões de gatos domésticos. Foram colhidas amostras de 3 gatos normospérmicos que foram utilizadas a fresco, congeladas/descongeladas e liofilizadas. Foram realizados testes para avaliação de integridade de DNA (Laranja de Acridina Convencional, Ensaio do Cometa Alcalino, Laranja de Acridina na citometria de fluxo, e TUNEL). O método de TUNEL mostrou ter maior sonsibilidade para detecção de fragmentação de DNA e detectou grau elevado de lesão de DNA do sêmen liofilizado em comparação com o sêmen fresco e congelado/descongelado dos mesmos doadores. Não foi possível produzir embrião de gato através da técnica de ICSI utilizando sêmen que foi liofilizado em meio SOF / Abstract: The in vitro production of embryos (IVP) has been a good alternative for conservational programmes of wild felids threatened by extinction. However, IVP depends upon several other assisted reproduction techniques such as in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), embryo transfer (ET), gamete cryopreservation. These techniques were already successfully employed in wild felines. Freeze-dried sperm has also been used to produce live offspring of several species, but in domestic cat this has not been reported yet. Hence, the objective of the present study was to verify the sperm DNA fragmentation after the freeze-drying process as well as the feasibility of using freeze-dried sperm together with ICSI to produce cat IVP embryos. Fresh, frozen/thawed, freeze-dried sperm samples of 3 normospermic cats were used in this experiment. Sperm DNA integrity assessments were performed (Conventional Acridine Orange, Alkaline Comet Assay, Acridine Orange using flow cytometry, and TUNEL). TUNEL assessment showed higher sensitivity to detect DNA fragmentation and it detected higher DNA fragmentation in freeze-dried sperm when compared to frozen/thawes and fresh semen from the same donors. It was not possible to produce IVP embryos making use of freezedried sperm that used SOF as medium and ICSI / Doutor

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Ériklis Nogueira / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da suplementação lipídica sobre o desenvolvimento embrionário e criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Para tanto, em uma primeira etapa foi avaliado o efeito da suplementação alimentar de novilhas Nelore com uma fonte de gordura protegida ruminal, rica em ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) Omega 6 (n-6) e 3 (n-3) sobre a população folicular, número de oócitos recuperados, desenvolvimento in vitro e sobrevivência embrionária após 3 e 24h de CIV pós-desvitrificação. Não houve diferença significativa (P>0,05) quanto à população folicular (17,9±1,0 vs 15,8±1,0), número de oócitos recuperados (14,4±1,4 vs 14,5±1,3) e número de oócitos viáveis (12,1±1,2 vs 12,5±1,1) para a PIV de embriões, respectivamente para os grupos CONTR e GORD. Da mesma forma, a taxa de clivagem (68,7±3,2 vs 61,3±3,0), desenvolvimento embrionário (47,0±3,7 vs 39,4±3,6) e re-expansão embrionária pós-aquecimento não diferiram (P>0,05) entre os tratamentos CONTR e GORD (3h: 77,5 vs 78,4%; 24h: 77,5 vs 81,1%), muito embora tenha sido observado um incremento numérico na taxa de sobrevivência embrionária após 24h de CIV pós-desvitrificação no grupo GORD. Já em uma segunda etapa, foi avaliado o efeito da adição de Ácido Linoléico Conjugado (CLA), Ácido Docosaexaenóico (DHA) ou CLA+DHA durante os cultivos de maturação, desenvolvimento ou ambos, sobre o desenvolvimento in vitro e sobrevivência embrionária após 3 e 24h de CIV pós-desvitrificação. Não houve efeito entre o tipo de PUFA utilizado, assim como o momento da suplementação sobre as taxas de clivagem, de desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos e de sobrevivência embrionária em relação ao grupo controle (P>0,05). As maiores taxas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effects of lipid supplementation on embryo development and cryotolerance of in vitro produced (IVP) bovine embryos. In a first step, was evaluated the effect of heifers dietary supplementation with a source of rumen protected fat, rich in polyunsaturated fatty acids (PUFAs) Omega 6 (n-6) and 3 (n-3) on follicular population, number of recovered oocytes, in vitro development and embryo survival after 3 and 24h of post-devitrification IVC. There was no significant difference (P>0.05) on follicular population (17.9±1.0 vs 15.8±1.0), number of recovered oocytes (14.4±1.4 vs 14.5±1.3) and number of viable oocytes (12.1±1.2 vs 12.5±1.1) for IVP embryos, respectively for CONTR and GORD groups. Similarly, the cleavage rate (68.7±3.2 vs 61.3±3.0), embryonic development (47.0±3.7 vs 39.4±3.6) and embryo re-expansion post-heating didn't differ (P>0.05) between CONTR and GORD treatments (3h: 77.5 vs 78.4%; 24: 77.5 vs 81.1%), although it has been observed a number increment on embryo survival rate after 24h of post-devitrification IVC on GORD group. In a second step, was evaluated the effect of addition of Conjugated Linoleic Acid (CLA), Docosahexaenoic acid (DHA) or CLA + DHA during maturation, development or both cultures on in vitro development and embryo survival after 3 and 24h of post-devitrification IVC. There was no effect between the type of PUFA used, and the time of supplementation on cleavage, embryo development until the blastocyst stage and embryo survival rates compared to the control group (P>0.05). The highest embryo survival rates after 3h of post-warming IVC were observed in groups supplemented with DHA during IVM (76.2%) or IVM+IVC (78.8%), differing significantly (P<0.05) of supplemented groups with CLA (52.7%) or CLA+DHA (55.3%), during IVM. There was no significant difference... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Resumo: Foram estudadas modificações feitas no tempo de maturação in vitro de oócitos bovinos, incubação dos espermatozóides e separação dos mesmos por gradiente de densidade de PercollTM, bem como a associação dessas técnicas antes da fecundação para que se consiga desviar a proporção sexual dos embriões para fêmeas. O controle de qualidade foi feito em cada etapa dos procedimentos avaliando-se os parâmetros de motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides, bem como taxa de clivagem e produção in vitro dos embriões. A proporção sexual foi avaliada pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e por transferências de embriões em receptoras. Pela técnica da PCR concluiu-se que a incubação dos espermatozóides em meio FIV sem heparina por 12 horas, desviou 59% o sexo dos embriões para fêmeas, a diminuição do tempo de maturação não desviou e essas duas técnicas associadas a centrifugação em gradiente não aumentaram o desvio da proporção sexual, porém o gradiente de sexagem foi eficaz em sexar 64% dos espermatozóides para fêmeas. Obteve-se uma taxa média de prenhez de 36,73% e uma proporção de fêmeas de 88,88% com embriões produzidos a partir da associação da redução no tempo de maturação dos oócitos ao gradiente de sexagem / Abstract: Were studied modifications made at the time of in vitro maturation of oocytes, sperm incubation and separation thereof by density gradient PercollTM as well as the combination of these techniques prior to fertilization to be able to divert the sex ratio of embryos females. Quality control was done at each stage of the procedures by evaluating the parameters of motility, vigor and concentration of spermatozoa and rate of cleavage and in vitro production of embryos. The sex ratio was assessed by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and embryo transfer into recipients. By the technique of PCR it was found that incubation of spermatozoa in IVF medium without heparin for 12 hours, 59% deviated sex of embryos for females, the reduction time of maturation is not shifted and associated with these two techniques do not increase the deviation of the sex ratio by gradient centrifugation, but the gradient was effective in sexing 64% of sperm to females. We obtained a mean pregnancy rate of 36.73% and a ratio of 88.88% of females with embryos produced from the combination of the reduction in the time of oocyte maturation to the gradient of sexing / Doutor

Orientador: José Buratini Júnior / Banca: Ciro Morais Barros / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O desenvolvimento da competência oocitária ocorre de forma gradual durante a foliculogênese e é dependente da interação do oócito com as células do cumulus via fatores parácrinos. O KL é expresso pelas células do cumulus e estimula a maturação nuclear do oócito em roedores, mas suas funções no complexo cumulus-oócito (CCO) bovino não são conhecidas. Neste trabalho, avaliou-se o padrão de expressão do KL, os efeitos do KL sobre a progressão da meiose e a expansão do cumulus, bem como a regulação da expressão do KL por fatores secretados pelo oócito (FSOs; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 e FGF17) durante a maturação in vitro (MIV) de CCOs bovinos. Adicionalmente, os efeitos do KL sobre a expressão de BMP15, GDF9, FGF16 e c-KIT foi avaliada. As isoformas do KL (KL1 e KL2) apresentaram padrões de expressão semelhantes nas células do cumulus ao longo da MIV, com pico de expressão às 12 horas do cultivo. A adição de KL ao cultivo aumentou a porcentagem de oócitos em meiose II e diminuiu a de oócitos em meiose I ao final da MIV, mas não afetou a expansão do cumulus. O FGF8 aumentou a expressão dos RNAm do KL1 e do KL2, enquanto a BMP15 estimulou apenas a expressão do RNAm do KL1. Distintamente, a dose máxima do FGF10 diminuiu a expressão do KL2 às 22 horas do cultivo em estudo dose-resposta, embora o mesmo não tenha sido observado quando uma dose menor, porém efetiva em estimular a expansão do cumulus, foi testada ao longo da MIV (4, 12 e 22 horas). O tratamento com FGF10 e BMP15 associados aumentou a expressão do KL1 às 12 horas do cultivo em relação ao controle e aos fatores de crescimento sozinhos, sugerindo cooperação entre eles na regulação da expressão do KL. A adição de KL ao meio de cultivo não alterou a expressão dos FSOs. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The development of oocyte competence occurs gradually during folliculogenesis and is dependent on the interaction of the oocyte with cumulus cells via paracrine factors. The KL is expressed by cumulus cells and stimulates oocyte nuclear maturation in rodents, but its functions in cumulus-oocyte complex (COC) cattle are unknown. In this study, we evaluated the expression pattern of KL, the effects of KL on the progression of meiosis and cumulus expansion and regulation of KL expression by factors secreted by the oocyte (OSF; BMP15, FGF8, FGF10, FGF16 and FGF17) during in vitro maturation (IVM) of bovine COCs. Additionally, the effect of KL on the expression of BMP15, GDF9, FGF16 and c-KIT was evaluated. Isoforms of KL (KL1 and KL2) showed similar expression patterns in cumulus cells along the MIV, with higher expression at 12 hours of cultivation. The addition of KL increased the percentage of oocytes in meiosis II and decreased oocyte meiosis I in the end of IVM, but did not affect cumulus expansion. The FGF8 increased expression of KL1 and KL2 mRNA, while only BMP15 stimulated mRNA expression KL1. Distinctly, the maximum dose of FGF10 decreased expression of KL2 at 22 hours of cultivation in dose-response study, although the same was not observed when a lower dose, but effective to stimulate cumulus expansion was tested along MIV (4, 12 and 22 hours). Treatment with FGF10 and BMP15 associated with increased expression of KL1 at 12 hours of culture in relation to the control and growth factors alone, suggesting cooperation between them in the regulation of expression of the KL. The addition of KL to the culture medium did not alter the expression of the FSOs. Taken together, our results suggest the involvement of KL in controlling bovine oocyte nuclear maturation and expression of KL in bovine cumulus cells is... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cesar Roberto Esper / Banca: Marcos Brandão Dias Ferreira / Resumo: Animais da raça Holandesa, criados nas regiões de clima temperado a quente apresentam baixa eficiência quanto ao número, qualidade e competência oocitária para a produção in vitro de embriões, em comparação às raças Zebuínas. Por outro lado o controle da onda folicular e a estimulação com FSH exógeno pode incrementar o número e melhorar a qualidade e competência oocitária para a produção embrionária. Com o objetivo comparativo sete novilhas, sete vacas não lactantes e sete vacas em lactação foram utilizadas em um delineamento em "crossover" foram submetidas a quatro tratamentos: T1 - Aspiração folicular ao acaso em dia aleatório do ciclo estral; T2 - Aspiração folicular dois dias após a remoção do folículo dominante; T3 - Aspiração folicular 24 horas após remoção do folículo dominante e estimulação com dose única de FSH (100 UI para novilhas e 200 UI para vacas não lactantes ou em lactação) vinte quatro horas antes da aspiração folicular; T4 - Aspiração folicular após estimulação e indução do pico de LH (inserção de implante de progestágeno, aspiração do folículo dominante e estimulação com FSH na dose de 250 UI para novilhas, 500 UI para vacas não lactantes e lactantes, subdividas em 8 doses decrescentes, indução de luteólise e retirada do implante 36 horas antes do GnRH e aspiração folicular 24 horas após a administração de GnRH). Não foi observada diferença estatística entre os tratamentos (P>0,05) quando foi avaliada a recuperação de oócitos, no entanto a categoria de novilhas obteve melhores resultados e apresentou diferença estatística (P<0,05) quando comparada com vacas lactantes e não lactantes, porém não foi observada diferença estatística entre as categorias vacas não lactantes ou vacas lactantes. Quando os oócitos viáveis foram avaliados, a categoria de novilhas apresentou melhor resultado e diferença significativa ... / Abstract: Holstein cows, bred in temperate to hot climate have low efficiency on the number, quality and oocyte competence for in vitro production of embryos, compared to Zebu breeds. On the other hand the control of follicular wave and stimulation with exogenous FSH can increase the number and improve the quality and oocyte competence for embryo production. With the comparative goal seven heifers, seven non-lactating cows and seven lactating cows were used in a complete "crossover" were subjected to four treatments: T1 - Follicular Aspiration randomly at any time of the estrous cycle; T2 - Follicular Aspiration two days after removal of the dominant follicle; T3 - Follicular Aspiration 24 hours after removal of the dominant follicle and stimulation with single dose of FSH (100 IU to 200 IU for heifers and non-lactating cows or lactating) twenty four hours before follicular aspiration; T4 - Follicular Aspiration after stimulation and induction of the LH surge (progestagen implant insertion, aspiration of the dominant follicle and FSH stimulation at a dose of 250 IU to 500 IU for heifers and non-lactating and lactating cows, subdivided in 8 decreasing doses, induce luteolysis and removal of the implant 36 hours before of the GnRH and follicular aspiration 24 hours after GnRH administration). No statistical difference between treatments (P>0.05) was evaluated oocyte retrieval was observed, however category heifers achieved better results and statistical differences (P<0.05) compared with lactating cows and non-lactating, although no statistical difference between the categories of non-lactating cows and lactating cows was observed. When the viable oocytes were evaluated, the grade of heifers showed better results and significant difference (P <0.05) compared with lactating and non-lactating cows, and no significant difference was observed between non-lactating cows and lactating cows (P>0.05). In relation to treatments, treatment 1 (T1) differed ... / Mestre