Las variables clínicas en pacientes sometidos a cirugía cardíaca(CCA) se asocian con el pronóstico a corto y largo plazo en términos de mortalidad y morbilidad. Se han estudiado variables postoperatorias, aunque también variables pre- e intraoperatorias habituales, realizándose 5 líneas de investigación: paciente cirrótico, Acute Kidney Injury(AKI), cociente Presión parcial de oxígeno arterial/ Fracción inspirada de oxígeno (PaO2/FIO2), niveles de lactato arterial(LA), y el Índice de Masa Corporal(IMC). En el paciente cirrótico sometido a CCA la presión venosa central inicial es un factor independiente asociado a mortalidad hospitalaria, mientras que un SAPS III elevado y el volumen de orina menor en las primeras 24h fueron predictores de mortalidad a largo plazo. El MELD score(sensibilidad(S):85.7%;especificidad(E):83.7%) y el SAPS III(S:83.3%;E:64.9%)tienen el mejor poder predictivo a corto y a largo plazo respectivamente en esta población. La supervivencia global en toda la muestra(n=59) fue peor según el grado de hepatopatía (82.4% para Child A, 47.6% para Child B y 33.3% para Child C;P=0.001). Las características asociados a la fisiopatología del paciente cirrótico deben tenerse en especial consideración a la hora de someter estos pacientes a CCA. El desarrollo de AKI en el período postoperatorio tuvo una incidencia del 14%. Identificamos un mayor tiempo de circulación extracorpórea(CEC), una mayor necesidad de drogas vasoactivas y un mayor LA a las 24h tras ingresar en UCI como predictores de AKI. Una peor supervivencia se asoció a un mayor grado de AKI según la escala RIFLE modificada:74.9% para el subgrupo Risk,42.9% para el Injury, y 22.3% para el Failure(P<0.001) (seguimiento medio de 6.9±4.3años), siendo estos dos últimos asociados de manera independiente a una mayor mortalidad. El desarrollo de estrategias para la prevención de los factores de riesgo es básico para mejorar no tan sólo la incidencia de AKI, sino los resultados de la CCA en general. El cociente PaO2/FIO2 puede ser útil para la identificación de pacientes de CCA con mal pronóstico en el postoperatorio inmediato. Valores más bajos a las 3h tras el ingreso en UCI son los más útiles en términos de predicción de mortalidad. Asimismo hay una mayor mortalidad intra-UCI y complicaciones respiratorias con PaO2/FIO2<241 a las 3h. También se asoció a una peor supervivencia intrahospitalaria en comparación con PaO2/FIO2>241 a las 3h (88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% IC:1.293–1.786;P=0.004). El LA elevado(>3.0mmol•L-1)es frecuente en el postoperatorio de CCA y su elevación se asocia a mal pronóstico. La presencia de un LA>3.0mmol•L-1 fue un predictor para mortalidad hospitalaria(OR:1.468; 95% IC:1.239–1.739;P<0.001) y para la mortalidad a largo plazo(HR:1.511;95% IC:1.251–1.825;P<0.001). El antecedente de un infarto de miocardio(IAM) reciente y sufrir un mayor tiempo de CEC fueron predictores de un LA. El patrón dinámico del LA fue similar en supervivientes y no supervivientes pero con mayores valores en no supervivientes(ANOVA de medidas repetidas, P<0.001). Asimismo, el área bajo la curva objetivó mayores niveles de LA en los no supervivientes(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). Nuestros resultados objetivan una dinámica parecida de la curva de LA entre supervivientes y no supervivientes con mayores valores en estos últimos, lo cual podría sugerir un mecanismo similar del LA pero con una mayor producción en los no supervivientes. Aquellos pacientes que presentaron un LA>3.0mmol•L-1 y su pico se objetivó a las 24h tuvieron peor supervivencia(79.1%vs.86.7–89.2%;P=0.03)comparados con aquellos que presentaron su pico al ingreso, a las 6h o a las 12h durante el postoperatorio. La obesidad influencia de manera notable la estratificación y planificación de la CCA. Algunos estudios han objetivado mejores resultados en la población obesa en comparación con la población con IMC normal respecto a la mortalidad y supervivencia. Tras ajustar las variables preoperatorias e intraoperatorias mediante propensity score, una peor oxigenación y mejor estado nutricional, reflejados por una peor PaO2/FiO2 y unos niveles más elevados de albúmina, fue observado en pacientes con IMC elevado. Los pacientes obesos mostraron mayor riesgo para IAM peroperatorio(OR:1.768;95% CI:1.035-3.022;P=0.037)y sepsis(OR:1.489;95% CI:1.282-1.997;P=0.005). No hubo diferencias en la mortalidad hospitalaria entre grupos, aunque los pacientes con sobrepeso mostraron una mejor supervivencia al año comparados con la población normal(91.2%vs.87.6%;P=0.029). A pesar de ello, nuestros resultados no apoyan el concepto obesity paradox, que puede ser el resultado de sesgos en los diferentes estudios publicados. La mejoría del estudio pronóstico de variables en el postoperatorio inmediato las convierte en herramientas a pie de cama que ayudan al clínico en la toma de decisiones e influyen en la supervivencia de sus pacientes. Sin lugar a dudas, una mejor precisión pronóstica conlleva una mejoría en establecer el grado de vigilancia y cuidados que requiere cada paciente, y en consecuencia, los recursos destinados. La mayor precisión en el pronóstico a largo plazo tiene obvias e importantes ventajas, tanto desde el punto de vista clínico del paciente a nivel individual como desde el punto de vista sanitario y social. / The clinical variables in patients undergoing cardiac surgery(CS) are associated with prognosis in the short and long-term scenario in terms of mortality and morbidity. Five main areas of research are discussed: cirrhosis, Acute Kidney Injury(AKI), ratio of arterial partial pressure/oxygen fraction of inspired oxygen(PaO2/FIO2), arterial blood lactate levels(LA) and Body Mass Index(BMI). In the cirrhotic patient undergoing CS central venous pressure was an independent factor associated with hospital mortality, whereas a high SAPS III and lower urine volume during the first 24h were predictors of long-term mortality. The MELD score (sensitivity(S):85.7%;specificity(E):83.7%)and SAPS III(S:83.3%;E: 64.9%)showed the best predictive power in the short and long term scenarios, respectively. Overall survival(n=59)was worse with the degree of liver disease(82.4% for Child A, 47.6% for Child B and 33.3% for Child C;P=0.001). The pathophysiology associated with cirrhosis should be taken into account when referring these patients to CS. The development of AKI in the postoperative period was 14%. We identify a longer cardiopulmonary bypass time(CPB), a greater need for vasoactive drugs and greater LA at 24h after ICU admission as predictors of AKI. Worse survival was associated with a greater degree of AKI according to the modified RIFLE scale: 74.9% for the Risk group, 42.9% for the Injury group, and 22.3% for the Failure group(P<0.001)(mean follow up 6.9±4.3years). The latter two were independently associated with increased mortality. Developing strategies for the prevention of AKI is essential to improve their incidence and also the survival after CS. The PaO2/FIO2 can be useful for identifying patients with poor prognosis in the immediate postoperative period. Lower values at 3h after admission to ICU are most useful in terms of prediction of mortality. There was also a greater intra-ICU mortality and respiratory complications with PaO2/FIO2<241 at this time. It was also associated with worse in-hospital survival compared with PaO2/FIO2>241(88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% CI:1293-1786;P=0.004). A higher LA(>3.0mmol•L-1)is associated with poor prognosis after CS. The presence of an LA>3.0mmol•L-1 was a predictor of hospital mortality(OR:1.468;95% CI:1.239-1.739;P<0.001)and for long-term mortality(HR:1.511;95% CI:1251-1825;P<0.001). A history of recent myocardial infarction(AMI)and a longer CPB time were predictors of higher LA. The dynamic pattern of LA was similar in survivors and non-survivors but with higher values in non-survivors(repeated measures ANOVA,P<0.001). Also, the area under the curve was higher in non-survivors(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). This might suggest a similar pathophysiology for LA but higher production in non-survivors. Those patients who had LA>3.0mmol•L-1 and its peak was at 24h after ICU admission had worse survival(79.1%vs.86.7-89.2%;P=0.03)compared with those who had their peak on admission, at 6 or 12 h postoperatively. Obesity influences significantly stratification risk of CS. However, some studies have showed better survival in the obese population compared to normal BMI population. After adjusting for confounding factors using propensity score, a worse oxygenation and better nutritional status, reflected by a lower PaO2/FiO2 and higher albumin levels, was showed in patients with higher BMI. Obese patients showed increased risk for perioperative AMI(OR:1.768;95% CI:1035-3022;P=0.037)and sepsis (OR:1.489;95% CI:1282-1997;P=0.005). There was no difference in hospital mortality between groups, although overweight patients showed better survival at one year compared to the normal population (91.2%vs.87.6%;P=0.029). However, our results do not support the obesity paradox, which may be the result of bias in different published studies. The improvement of the knowledge of clinical variables in the immediate postoperative period becomes a tool to help physicians in making decisions and influencing the survival of the patients who undergo CS. Undoubtedly, better prognostic accuracy implies an improvement in establishing the degree of resources by each patient. Indeed more accurate long-term prognosis has obvious and important advantages, both from the clinical and social point of view.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / El carcinoma broncogénico (CB) representa la primera causa de mortalidad por cáncer en ambos sexos en los países desarrollados. La evaluación prequirúrgica del mediastino es esencial para definir el pronóstico y guiar el tratamiento de estos pacientes. Las guías para la estadificación ganglionar mediastínica preoperatoria de la European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) recomiendan una exploración con certificación cito-histológica, ya sea con técnicas endoscópicas de punción guiada por ecografía o mediante una exploración quirúrgica del mediastino, en las siguientes situaciones: cuando la tomografía computerizada detecta ganglios mediastínicos de tamaño patológico, en tumores de localización central o cuando la tomografía por emisión de positrones (PET) muestra una hipercaptación mediastínica o hiliar. Así mismo, estas guías recomiendan la exploración y biopsia de, como mínimo, las siguientes estaciones ganglionares mediastínicas: paratraqueales inferiores derechas e izquierdas, y subcarínica, cuyo estudio puede llevarse a cabo mediante técnicas de punción eco-endoscópicas. Cuando no se dispone de estas técnicas o su resultado es negativo, debe realizarse una exploración quirúrgica del mediastino (principalmente una mediastinoscopia cervical estándar), por presentar un mayor valor predictivo negativo. En el caso de los tumores izquierdos también se recomienda explorar las estaciones ganglionares paraórtica y subaórtica, que no son accesibles a través de las técnicas de punción eco-endoscópica. Para llevar a cabo su exploración es necesaria una técnica quirúrgica como la mediastinotomía paraesternal izquierda, la mediastinoscopia cervical extendida (MCE) o la videotoracoscopia izquierda. La MCE permite explorar las estaciones paraórtica y subaórtica, utilizando la misma incisión cervical realizada para la mediastinoscopia cervical estándar, y por lo tanto, la vía transcervical permite una exploración completa del mediastino superior y de la ventana aorto-pulmonar. Los objetivos de la presente tesis, que se basa en dos artículos publicados y relacionados entre sí, son: evaluar los valores de estadificación obtenidos tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico de evaluación ganglionar mediastínica basado en las guías de estadificación de la ESTS, evaluar la rentabilidad de la MCE en la estadificación del CB izquierdo y, finalmente, evaluar la supervivencia de aquellos pacientes intervenidos quirúrgicamente con afectación ganglionar mediastínica insospechada N2p. El primer trabajo es un estudio retrospectivo (1998-2010) de 221 MCE de estadificación realizadas en pacientes con CB izquierdo. Se analizó la precisión diagnóstica de la técnica y del protocolo en 2 períodos: 1998-2003 con MCE sistemática y 2004-2010 con PET sistemática y MCE selectiva. Los resultados obtenidos mostraron que la MCE posee una elevada precisión diagnóstica (sensibilidad: 0.67; valor predictivo negativo: 0.94; exactitud diagnóstica: 0.95) para la detección clínica de N2. Su uso selectivo permite reducir la MCE en cerca del 30 % de los pacientes con sin disminuir el valor predictivo negativo del protocolo en ambos períodos. El segundo trabajo es un estudio retrospectivo (2004-2010) de 540 pacientes estadificados y operados siguiendo las guías de la ESTS. Se analizaron los valores de estadificación y la supervivencia del subgrupo de pacientes con resultado final N2p. Los resultados obtenidos mostraron que tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico basado en las guías de la ESTS se consigue unos valores de estadificación elevados (valor predictivo negativo: 0.91) con una baja tasa de falsos negativos (5.5%). Los pacientes con resultado final N2p insospechado presentan una mejor supervivencia (supervivencia a los 5 años del 40%) que la esperada en comparación con la observada en los pacientes quirúrgicos de la base de datos de la International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) utilizada para la 7ª edición de la clasificación TNM. En conclusión, las guías de la ESTS deben implementarse en la práctica clínica a la luz de los buenos resultados de estadificación y supervivencia. / Preoperative mediastinal staging is essential to predict prognosis and to guide treatment in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) guidelines for preoperative mediastinal nodal staging recommend tissue confirmation when computed tomography shows enlarged nodes, in central tumors or when positron emission tomography (PET) shows an increased mediastinal or hilar uptake. The recommendation is to explore the right and left inferior paratracheal, and subcarinal stations. In left-sided tumors, the exploration of subaortic and paraortic nodal stations is also recommended. This can be done by extended cervical mediastinoscopy (ECM). This thesis is based on two published and related articles, the objectives of which are: to evaluate the staging values after applying a preoperative mediastinal staging protocol according to the ESTS guidelines, to evaluate the accuracy of ECM for staging left-sided NSCLC and to evaluate the survival of surgically treated patients with unsuspected mediastinal pathological (p) N2 disease. The first publication is a retrospective study that includes 221 ECM for staging left NSCLC. The accuracy of the technique and of the protocol were calculated in two periods: 1998-2003 with systematic ECM and 2004-2010 with systematic PET and selective ECM. The results of this study show a high diagnostic accuracy of ECM (sensitivity: 0.67; negative predictive value: 0.94; accuracy: 0.95). Its selective indication allows reducing ECM in near 30% of the patients without reducing the negative predictive value of the protocol. The second publication is a retrospective study (2004-2010) including 540 patients staged and operated following the ESTS guidelines. The results of this study show that after applying the ESTS guidelines, high staging values (negative predictive value: 0.91) and low false negative rate (5.5%) are observed. Survival rate in patients with unsuspected pN2 disease was higher (5-year survival rate of 40%) than expected, compared with survival of surgical patients with pN2 of the International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) database used to inform the 7th edition of TNM classification. Therefore, the ESTS guidelines on preoperative mediastinal nodal staging should be used in clinical practice.

L’àcid maslínic (2a, 3ß-dihidroxilean-12-ene-28oic) és un triterpè pentacíclic que s’ha aïllat de diferents espècies vegetals, tant medicinals com comestibles, i al qual se li han atribuït efectes beneficiosos per a la salut. A la present memòria s’ha estudiat la toxicitat i la biodisponibilitat d’aquest compost per tal d’aprofundir en el seu coneixement. En primer lloc, s’ha posat a punt una tècnica per determinar l’àcid maslínic a plasma de rata mitjançant una doble extracció líquid-líquid i posterior anàlisi per HPLC-MS. Aquest mètode ha demostrat ser lineal (R>0,997), exacte (<4,82%), sensible (LLOQ 5 nM), precís, tant intra-dia (5,45%) com inter-dia (8,38%), amb una recuperació del 99% i un efecte matriu del 24%. El mètode va permetre la determinació de l’àcid maslínic a plasma 24 h després de l’administració oral de 10, 25 i 50 mg/kg a rates mascle Sprague-Dawley tot indicant que és apropiat per a ser emprat en estudis de biodisponibilitat. A continuació, s’ha avaluat si l’administració de dosis elevades d’àcid maslínic presenta efectes nocius seguint les normes OECD (2008). La toxicitat subaguda s’ha avaluat administrant l’àcid maslínic (50 mg/kg) diàriament per via oral a ratolins mascle Swiss CD-1 durant 28 dies. No s’han observat alteracions ni anomalies causades pel tractament ni en el pes corporal, ni en les magnituds hematològiques i bioquímiques ni a l’examen histopatològic dels òrgans vitals. Un cop establerta l’absència de resultats de rellevància toxicològica es va estudiar la biodisponibilitat, com a pas previ al seu ús futur com a nutricèutic. Per això, es va administrar el triterpè a rates mascle Sprague-Dawley per via oral (50 mg/kg) i intravenosa (1 mg/kg) i es va extreure sang a diferents temps durant 24 hores. Les concentracions plasmàtiques de l’àcid maslínic obtingudes després de l’administració oral i intravenosa van ser analitzades simultàniament seguint una aproximació poblacional amb el programa NONMEN. El model bicompartimental amb absorció de primer ordre i eliminació lineal és el que millor descriu el comportament de l’àcid maslínic a l’organisme. L’anàlisi de les constants farmacocinètiques indiquen que aquest compost bioactiu té una absorció relativament ràpida (Ka = 0,52 1/h) amb una concentració màxima de 4,03 µM a les 0,51 h i una biodisponibilitat del 5,13%. Per últim, s’han estudiat els metabòlits de l’àcid maslínic després de l’administració oral a rata (50 mg/kg), mitjançant l’HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. S’han identificat 7 metabòlits a plasma resultants del metabolisme de fase I, corresponents a les relacions massa/càrrega (m/z) de 487,3 (M1 - M4), 485,3 (M5) i 501,3 (M6 i M7) i a orina s’han detectat només 4 (M1, M4, M5 i M6) sent l’àcid maslínic majoritari en ambdues matrius. En conclusió, l’àcid maslínic no presenta efectes adversos in vivo, té una baixa biodisponibilitat i es metabolitza poc donant derivats únicament de fase I. Els resultats obtinguts constitueixen un primer pas en l’ús futur de l’àcid maslínic com a nutricèutic. / Maslinic acid (2a, 3ß-dihydroxyolean-12-en-28oic) is a pentacyclic triterpene isolated from medicinal and edible plants, and with health-enhancing effects. Therefore, the present work aims to assess the toxicity and bioavailability to get an in-depth knowledge of maslinic acid. Firstly, a method was set up to determine maslinic acid in rat plasma by means of a double liquid-liquid extraction and HPLC-MS analysis. The method is lineal, accurate, sensitive and precise with a recovery of 99% and a matrix effect of 24%. The method allowed the determination of maslinic acid in plasma withdrawn 24h after the administration of 10, 25 and 50 mg/kg to rats. Secondly, it was evaluated whether high doses of maslinic acid have harmful effects, following the OECD guidelines (2008). Subacute toxicological evaluation was performed through the daily oral administration of 50 mg/kg maslinic acid to mice for 28 days. The treatment did not modify the body weight and did not exert harmful effects as shown in the hematology, clinical biochemistry and histopathology evaluation. Thirdly, the bioavailability of maslinic acid has been studied by the administration of the triterpene to rats orally (50 mg/kg) and intravenously (1 mg/kg). Blood was collected at different times over 24 h and the plasmatic concentrations of maslinic acid obtained after both administrations were analyzed simultaneously following a population PK approach with the NONMEM software. These concentrations were best fitted to a bicompartmental model with first order absorption and lineal elimination processes. The pharmacokinetic parameters obtained indicate that maslinic acid has a relatively rapid absorption and a low bioavailability. Finally, the metabolites of maslinic acid were studied after its oral administration to rats (50 mg/kg) by HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. Seven metabolites were identified in plasma resulting from phase I reactions and corresponding to mass/charge ratios of 487.3 (M1 - M4), 485.3 (M5) and 501.3 (M6 and M7). Only 4 of them were detected in urine (M1, M4, M5 and M6). Maslinic acid was the main compound in both matrices. In conclusion, maslinic acid does not exert adverse effects in vivo, and has a low bioavailability and metabolism with biotransformations mainly attributable to phase I.

Nombroses malalties resulten d’una alteració de las propietats mecàniques dels teixits i/o d’una alteració en la resposta cel·lular a les forces (mecanotransducció). La fibrosi es el paradigma de la mecànica tissular alterada, caracterizant-se per una excessiva acumulació de matriu extracel·lular (MEC) que destrueix l’arquitectura de l’òrgan. La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una forma de malaltia pulmonar intersticial (MPI) de causa desconeguda i molt mal pronòstic, amb una supervivència del 30-50% als 5 anys. En aquest treball s’ha desenvolupat una estratègia de cribratge biomecànic que s’ha aplicat l’estudi de la FPI per identificar gens mecanosensibles potencialment rellevants com a dianes terapèutiques. Es van cultivar fibroblasts pulmonars primaris, la cèl·lula responsable del remodelat i enduriment de la MEC, en substrats coberts de col·lagen I de 5 rigideses distintes al llarg del rang fisiopatològic del pulmó, des de la normal (<1 kPa) fins la pròpia de la fibrosi (~30-40 kPa) i en presència de TGF-β. Es van incloure 3 classes de fibroblasts: FPI, control i MPI distintes de la FPI i es va realitzar un perfilat transcripcional mitjançant microarrays d’expressió. S’ha definit el mecanotranscriptoma dels fibroblasts pulmonars, format per 63 gens mecanosensibles, la transcripció dels quals està controlada pels canvis en les propietats mecàniques de la MEC. Un 57% dels gens van ser sobreexpressats amb l’enduriment i 21 gens van discriminar entre la FPI i las altres dos classes de fibroblasts. Para entendre las xarxes reguladores associades al mecanotranscriptoma, es va construir l’interactoma dels seus components, el qual va revelar tres xarxes emergents, les quals poden ser rellevants per entendre l’adaptació de les cèl·lules a l’enduriment del substrat en la FPI i en la mecanobiologia en general: 1) elements del citoesquelet i les fibres d'estrés, 2) quinases MAPK i les seves fosfatases i 3) proteïnes relacionades amb el factor de creixement similar a la insulina (IGF) i proteases del sistema de fibrinòlisi. Després de validar l’expressió a nivell de mRNA i de proteïna de diversos candidats del mecanotranscriptoma, es van caracteritzar diversos aspectes de la proteïna d’unió al factor de creixement similar a la insulina 3 (IGFBP-3). La concentració d’IGFP-3 secretada pels fibroblasts va ser distintivament superior en els fibroblasts de FPI. Per altra banda, amb l’enduriment del substrat es va detectar un factor de mecanosensibilitat de l’odre 3X en totes les classes de fibroblasts, mentre que el TGF-β la va induir 150 vegades. L’efecte dels dos factors va ser independent, mentre que la seva combinació va potenciar sinèrgicament els nivells d’IGFBP-3. L’efecte de la duresa del substrat en l’acumulació d’IGFBP-3 va ser independent de la senyalització a través del receptor de TGF-β. Per altra banda, els efectes van ser dependents del receptor de col·lagen integrina β1. Aquests resultats mostren que la IGFBP-3 es una proteïna important en la fibrogènesi pulmonar mediada por l’enduriment, que portaria a una acumulació de MEC i a la destrucció de l’arquitectura del teixit. / A new strategy based on a biomechanical screening has been developed and it was applied to the study of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) to identify mechanosensitive genes that might be potential therapeutic targets for the disease. The transcriptional profile of lung fibroblasts (control and fibrotic of different types) cultured on substrates of different stiffness spanning the normal to fibrotic (stiffened) range was obtained. The mechanotranscriptome of the cells was established, which consisted of 63 mechanosensitive genes, 57% of which were upregulated by tissue stiffening. It was built an interactome, showing the regulatory networks associated with the mechanotranscriptome, revealing three different subnetworks: 1) elements of the cytoskeleton and stress fibers; 2) MAPK quinases and their phosphatases; 3) proteins associated with insulin-like growth factor and the fibrinolysis pathway. After validating expression at the mRNA and protein levels for different selected candidates from the mechanotranscriptome, different biological aspects of insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP-3) were analyzed. Concentration of IGFBP-3 secreted by fibroblasts was distinctively higher in IPF fibroblasts. With substrate stiffening, a mechanosensitivity factor of 3X was detected in all classes of lung fibroblasts, while transforming growth factor- β (TGF- β) induced protein levels by 150X. The effect of tissue stiffening on IGFBP-3 accumulation was independent of signaling through the TGF-β receptor and dependent of the collagen receptor integrin β1. These results show that IGFBP-3 is an important protein for lung fibrogenesis mediated through stiffness and that it could lead to an accumulation of extracellular matrix and contribute to the destruction of the lung architecture.

Los sistemas SPECT de animal pequeño alcanzan una resolución espacial inferior al milímetro. Para conseguirlo, es necesario utilizar colimadores pinhole, ya que la imagen del objeto proyectada en la gammacámara a través del pequeño orificio del colimador puede estar ampliada respecto al objeto. Con el fin de optimizar el proceso de reconstrucción y obtener resoluciones submilimétricas utilizando equipos de pequeño formato equipados con un colimador pinhole, es necesario utilizar métodos de reconstrucción iterativos. Estos algoritmos ofrecen una calidad de imagen superior y una mejor exactitud en la cuantificación que los métodos de reconstrucción analíticos, al poder corregir las diferentes degradaciones sufridas en el proceso de formación de la imagen. A continuación se detalla el trabajo desarrollado y los principales resultados obtenidos para conseguir este objetivo: 1. Implementación de un programa de calibración para calcular los parámetros geométricos que describen la adquisición de un equipo SPECT equipado con colimador pinhole. 2. Desarrollo de un algoritmo de reconstrucción iterativa OSEM para la reconstrucción de estudios SPECT con colimador pinhole. 3. Adaptación el algoritmo de reconstrucción y el programa de calibración a un equipo SPECT con colimador pinhole de pequeño formato desarrollado en nuestro centro. La resolución tomográfica del equipo fue de 1 mm para radios de adquisición pequeños. Las imágenes reconstruidas de estudios en ratones muestran la viabilidad del equipo para su utilización con pequeños animales. 4. Incorporación en la matriz de transición del sistema la geometría del sistema, la penetración septal a través del colimador y la respuesta del detector. La resolución, el contraste y los coeficientes de recuperación mejoran al incorporar la penetración septal respecto a la modelización geométrica, aunque la mejora más importante se obtuvo al incluir la respuesta del detector. El número de iteraciones utilizadas en la reconstrucción debe limitarse para evitar la aparición de artefactos de anillo. Estos artefactos son de mayor importancia cuando la modelización del sistema incorpora la geometría, la penetración septal y la respuesta del detector. 5. Comparación del algoritmo de reconstrucción desarrollado con un algoritmo de reconstrucción que calcula la matriz de transición con técnicas de Monte Carlo. El tiempo de cálculo de la matriz de transición del sistema con la aproximación analítica fue tres órdenes de magnitud inferior al de la aproximación por Monte Carlo. La resolución y el contraste de las imágenes reconstruidas mediante ambas aproximaciones fueron similares. Las imágenes reconstruidas con el modelo Monte Carlo presentaban una relación señal/ruido sensiblemente más baja, posiblemente asociada a problemas de precisión en el cálculo de los elementos de matriz por la utilización de un número insuficiente de historias de fotones en el cálculo. / Small animal SPECT systems can achieve a spatial resolution of less than 1 mm. Such resolution is possible thanks to pinhole collimators, which can amplify the gamma camera projection of the object, and by using iterative reconstruction methods. These methods improve image quality and offer better quantification accuracy than analytic reconstruction methods, by correcting the different degradations that occur during the image formation process. The work developed and the main results are detailed as follows: 1. A calibration program to calculate geometric parameters that describe the acquisition process of a SPECT system with a pinhole collimator was implemented. 2. An OSEM iterative reconstruction algorithm for SPECT studies acquired with a pinhole collimator was developed. 3. The reconstruction algorithm and the calibration program were adapted to an in-house developed small SPECT device with a pinhole collimator. Tomographic resolution was 1 mm for small acquisition radii. Image reconstruction of mice studies showed the viability of using the equipment with small animals. 4. System geometry, septal penetration through the collimator and detector were incorporated response to the transition matrix. In the first approach, the system geometry was incorporated. Resolution, contrast, and recovery coefficients improved when septal penetration was modeled, although the greatest improvement was obtained when detector response was included. Iterations had to be limited to avoid the appearance of ring-artifacts. 5. The reconstruction algorithm developed (analytical model) was compared with a reconstruction algorithm which calculates the transition matrix based on Monte Carlo techniques (Monte Carlo model). The computation time of the transition matrix system using the analytical approach was three orders of magnitude lower than the Monte Carlo approach. Resolution and contrast of the reconstructed images using the two approaches were similar. Images reconstructed with the Monte Carlo model presented a lower signal-to-noise ratio than images reconstructed with the analytical model, possibly due to accuracy problems associated with the matrix elements because of an insufficient number of photons in the calculation.

The DOMON domain is a domain widespread in nature, predicted to fold in a β-sandwich structure. In plants, AIR12 is constituted by a single DOMON domain located in the apoplastic space and is GPI-modified for anchoring to the plasma membrane. Arabidopsis thaliana AIR12 has been heterologously expressed as a recombinant protein (recAtAIR12) in Pichia pastoris. Spectrophotometrical analysis of the purified protein showed that recAtAir12 is a cytochrome b. RecAtAIR12 is highly glycosylated, it is reduced by ascorbate, superoxide and naftoquinones, oxidised by monodehydroascorbate and oxygen and insensitive to hydrogen peroxide. The addition of recAtAIR12 to permeabilized plasma membranes containing NADH, FeEDTA and menadione, caused a statistically significant increase in hydroxyl radicals as detected by electron paramagnetic resonance. In these conditions, recAtAIR12 has thus a pro-oxidant role. Interestingly, AIR12 is related to the cytochrome domain of cellobiose dehydrogenase which is involved in lignin degradation, possibly via reactive oxygen species (ROS) production. In Arabidopsis the Air12 promoter is specifically activated at sites where cell separations occur and ROS, including •OH, are involved in cell wall modifications. air12 knock-out plants infected with Botrytis cinerea are more resistant than wild-type and air12 complemented plants. Also during B. cinerea infection, cell wall modifications and ROS are involved. Our results thus suggest that AIR12 could be involved in cell wall modifying reactions by interacting with ROS and ascorbate. CyDOMs are plasma membrane redox proteins of plants that are predicted to contain an apoplastic DOMON fused with a transmembrane cytochrome b561 domain. CyDOMs have never been purified nor characterised. The trans-membrane portion of a soybean CyDOM was expressed in E. coli but purification could not be achieved. The DOMON domain was expressed in P. pastoris and shown to be itself a cytochrome b that could be reduced by ascorbate.

The thesis is set in three different parts, according to the relative experimental models. First, the domestic pig (Sus scrofa) is part of the study on reproductive biotechnologies: the transgenesis technique of Sperm Mediated Gene Transfer is widely studied starting from the quality of the semen, through the study of multiple uptakes of exogenous DNA and lastly used in the production of multi-transgenic blastocysts. Finally we managed to couple the transgenesis pipeline with sperm sorting and therefore produced transgenic embryos of predetermined sex. In the second part of the thesis the attention is on the fruit fly (Drosophila melanogaster) and on its derived cell line: the S2 cells. The in vitro and in vivo models are used to develop and validate an efficient way to knock down the myc gene. First an efficient in vitro protocol is described, than we demonstrate how the decrease in myc transcript remarkably affects the ribosome biogenesis through the study of Polysome gradients, rRNA content and qPCR. In vivo we identified two optimal drivers for the conditional silencing of myc, once the flies are fed with RU486: the first one is throughout the whole body (Tubulin), while the second is a head fat body driver (S32). With these results we present a very efficient model to study the role of myc in multiple aspects of translation. In the third and last part, the focus is on human derived lung fibroblasts (hLF-1), mouse tail fibroblasts and mouse tissues. We developed an efficient assay to quantify the total protein content of the nucleus on a single cell level via fluorescence. We coupled the protocol with classical immunofluorescence so to have at the same time general and particular information, demonstrating that during senescence nuclear proteins increase by 1.8 fold either in human cells, mouse cells and mouse tissues.

Speeding the VO2 kinetics results in a reduction of the O2 deficit. Two factors might determine VO2 kinetics: oxygen delivery to muscle (Tschakovsky and Hughson 1999) and a muscle 'metabolic inertia' (Grassi et al. 1996). Therefore, in study 1 we investigated VO2 kinetics and cardiovascular system adaptations during step exercise transitions in different regions of the moderate domain. In study 2 we investigated muscle oxygenation and cardio-pulmonary adaptations during step exercise tests before, after and over a period of training. Study 1 methods: Seven subjects (26 ± 8 yr; 176 ± 5 cm; 69 ± 6 kg) performed 4 types of step transition from rest (0-50W; 0-100W) or elevate baseline (25-75W; 25-125W). GET and VO2max were assessed before testing. O2 uptake and were measured during testing. Study 2 methods: 10 subjects (25 ± 4 yr; 175 ± 9 cm; 71 ± 12 kg) performed a step transition test (0 to 100 W) before, after and during 4 weeks of endurance training (ET). VO2max and GET were assessed before and after of ET (40 minutes, 3 times a week, 60% O2max). VO2 uptake, Q and deoxyheamoglobin were measured during testing. Study 1 results: VO2 τ and the functional gain were slower in the upper regions of the moderate domain. Q increased more abruptly during rest to work condition. Q τ was faster than VO2 τ for each exercise step. Study 2 results: VO2 τ became faster after ET (25%) and particularly after 1 training session (4%). Q kinetics changed after 4 training sessions nevertheless it was always faster than VO2 τ. An attenuation in ∆[HHb] /∆VO2 was detectible. Conclusion: these investigations suggest that muscle fibres recruitment exerts a influence on the VO2 response within the moderate domain either during different forms of step transition or following ET.

PART 1. EFECTE DE LA HIPÒXIA I FACTORS POINFLAMATORIS SOBRE EL REMODELAT CARDÍAC EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. Els mecanismes moleculars pels quals la isquèmia miocardíaca es tradueix en remodelat ventricular i insuficiència cardíaca són poc coneguts. HIPÒTESI. La hipòxia i factors proinflamatoris són inductors específics de recanvi de matriu extracel•lular en els cardiomiòcits humans. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars humans adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condicions de tensió reduïda d’oxigen, CoCl2 (activador del factor de transcripció induïble per hipòxia 1, HIF-1), rotenona (inhibidor de HIF-1), TNFα, IL1β, LPS o vehicle durant intervals de temps variables. Un cop completats els períodes d’incubació, van obtenir-se els sobrenadants i el RNA cel•lulars per determinar la secreció cel•lular i l’expressió gènica de factors relacionats amb el recanvi de matriu extracel•lular. RESULTATS. La hipòxia indueix la producció de PIIINP (propèptid aminoterminal del del procolàgen tipus III) i inhibeix la síntesi i producció de TIMP1 (inhibidor tissular de metaloproteinases tipus 1) en els cardiomiòcits. La IL1β estimula la producció de PIIINP, TIMP1 i àcid hialurònic en cardiomiòcits. CONCLUSIÓ. La hipòxia i la IL1β activen el remodelat de matriu extracel•lular en cardiomiòcits ventriculars humans. Els resultats suggereixen que la hipòxia i la IL1-β són factors contribuents a la dilatació ventricular i insuficiència cardíaca en la malaltia cardíaca isquèmica. PART 2. EFECTE DE LA HIPÒXIA SOBRE LA SECRECIÓ DEL PÈPTID NATRIURÈTIC TIPUS B (BNP) EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. El principal estímul per la síntesi i secreció de BNP es la distensió de la paret cardíaca. Evidències recents suggereixen que la isquèmia cardíaca pot induir també la producció de BNP. HIPÒTESI. La tensió reduïda d’oxigen estimula directament l’expressió gènica i la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans en absència d’estímuls hemodinàmics o neurohormonals. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condiciones normòxiques o hipòxiques amb o sense la presència de rotenona. L’acumulació de BNP, ANP i VEGF es va mesurar en els sobrenadants cel•lulars. L’expressió gènica d’aquests factors va determinar-se mitjançant PCR a temps real. L’activitat transcripcional de HIF-1 va determinar-se en extractes nuclears cel•lulars mitjançant un enziminmunoassaig lligat a la seqüència d’unió de HIF-1 al DNA. RESULTATS. L’activitat transcripcional de HIF-1 va induir-se en condicions hipòxiques. La hipòxia va estimular la secreció i l’expressió gènica de BNP i VEGF però no d’ANP en els cardiomiòcits. La inhibició de HIF-1 en condicions hipòxiques va disminuir la secreció de BNP i VEGF. CONCLUSIONS. La hipòxia indueix la síntesi i secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans a través d’un mecanisme depenent de l’activació transcripcional de HIF-1. PART 3. ESTUDI DE LA SIGNIFICACIÓ CLÍNICA DE LES CONCENTRACIONS PLASMÀTIQUES DE BNP A L’INGRÉS EN PACIENTS AMB SÍNDROME CORONÀRIA AGUDA (SCA). INTRODUCCIÓ. Els pacients SCA presenten concentracions plasmàtiques elevades de BNP atribuïdes a la distensió de la paret ventricular. Existeix poca informació sobre el valor clínic d’aquest marcador cardíac en pacients amb SCA i fracció d’ejecció ventricular esquerra (LVEF) preservada. La demostració que la hipòxia estimula directament la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars permet formular la hipòtesi que els pacients amb SCA sense insuficiència cardíaca i/o disfunció ventricular presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades, en relació al grau d’hipòxia cel•lular. Mètodes. L’estudi es va realitzar en 1806 pacients amb SCA ingressats de forma consecutiva dins les primeres 24 hores posteriors a l’inici dels símptomes. Es va realitzar un seguiment durant un any de l’aparició d’esdeveniments adversos. RESULTATS. La concentració plasmàtica de BNP en els pacients amb SCA i LVEF preservada va ser superior a l’observada en un grup control d’individus sans. Durant el seguiment, l’aparició d’esdeveniments adversos va ser del 10,0% en els pacients amb LVEF reduïda i del 7,9% en els pacients amb LVEF preservada. Els pacients amb BNP>150 pg/ml van presentar una major probabilitat d’esdeveniments adversos. L’anàlisi estadístic multivariat mostra que la contribució de BNP en la predicció d’esdeveniments adversos es manté desprès d’ajustar en funció de la LVEF. CONCLUSIONS. Els pacients amb SCA i LVEF preservada presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades a l’ingrès, que constitueixen un factor predictor independent de presentar nous episodis de SCA i/o mortalitat. / MOLECULAR MECHANISMS OF MYOCARDIAL SECRETION: VENTRICULAR REMODELING AND SECRETION OF B-TYPE NATRIURETIC PEPTIDE. The molecular mechanisms by which myocardial ischemia translates in ventricular remodeling and heart failure remain unclear. In the current thesis it was explored whether hypoxia and proinflammatory factors are specific inducers of matrix remodeling in cardiomyocytes. Adult human ventricular cardiomyocytes (AC16 cells) were incubated at normoxic or hypoxic conditions and stimulated with proinflammatory factors. Matrix remodeling and cellular secretion and gene expression of matrix remodeling factors were analyzed. Results show that hypoxia activates matrix remodeling and induces the production of PIIINP (procollagen III N-terminal propeptide) and inhibits the production of TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1). IL1β stimulated the cardiac production of PIIINP, TIMP1 and hyaluronic acid. Results suggest that hypoxia and IL1β may contribute to ventricular dilation and heart failure in ischemic heart diseases. The effect of hypoxia on the cardiac secretion of B-type natriuretic peptid (BNP) was also evaluated. Hypoxia stimulated the protein release and mRNA levels of BNP and VEGF but not ANP in AC16 cells. The analysis of the transcriptional activity of the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) in nuclear extracts showed that HIF-1 activity was induced under hypoxic conditions. The treatment of AC16 cells with the HIF-1 inhibitor rotenone in hypoxia inhibited BNP and VEGF release. In conclusion, data indicate that hypoxia induces the synthesis and secretion of BNP in human ventricular myocytes, likely through HIF-1-enhanced transcriptional activity. This observed direct effect of hypoxia on BNP secretion in human ventricular myocytes allowed hypothesizing that patients with acute coronary syndromes (ACS) without ventricular dysfunction or heart failure present high plasma levels of BNP related with their degree of cardiac hypoxia. Thus, prognostic significance of BNP plasma levels was evaluated in a cohort of 1806 consecutive patients with ACS admitted within the first 24 hours after the onset of symptoms. The follow up for adverse events was of one year. Plasma levels of BNP in ACS patients with preserved left ventricular ejection fraction (LVEF) were higher than in the control group without ACS. During follow-up, adverse events was 10.0 % in patients with reduced LVEF and 7.9 % in patients with preserved LVEF. Patients with BNP>150 pg/ml presented significantly higher probability of adverse events during follow up. Results show that ACS patients with preserved LVEF present higher BNP levels at admission, which constitute an independent predictor of presenting new ACS and mortality.

La soca de ratolins amb senescència accelerada SAMP8 és utilitzada habitualment com a model de senescència; i el seu ús per a l’estudi de la malaltia d’Alzheimer s’ha estès degut a la manifestació espontània dels seus trets histopatològics distintius. En estudis recents es va identificar la presència de grànuls amiloides a l’hipocamp dels ratolins SAMP8. Aquests clústers de grànuls augmenten amb l’edat i s’estenen al llarg de l’hipocamp. A més a més, les característiques morfològiques dels grànuls amiloides són molt similars als grànuls tenyits amb Periodic Acid Schiff (PAS), descrits anteriorment en els SAMP8 i en ratolins envellits d’altres soques. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la composició, l’origen i el desenvolupament dels grànuls que apareixen amb l’edat a l’hipocamp dels ratolins senescents SAMP8 amb la finalitat d’aportar nova informació sobre la neuropatologia d’aquests ratolins per al seu ús com a model de la malaltia d’Alzheimer. En aquest treball s’ha identificat la correspondència entre els grànuls amiloides i els grànuls PAS de l’hipocamp d’aquests animals. Aquests grànuls són el resultat d’un procés degeneratiu present en els astròcits i que pot afectar també zones properes, i estan formats per fragments membranosos provinents de l’acumulació de restes d’estructures i orgànuls, com els mitocondris. A més a més, s’ha identificat la presència d’un neo-epítop en el nucli dels grànuls que és, almenys parcialment, de naturalesa glucídica. Aquest neo-epítop és reconegut per anticossos IgM contaminants presents en anticossos comercials produïts en ascites de ratolí o sèrum de ratolí i conill. Aquestes IgM contaminants són probablement anticossos naturals, i algunes IgM hemaglutinen de forma positiva i específica els eritròcits humans de tipus A. La presència tant del neo-epítop com de les IgMs han estat la causa de falses tincions positives que han generat interpretacions errònies del significat fisiopatològic dels grànuls. És el cas, per exemple, de la presència de β-amiloide o la proteïna tau en aquestes estructures. Finalment, les lesions cerebrals de pacients associades a malalties neurodegeneratives i a l’envelliment no corresponen als clústers de grànuls de l’hipocamp d’aquests ratolins, tot i que seria interessant estudiar la presència del neo-epítop en aquestes condicions fisiopatològiques. / SAMP8 mice present an accelerated senescence and are usually used as a model of aging. Because this strain of mice spontaneously expresses several histopathological features of Alzheimer’s disease (AD), it has been recently used as a model for studying this disease. Alterations in the expression of β-amyloid (Aβ) peptides, tau hyperphosphorilation, an increase of oxidative stress and gliosis suggest that SAMP8 mice could be a relevant model for studying the first stages of sporadic AD and its relation to aging. Recent studies in our group identified the presence of Aβ clustered granules in the hippocampus of SAMP8 mice when immunohistochemical stainings were performed with antibodies directed against Aβ peptides. These clustered granules increase in number and extension with age, and they spread throughout the hippocampus. The features of Aβ clustered granules are very similar to the granules stained with Periodic Acid Schiff (PAS) already described in SAMP8 mice, as well as in aged mice of other strains. On the other hand, human brain lesions present in aging and other neurodegenerative diseases, such as AD, may vary their chemical composition with time, suffering substantial alterations in the principal components and the addition of secondary components. The main objective of this thesis is to study the composition, origin and development of the granules that appear with age in the hippocampus of SAMP8 mice, with the aim of further describing the neuropathology of these animals and provide new information for using them as a murine model of AD. Therefore, in this thesis we studied the composition and order of appearance of the constituents of the hippocampal granules of SAMP8 mice, and the possible coincidence between Aβ and PAS granules. The morphology, ultrastructure, cellular origin and formation process of these structures has been also ascertained; and a comparison between these structures and human brain lesions of neurodegenerative diseases have been performed. The results obtained in this thesis allowed reaching several conclusions. The pathological clustered granules of the hippocampus of aged SAMP8 mice correspond to the PAS granules described in aged mice of several mouse strains. These granules are the result of a degenerative process located in astrocytes that could affect the surrounding neuropil. In the granules formation process, several abnormal membranous structures and cellular organelles, like mitochondria, produce membranous waste that finally accummulates forming the core of the granules. On the other hand, a neo-epitope absent before the granules formation appears in the membranous residues. This neo-epitope is located in the nucleus of the mature granules and contains at least some structures of glycosidic nature. The neo-epitope is recognized by contaminant IgM antibodies present in a wide range of commercial antibodies produced in mouse ascites or mouse and rabbit sera, which are probably natural antibodies, and some of these IgMs haemmagglutinate A-type human erythrocytes, but not B and O subtypes. The neo-epitope could be considered an A-like epitope because monoclonal antibodies anti-A-type human erythrocytes do not recognize it. Both the neo-epitope presence in the granular structures and the IgMs contained in commercial antibodies have been the cause of false-positive stainings, and as a result, they have generated misunderstandings about the composition and physiopathological significance of the hippocampal granules of aged mice, as is the case of Aβ peptides and tau protein, which are not contained in these granules. Finally, human brain lesions described to date in patients of neurodegenerative diseases or aged individuals do not correspond to the clustered pathological granules present in the hippocampus of aged mice. The study of the presence of the neo-epitope in diseased human brain could be interesting in the understanding of the neuropathology of aging and neurodegenerative diseases.