TESIS DOCTORAL:Reducción de la deposición de grasa abdominal en el pollo de carne mediante la modificación del perfil de ácidos grasos de la dieta.Nieves Crespo AlcarriaTanto la selección genética y la utilización de dietas cada vez más energéticas han permitido un aceleramiento de la velocidad de crecimiento del pollo. Así, mientras que en los años 50 eran necesarios unos 85 días para que un pollo de carne alcanzara un peso de 1.800 gramos, actualmente este periodo se reduce a 36 días, y además se acompaña de una mejora en el índice de conversión de más de un 50%. Sin embargo, paralelamente a esta mayor velocidad de crecimiento se ha producido un mayor engrasamiento de la canal.En el procesado industrial, la grasa de la carcasa constituye una pérdida económica importante. Si además consideramos la mayor aceptación de los productos con bajo contenido en grasa, por parte de los consumidores se justifica el interés por conseguir una reducción en la deposición de grasa corporal en el pollo de carne.Numerosos trabajos realizados en mamíferos y algunos realizados en pollos sugieren que la sustitución de grasa saturada por poliinsaturada en la dieta del pollo podría producir un menor engrasamiento de la canal. En la presente tesis se estudió el efecto de dietas con diferentes perfiles de ácidos grasos sobre la deposición de grasa y el metabolismo lipídico del pollo de carne o Broiler. Se utilizaron 4 tipos de grasa con diferente grado de insaturación a un nivel de inclusión en el pienso del 10%: sebo (rico en ácidos grasos saturados), aceite de oliva (rico en ácidos grasos monoinsaturados), aceite de girasol (rico en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-6) y aceite de linaza (rico en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3). Los objetivos principales fueron determinar el efecto de los diferentes tipos de grasa en la dieta sobre:  Los parámetros productivos del pollo La deposición de grasa corporal, abdominal y en otros depósitos lipídicos definidos La retención de energía, proteína, grasa y ácidos grasos La síntesis hepática de ácidos grasos Determinados parámetros bioquímicos relacionados con la deposición de grasa en el pollo (VLDL, glucosa e insulina). Los resultados obtenidos demostraron que las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados mejoran el índice de conversión en el pollo Broiler hasta un 10%. El porcentaje de grasa abdominal y de otros depósitos lipídicos definidos disminuyó de forma significativa (aproximadamente 30g) con las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados. Por otro lado se observó una mayor beta-oxidación de ácidos grasos en los pollos alimentados con las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados dando lugar a una menor eficiencia energética de estas raciones. Sin embargo, al determinar la síntesis de ácidos grasos hepáticos, se observó que la dieta con linaza producía un mayor grado de lipogénesis que el resto de dietas estudiadas. Por tanto, se concluye que las dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados reducen la deposición de grasa en el pollo de carne. Sin embargo, los resultados indican que no es la modificación de la actividad lipogénica la principal causa de la reducción de la deposición de grasa por los AGPI de la dieta, sino que sería la mayor actividad oxidativa de ácidos grasos y por tanto, la menor eficiencia energética de las dietas suplementadas con dichos ácidos grasos para la deposición de energía. Teniendo en cuenta la escasa contribución de la síntesis endógena de ácidos grasos a la deposición de grasa en pollos alimentados con dietas con un alto porcentaje de inclusión de grasa cualquier modificación en dicha actividad no habría de suponer una modificación detectable en la deposición de grasa corporal ya que podría ser totalmente compensada por la deposición directa de grasa dietética que se produce con estas raciones. / Reduction of abdominal fat deposition in Broiler chicken by dietary fatty acid profile modification.Nieves Crespo AlcarriaGenetic selection and use of energetic rations has led to an increase in broiler growth. Fifty years ago chickens spend 85 days to reach 1.800g of body weight. Nowadays this period has been reduced to 36 days and moreover feed conversion ratio has been improved in more than 50%. However, as a consequence of this higher growth it has been produced higher carcass fat deposition.In the processing plant, carcass fat constitute important economic loses. If we also take into account the higher acceptance of low fat content products by consumer, this justifies interest to obtain a reduction in body fat deposition of chickens.Several works performed in mammals and some in chickens suggest that substitution of saturated fat by polyunsaturated fat in feed could reduce carcass fat deposition.In the present work the effect of feed with different fatty acid profile on fat deposition and lipid metabolism in the chicken was studied. Four types of fat with different saturation level were used at 10% inclusion level. Tallow was added as a source of saturated fatty acid, olive oil as a source of monounsaturated fatty acids, sunflower oil as a source of polyunsaturated fatty acids of n-6 series and linseed oil as a source of polyunsaturated fatty acids of n-3 series.Main objectives were to determine the effect of different dietary fats on: Performance parameters of broiler chickens. Body and abdominal fat deposition and fat deposition in other separable fat depots. Energy, protein, fat and fatty acid deposition. Hepatic lipid synthesis. Biochemical parameters related with fat deposition in broiler chicken (VLDL, glucose and insulin).Obtained results show that diets rich in polyunsaturated fatty acids improve feed conversion ratio in about 10%.Percentage of abdominal fat and other separable fat depots was significantly reduced with diets rich in polyunsaturated fatty acids. This reduction reached values of about 30g of adipose tissue.On the other hand, higher fatty acid beta-oxidation was obtained in broilers fed diets rich in polyunsaturated fatty acids which could lead to lower energetic efficiency of feed. Results of hepatic fatty acid synthesis showed higher levels in broilers fed diet with added linseed oil, respect to the rest of the diets.It was concluded that diets rich in polyunsaturated fatty acids reduce fat deposition in broiler chicken. Results suggest that the main cause of fat reduction by polyunsaturated fatty acids is not a modification in lipogenesis level but also the higher fatty acid beta-oxidation observed with these diets, that would lead to lower energetic efficiency of the diet to fat deposition. Taking into account the low contribution of endogenous fatty acid synthesis to fat deposition in broilers fed high fat diets, any modification in this endogenous activity would not lead to a modification in body fat deposition as it would be compensate by direct dietary fat deposition.

Les hormones del sistema renina-angiotensina-aldosterona i la vasopressina són essencials pel manteniment de l’homeòstasi del Na+ i del volum del líquid extracel•lular. En el còlon distal de rata, l’aldosterona regula l’expressió del canal apical de Na+ (ENaC) i l’activitat de l’ATPasa depenent de Na+ i K+, i també té efectes tròfics, estimulant la proliferació dels miofibroblasts de la beina pericriptal. Els objectius principals d’aquest treball són aprofundir en els mecanismes implicats en la funció del còlon en reabsorbir Na+ i aigua, conèixer el paper de l’aldosterona i de la vasopressina i establir la funció reguladora d’aquestes hormones a nivell dels colonòcits i dels miofibroblasts. Els estudis s’han fet en un model in vitro emprant colonòcits humans de la línia T84 i miofibroblasts de la línia CCD-18Co. L’aldosterona estimula la proliferació cel•lular dels miofibroblasts, augmenta l’expressió de l’mRNA de l’EGF i la seva concentració al medi de cultiu al cap de 24 h. L’addició exògena de l’EGF estimula els miofibroblasts de forma similar al tractament amb l’hormona. A més, quan els CCD-18Co són pre-incubats amb l’anticòs anti-EGF o amb l’inhibidor del receptor de l’EGF i, posteriorment, tractats amb l’aldosterona s’inhibeix la proliferació cel•lular, fet que indica que els efectes de l’aldosterona sobre la proliferació són mediats per l’EGF mitjançant les vies reguladores PI3K/AKT i Ras/Raf/MAPK. La incubació dels colonòcits amb medi provinent dels CCD-18Co tractats amb aldosterona (medi condicionat), incrementa la proliferació cel•lular i l’expressió de proteïnes de les unions estretes. Aquests efectes no s’han observat amb l’addició directe de l’aldosterona als colonòcits. Experiments realitzats in vivo suggereixen que l’EGF també hi té un paper mediador donat que s’observa un increment en la fosforilació del receptor d’EGF en els animals que presenten hiperaldosteronisme secundari. Pel que fa a la vasopressina, el tractament dels miofibroblasts amb aquesta hormona estimula la proliferació cel•lular i l’expressió de l’mRNA del PDGFA al cap de 24 h. El PDGFA afegit de forma exògena estimula les cèl•lules CCD-18Co de forma similar a l’observada amb la vasopressina. A més, quan les cèl•lules es pre-incuben amb l’anticòs anti-PDGFA o amb l’inhibidor del receptor del PDGFA i són tractats amb vasopressina, s’inhibeixen els efectes hormonals. La proliferació cel•lular dels CCD-18Co tractats amb vasopressina té lloc a través de l’activació de les vies PI3K/AKT i Ras/Raf/MAPK. Els colonòcits incubats amb el medi condicionat provinent dels CCD-18Co tractats amb vasopressina, incrementen la proliferació cel•lular i l’expressió de proteïnes del complex d’unió. Mentre que l’addició directa de la vasopressina sobre els colonòcits no ha modificat cap variable. L’addició del PDGFA modifica la proliferació dels colonòcits. Aquest estudi indica que l’aldosterona i la vasopressina cooperen en la regulació de l’estructura i funció de les criptes del còlon en resposta a canvis en la ingestió de Na+ i d’aigua, com part del mecanisme de regulació general de l’osmolalitat del líquid extracel•lular. / The hormones of the renin-angiotensin-aldosterone system and vasopressin are essential for maintaining Na+ homeostasis and extracellular fluid volume. In the rat distal colon, aldosterone regulates the expression of apical Na+ channel, and the activity of the ATPase-dependent Na+ and K+, and also has trophic effects by stimulating the proliferation of myofibroblasts of the pericryptal sheath. The main objectives of this study are to deepen the understanding of the mechanisms involved in the function of the colon to reabsorb Na+ and water, as well as the role of aldosterone and vasopressin and establish the regulatory effects of these hormones at the colonocytes and myofibroblasts. Experiments were conducted in vitro, using human colonocytes T84 and myofibroblasts CCD-18Co cell lines. The results indicate that aldosterone stimulates the proliferation of CCD-18Co, increases the expression of EGF mRNA and EGF concentration in the culture medium at 24h. Moreover, when the CCD-18Co cells were preincubated with anti-EGF or the EGFR inhibitor and subsequently treated with aldosterone, cell proliferation is inhibited, showing that the effects of aldosterone are mediated by the EGF through regulatory PI3K/AKT and Ras/Raf/MAPK pathways. The colonocytes incubation with media previously treated with CCD-18Co cells and aldosterone (conditioned medium) increases cellular proliferation and expression of junctional complex proteins. The results of in vivo experiments suggest that EGF plays a role as mediator because the rats with secondary hyperaldosteronism have an increase in the phosphorylation of EGFR. On the other hand, the treatment of myofibroblasts with vasopressin for 24h augmented the cellular proliferation and PDGFA expression. When myofibroblasts were pre-incubated with the anti-PDGF antibody or PDGFR inhibitor, hormonal effects were inhibited. These results indicate that cellular proliferation of CCD-18Co treated with vasopressin occurs through the activation of the PI3K/AKT and Ras/Raf/MAPK pathways. When colonocytes were treated with conditioned medium in the presence of vasopressin increased cellular proliferation and expression of junctional complex proteins. This study suggests that aldosterone and vasopressin cooperate in regulating the structure and functions of the crypts of the colon in response to changes in intake of Na+ and water as part of the mechanism of regulation general osmolarity of extracellular fluid.

El objetivo de este estudio es evaluar los mecanismos neurales y musculares implicados en la contracción y la relajación del músculo longitudinal del intestino delgado de rata en condiciones control y tras la infestación con Trichinella spiralis. Los segmentos del yeyuno y el íleon de ratas sanas e infestadas se montaron en un baño de órganos. Bajo estas condiciones se ha estudiado la contractilidad intestinal frente a la adición de agonistas y la respuesta motora a los neurotransmisores liberados por estimulación eléctrica de campo.1. Grupo control. Los mecanismos implicados en la respuesta a dos principales donadores de óxido nítrico (NO), nitroprusiato sódico - SNP y morpholinosydnonimine hydrochloride - SIN-1, han sido caracterizados y comparados con las respuestas del neurotransmisor nitrérgico endógeno sobre el músculo longitudinal del íleon de rata. Además, intentamos determinar si la incubación prolongada y en exceso de NO puede, por sí misma, producir cambios en las respuestas contráctiles a sustancias que actúan esencialmente al nivel muscular. La implicación del calcio intra y extracelular bajo estas condiciones también ha sido evaluada. La respuesta que induce el neurotransmisor nitrérgico endógeno muestra grandes similitudes con la que provoca SNP pero difiere marcadamente de la respuesta provocada por SIN-1. El NO exógeno no modifica los mecanismos involucrados en las respuestas contráctiles inducidas por acetilcolina, sustancia P y KCl, incluyendo las funciones del calcio implicadas en estas respuestas.2. Ratas infectadas con Trichinella spiralis. Estudiamos las alteraciones funcionales y morfológicas tanto en los segmentos inflamados del intestino delgado como en los no inflamados y libres de larvas de las ratas infestadas con Trichinella spiralis a diferentes tiempos posinfección. Cuando la infestación de la rata se lleve a cabo por administración oral de las larvas de T. spiralis, el parásito coloniza la parte proximal del intestino delgado -duodeno y yeyuno, pero no alcanza el íleon. De esta manera pudimos estudiar tanto los segmentos inflamados (yeyuno) como los no-inflamados y libres de larvas (íleon) del intestino delgado. Nuestros resultados evidencian que los cambios provocados por la infestación con T. spiralis ocurren en ambas partes del intestino. Los cambios más destacados se observaron en las respuestas motoras (contracciones y relajaciones) de los segmentos no infestados del íleon. Además, algunos de los cambios morfológicos y funcionales persistieron después de la completa desaparición de las evidencias histopatológicas de inflamación (hasta el día 72 de pos-infección).. / Cilj ove studije je bio da analizira neuralne i muskularne mehanizme koji u_estvuju u kontrakcijama i relaksacijama longitudinalnog mi_i_a tankog crijeva pacova u kontrolnom uvjetima i nakon infekcije sa larvama Trichinelle spiralis. Odgovori integralnih segmenata pacovskog jejunuma i ileuma od zdravih i infestiranih pacova su bili studirani u organskom kupatilu. Motorni odgovor mi_i_a tankog crijeva induciran razli_itim agonistima i/ili elektri_nom stimulacijom (EFS) pod ovim uslovima je bio tema ove studije.1 Kontrolna grupa. U prvom djelu analizirali smo mehanizme koji u_estvuju u odgovoru koji provociraju dva glavna donora nitri_nog oksida (NO), Na-nitroprusid (SNP) i morpholinosydnonimin hydrochlorid (SIN-1), u kontaktu sa longitudinalnim mi_i_em pacovskog ileuma. Mahanizmi ovih odgovora su bili karakterizirani i potom komparirani sa endogenim odgovorima nitri_nog neurotransmitora (provocirani sa EFS) koriste_i isti preparat. Tako_er smo poku_ali da ustanovimo da li bi prolongirana inkubacija sa NO ili sam NO u suvi_ku mogli inducirati promjene u kontrakcijama provociranim sa supstancijama koje eksluzivno djeluju na nivou glatke muskulature. Pod tim okolnostima mobilnost kalcijuma u glatkomi_i_noj _eliji ileuma tako_er je bila tema ove studije. Odgovori od endogenog nitri_nog neurotransmitora, oslobo_enog iz enteri_nih nerava, pokazuju veliku sli_nost sa odgovorima provociranim sa SNP ali ne i sa SIN-1. Egzogeno dodati NO nisu modificirali mehanizme implicirane u kontrakcijama provociranim sa acetilholinom, substancijom P ili KCl, uklju_uju_i tu i kalcijumovu mobilnost induciranu ovim agonistima.2. Pacovi zarazeni sa Trichinellom spiralis. U drugom djelu izu_avali smo funkcionalne i morfolo_ke promjene u inflamatornim i upalom ne zahva_enim segmentima tankog crijeva pacova tokom upalnog procesa i u post-upalnom periodu. Da bi smo inducirali upalu izabrali samo eksperimentalni model infestiranih pacovima sa Trichinellom spiralis. Kada se pacovima larve T. spiralis daju per oralno, paraziti nastanjuju proksimalni dio tankog cijeva pacova - duodenum i jejunum, ali ne dose_u ileum. Na ovaj na_in bili smo u mogu_nosti da studiramo upalom zahva_ene dijelove tankog crijeva, kao na primjer jejunum, kao i djelove bez upalnih procesa i bez prisustva parazita koriste_i intestinalne segmente ileuma. Na_i rezultati su dokazali da promjene inducirane sa T. spirals zahvataju i parazit-negativna podrucja bez indikacija upale kao i parazit-pozitivna podrucja sa izra_enom upalom, kao i to da najizra_enije promjene u kontraktilnim i relaksatornim odgovorima su uo_ene u neupaljenim segmentima ileuma. Neke od morfolo_kih i funkcionalnih promjena su bile prisutne dugo nakon nestanka histopatolo_kih znakova inflamacije i trajale su _ak do 72. dana nakon infestacije pacova. / The objective of this study is to analyze neural and muscular mechanisms involved in contraction and relaxation of the longitudinal muscle of the rat small intestine in healthy conditions and after Trichinella spiralis infection. Whole thickness preparations taken from jejunum and ileum of both healthy and Trichinella spiralis-infected rats were mounted in a muscle bath. In such conditions motor responses elicited by agonist addition or by electric field stimulation (EFS) induced release of endogenous neurotransmitters were studied. 1. Healthy animals. The mechanisms mediating the response to two main nitric oxide (NO) donors, sodium nitroprusside (SNP) and morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1), have been characterized and compared with the responses to endogenous nitrergic transmitter in the longitudinal smooth muscle of the rat ileum. Moreover, we also tried to determine if prolonged incubation and an excess of NO might produce by itself changes in the contractile responses to substances that act essentially at muscular level. The calcium-handling properties of the ileal smooth muscle in these conditions were also evaluated. The response to the nitrergic transmitter released from the enteric nerves bears great similarities with that caused by SNP but not by SIN-1. Exogenously added NO does not modify the pathways involved in acetylcholine-, substance P- and KCl-induced contractions, including the calcium flows involved in these responses.2. Trichinella spiralis infected rats. We studied the time course of functional and morphological changes in both inflamed worm-positive and non-inflamed worm-negative intestinal segments of Trichinella Spiralis infected rats at different times post infection. When T. spiralis larvae are given orally, the parasite colonises the rat proximal small intestine - the duodenum and the jejunum but does not reach the ileum. Thus, in our study indeed both inflamed (jejunum) and non-inflamed (ileum) intestinal segments. Our results have provided evidence that changes provoked by T. spirals infection occur in both worm-free non-inflamed and worm-positive inflamed tissue, with the most prominent changes in contractile and relaxation responses in the uninfected ileal segments. Moreover, some of the morphological and functional changes persisted long after the complete recovery of the histopathological evidence of inflammation (until day 72 post-infection)

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En estudios in vitro e in vivo se evaluaron los efectos de extractos de plantas sobre las características de fermentación microbiana ruminal. Se midieron las concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV), péptidos largos (PepL), péptido pequeños y AA (PepP+AA), N amoniacal, L-lactato, número de protozoos, la ingestión de materia seca (IMS) y el consumo de agua. En el experimento 1, se evaluaron 15 mg/Kg de la mezcla de todos los extractos (MIX), y 7.5 mg/Kg de extractos de ajo (GAR), canela (CIN), yuca (YUC), anís (ANI), orégano (ORE) o pimentón (CAP) en un sistema de fermentación de doble flujo continuo (8 días de adaptación y 3 de muestreo). En el período de adaptación, el acetato fue mayor y el propionato fue menor (d 2 al 6) en CIN, GAR, ANI y ORE, comparados con el CTR. Sin embargo, estas diferencias desaparecieron después de 6 días. El CIN y YUC incrementaron PepL, GAR y ANI incrementaron PepP+AA, el ANI incrementó y el GAR redujo N amoniacal. En el experimento 2, los mismos extractos y tres compuestos puros (anetol, ATL; cinnamaldehido, CDH y eugenol EUG) se evaluaron a cinco dosis (0, 0.3, 3, 30, y 300 mg/L) en dos niveles de pH (5.5 y 7.0) en cultivos in vitro con líquido ruminal de terneros. Las dosis altas de todos los extractos de plantas inhibieron los AGV totales y N amoniacal. A pH 7.0, los efectos de los extractos de la plantas no resultaron favorables para los objetivos de los sistemas de engorde. En cambio, a pH 5.5, EUG, GAR, CAP, CDH y YUC incrementaron los AGV totales, siguiendo una baja relación acetato:propionato en ORE, GAR, CAP, CDH, y YUC. En el experimento 3, se evaluaron 30 g/d de extracto de la alfalfa (AEX; 10% malato y 1.5% saponinas), una mezcla de 180 mg/d de CDH y 90 mg/d de EUG (CIE), y una combinación de ambos tratamientos (MIX) en terneros Holstein de 360 Kg y provistos de un trocar en el rumen. Comparados con el CTR, el CIE y AEX redujeron la IMS, consumo de agua, Entodinium spp, El AEX incrementó la relación acetato:propionato, redujo Entodinium spp e Isotrichus spp. En in vitro con líquido ruminal de CIE, AEX y MIX, el CIE y MIX redujeron degradación de la proteína bruta (DPB) de soja y maíz a las 4 h de incubación. Sin embargo, no hubo ningún efecto a las 24 h de incubación. En el experimento 4, se evaluaron 2 g/d de extracto de anís (ANI; 10% anetol), 1 g/d de extracto de capsicum (CAP; 15% capsaicina), y una mezcla de 0.6 g/d de CDH y 0.3 g/d de EUG (CIE) en terneros Holstein de 450 Kg provistos de un trocar en el rumen. Comparados con el CTR, El CAP incrementó la IMS, el consumo de agua, PepP+AA, y redujo el acetato, AVG de cadena ramificada (AGVCR) y PepL. El CIE redujo el consumo de agua, acetato, AVGCR, L-lactato, N amoniacal y Entodinium spp e Isotrichus spp. y aumentó el propionato y PepP+AA. El ANI disminuyó la relación acetato:propionato, AVGCR, N amoniacal y Entodinium spp. En la prueba in vitro, ANI, CAP y CIE redujeron la DPB de la soja 4 h después de la incubación, y sólo el ANI redujo la DPB de la soja 24 h después de la incubación. Los resultados indican que los extractos de plantas pueden variar sus efectos en función de la dieta y del ambiente ruminal, y que el CIE, ANI y CAP pueden ser útiles como modificadores de la fermentación ruminal en los sistemas de cebo intensivo de terneros.

Els resultats d'aquesta tesi doctoral, presentada per compendi de publicacions, es divideixen en 2 grups:A) Basats en la variabilitat de CCL4 i CCL4L:Article: Multiple Products Derived from Two CCL4 Loci: High Incidence of a New Polymorphism in HIV+ Patients. Roger Colobran, Patricia Adreani, Yaqoub Ashhab, Anuska Llano, José A. Esté, Orlando Dominguez, Ricardo Pujol-Borrell, and Manel Juan. The Journal of Immunology, 2005, 174: 5655-5664. Els locus CCL4 i CCL4L originen les quimiocines CCL4 i CCL4L, que estan altament relacionades. En aquest treball es demostra que ambdós gens produeixen trànscrits originats per splicing alternatiu mancats de l'exó 2 (anomenats CCL4Δ2 i CCL4LΔ2). Per altra banda, el locus CCL4L presenta un polimorfisme de nucleòtid únic (rs4796195) situat a la seqüència acceptora de tall-i-unió (splicing) de l'intró 2, donant lloc a dues variants al·lèliques: CCL4L1 (la originalment descrita) i CCL4L2, on aquesta seqüència acceptora de tall desapareix i l'ús de noves seqüències de tall acceptores al voltant de la original, dóna lloc a la generació de múltiples trànscrits diferents als generats per CCL4L1. En un estudi cas-control es demostra que la variant CCL4L2 està significativament augmentada en els pacients HIV+ respecte una població control. Això demostra que CCL4L2 és un factor de susceptibilitat per a la infecció per HIV.Article: Confusión entre CCL4 y CCL4L1: Un ejemplo a tener en cuenta cuando se usan reactivos de terceras partes. R. Colobran, M. Juan. Inmunología, Vol. 26 / Núm 1/ Enero-Marzo 2007: 51-54. En aquest treball es descriuen errors en la seqüència aminoacídica de les proteïnes CCL4 i CCL4L1 comercialitzades per algunes empreses.Article: Population Structure in Copy Number Variation (CNV) and SNPs in the CCL4L Chemokine Gene. Roger Colobran, David Comas, Rosa Faner, Edurne Pedrosa, Roger Anglada, Ricardo Pujol-Borrell, Jaume Bertranpetit, Manel Juan. Genes and Immunity, Submitted. En aquest treball s'integra l'anàlisis de variacions de nombre de còpia (CNV) i SNPs (rs4796195 and rs3744595) en el gen CCL4L. S'ha quantificat el nombre de còpies del gen CCL4L i s'han genotipat els dos SNPs en el panell HGDP-CEPH, que conté 1064 individus de 52 poblacions mundials. Per primera vegada presentem dades de poblacions mundials que combinen els dos tipus de variació genòmica (CNVs i SNPs) i els nostres resultats mostren una clara estructura poblacional: les poblacions de l'Àfrica Subsahariana són les que tenen un nombre més elevat de còpies de CCL4L (mitja = 4,32) i les poblacions Europees són les que en tenen menys (mitja = 1,89).B) Basats en la variabilitat global de la superfamília de les quimiocines:Article: The chemokine network. I. How the genomic organization of chemokines contains clues for deciphering their functional complexity. R. Colobran, R. Pujol-Borrell, Ma P. Armengol and M. Juan. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 148: 208-217. En aquesta primera revisió analitzem les dades actuals sobre la família de les quimiocines, bàsicament sobre la seva organització genòmica. S'interpreta aquesta organització genòmica en relació a les principals funcions adquirides pels seus membres individuals o pels clusters de gens que es formen.Article: The chemokine network. II. On how polymorphisms and alternative splicing increase the number of molecular species and configure intricate patterns of diseasesusceptibility. R. Colobran, R. Pujol-Borrell, Ma P. Armengol and M. Juan. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 150: 1-12. En aquesta segona revisió sobre quimiocines, ens centrem en els polimorfismes i els fenòmens d'splicing alternatiu i les seves conseqüències en malaltia. / The results of this doctoral thesis, presented as compendium of works, can be divided in two main groups:A) Based on the variability of CCL4 and CCL4L:Manuscript: Multiple Products Derived from Two CCL4 Loci: High Incidence of a New Polymorphism in HIV+ Patients. Roger Colobran, Patricia Adreani, Yaqoub Ashhab, Anuska Llano, José A. Esté, Orlando Dominguez, Ricardo Pujol-Borrell, and Manel Juan. The Journal of Immunology, 2005, 174: 5655-5664. CCL4 and CCL4L loci codify for CCL4 and CCL4L chemokines, that are highly related. In this work we demonstrate that both loci produce alternatively spliced transcripts that lacks intron 2 (called CCL4Δ2 and CCL4LΔ2). Moreover, CCL4L locus show a single nucleotide polymorphism (SNP, rs4796195) located in the acceptor splice site of intron 2, splitting CCL4L into two allelic variants: CCL4L1 (the originally described one) and CCL4L2. In CCL4L2 the original acceptor splice site desappears and several new acceptor splice sites surrounding the original one are used, displaying multiple transcripts differents to those generated to CCL4L1. In a case-control study we demonstrate that the variant CCL4L2 is significantly increased in HIV patients with respect to the control population. Therefore, CCL4L2 is a susceptibility factor for HIV infection.Manuscript: Confusion Between CCL4 and CCL4L1: An Example to Bear in Mind when Using Third-Party Reagents. R. Colobran, M. Juan. Inmunología, Vol. 26 / Núm 1/ Enero-Marzo 2007: 51-54. In this work, we describe errors in the aminoacidic sequences of CCL4 and CCL4L1 proteins delivered by several companies.Manuscript: Population Structure in Copy Number Variation (CNV) and SNPs in the CCL4L Chemokine Gene. Roger Colobran, David Comas, Rosa Faner, Edurne Pedrosa, Roger Anglada, Ricardo Pujol-Borrell, Jaume Bertranpetit, Manel Juan. Genes and Immunity, Submitted. In this study we integrate the analysis of CNV and SNPs, combining the assessment of gene copy number with the genotyping of relevant SNPs in human CCL4L chemokine gene. We have quantified the CCL4L copy number and genotyped both SNPs in samples from HGDP-CEPH Diversity Panel, that contains 1064 individuals of 52 worldwide populations. For the first time, we report worldwidepopulation data combining both types of variation, CNV and SNPs, and our results show a clear population structure: Subsaharian Africa populations have the higher number of CCL4L copies (mean = 4,32) and European populations have the lower number of CCL4L copies (mean = 1,89).B) Based on the global variability of chemokine superfamily:Manuscript: The chemokine network. I. How the genomic organization of chemokines contains clues for deciphering their functional complexity. R. Colobran, R. Pujol-Borrell, Ma P. Armengol and M. Juan. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 148: 208-217. In this first review, we analyse currently available data on the chemokine superfamily, focusing on its complex genomic organization. We will try to interpret this genomic organization of chemokines in relation to the main functions acquired by each individual member or by each cluster.Manuscript: The chemokine network. II. On how polymorphisms and alternative splicing increase the number of molecular species and configure intricate patterns of diseasesusceptibility. R. Colobran, R. Pujol-Borrell, Ma P. Armengol and M. Juan. Clinical and Experimental Immunology, 2007, 150: 1-12. In this second review on chemokines, we focus on the polymorphisms and alternative splicings and on their consequences in disease.

L'objectiu d'aquesta tesi ha estat estudiar in vitro, usant la tècnica de bany d'òrgans, els neurotransmissors implicats en la relaxació i la contracció i en el control del to en l'esfínter esofàgic inferior. Per això s'ha usat teixit procedent de tres espècies: l'home, el porc i la rata. També s'ha estudiat el paper de les cèl·lules intersticials de Cajal (ICCs) en la neurotransmissió excitadora i inhibidora, usant un model mutant en rata (Ws/Ws) que no presenta algun dels tipus d'ICCs. Els objectius concrets de cada estudi es descriuen a continuació. Objectiu 1. Caracteritzar l'efecte de l'estimulació de les motoneurones excitadores i inhibidores i les influències neurals sobre el to en el LES humà.Objectiu 2. Caracterització dels mecanismes neuromiogènics i dels neurotransmissors que controlen el to i la relaxació de LES del porc. Objectiu 3. Avaluar les diferències existents entre les regions de clasp i sling en el LES del porc pel que fa al control del to i a la contribució dels diferents components implicats en la relaxació i en la contracció. Objectiu 4. Caracterització i implicació de les cèl·lules intersticials de Cajal (ICCs) en la neurotransmissió inhibidora i excitadora en el LES de la rata.

Hepatic fibrosis is characterized by intense tissue remodeling. In this study, we assessed whether CO3-610, a new identified neoepitope, could be used as a surrogate biomarker of liver fibrosis and portal hypertension in CCl4-induced experimental fibrosis. Serum CO3-610 was measured by ELISA. Liver fibrosis was quantified by Sirius red staining. Serum hyaluronic acid (HA) was measured with a binding-protein assay. Gene expression of collagens I and III, MMP2 and MMP9, and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1 and 2 was quantified by PCR. Hemodynamic measurements were taken in a subgroup of animals. A close direct relationship was found between serum CO3-610 and hepatic collagen content (r= 0.78; P<0.001), superior to that found for serum HA (r= 0.49; P<0.05). CO3-610 levels in rats with severe fibrosis (43.5±3.3 ng/mL, P<0.001) and cirrhosis (60.6±4.3 ng/mL, P<0.001) were significantly higher than those in control animals (26.6±1.3 ng/mL). Importantly, a highly significant relationship was found between serum CO3-610 and portal hypertension (r= 0.84; P<0.001). Liver MMP9 expression increased significantly in fibrotic animals but decreased to control levels in cirrhotic ones. Circulating CO3-610 behaves as a reliable indicator of hepatic remodeling and portal hypertension in experimental fibrosis. Therefore, this peptide could ultimately be a useful marker for the management of liver disease in patients. Endocannabinoids behave as antifibrogenic agents by interacting with cannabinoid CB2 receptors, whereas the apelin (AP) system acts as a proangiogenic and profibrogenic mediator in the liver. This study assessed the effect of long-term stimulation of CB2 receptors or AP receptor (APJ) blockade on fibrosis progression in rats under a non-discontinued fibrosis induction program. The study was performed in control and CCl4-treated rats for 13 weeks. Fibrosis-induced rats received a CB2 receptor agonist (AM1241) (1 mg/kg), an APJ antagonist (F13A) (75 μg/kg), or vehicle daily during the last 5 weeks of the CCl4 inhalation program. Mean arterial pressure (MAP), portal pressure (PP), hepatic collagen content, angiogenesis, cell infiltrate, and mRNA expression of a panel of fibrosis-related genes were measured in all animals. Fibrosis-induced rats showed increased hepatic collagen content, reduced MAP, PP, and increased expression of the assessed messengers in comparison with control rats. However, fibrotic rats treated with either AM1241 or F13A had reduced hepatic collagen content, improved MAP and PP, ameliorated cell viability, and reduced angiogenesis and cell infiltrate compared with untreated fibrotic rats. These results were associated with attenuated induction of PDGFRβ, α-SMA, MMPs, and TIMPs. CB2 receptor stimulation or APJ blockade prevents fibrosis progression in CCl4-treated rats. The mechanisms underlying these phenomena are coincident despite the marked dissimilarities between the CB2 and APJ signaling pathways, thus opening new avenues for preventing fibrosis progression in liver diseases. PDGF is the most potent stimulus for proliferation and migration of stellate cells. PDGF receptor β expression is an important phenotypic change in myofibroblastic cells that mediates proliferation and chemotaxis. Here we analyzed the relationship between PDGFRβ expression, hemodynamic deterioration, and fibrosis. Thereafter, we investigated the effects produced by an adenovirus encoding a dominant-negative soluble PDGFRβ (sPDGFRβ) on hemodynamic parameters, PDGFRβ signaling pathway, and fibrosis. Hemodynamics, PDGFRβ mRNA expression, and hepatic collagen were assessed in controls and fibrosic/cirrhotic rats. Next, 30 fibrotic rats were randomized into three groups receiving iv saline and an adenovirus encoding for sPDGFRβ or β-galactosidase. After 7days, hemodynamics, serum sPDGFRβ, and hepatic collagen were measured. CCl4-treated animals for 18weeks showed a significantly higher increase in PDGFRβ mRNA compared to those treated for 13weeks and control rats. In CCl4-treated rats, the fibrous tissue area ranged from moderate to severe fibrosis. A direct relationship between the degree of fibrosis, hemodynamic changes, and PDGFRβ expression was observed. Fibrotic rats transduced with the adenovirus encoding sPDGFRβ showed increased MAP, decreased PP, lower activation of the PDGFRβ signaling pathway, and reduced hepatic collagen than fibrotic rats receiving β-gal or saline. PDGFRβ activation closely correlates with hemodynamic disorders and increased fibrosis in CCl4-treated rats. Adenoviral dominant negative soluble PDGFRβ improved fibrosis. As a result, the hemodynamic abnormalities were ameliorated. Cirrhotic patients have altered host-defense response mechanisms. Here we assessed whether impaired expression of CB2 receptor in monocytic cells of cirrhotic patients could be involved in the pathogenesis of this phenomenon. CB2 mRNA and protein expression was assessed in a differentiated human monocytic cell line (U937) stimulated with endotoxin (LPS). A PCR array of 86 different genes was assessed in U937 cells treated with LPS. A migration assay towards endocannabinoids or the CB2 antagonist, SR144528, was performed in U937 cells exposed to LPS. Finally, CB1 and CB2 mRNA expression were measured in monocytes and macrophages of cirrhotic patients with or without spontaneous bacterial peritonitis. LPS reduced CB2 expression in human monocytes. Endocannabinoids increased the migratory activity of U937 cells, which was reverted when the experiments were performed in the presence of LPS. Transcriptional profiling showed marked upregulation of 9 genes related to proinflammatory signaling. However, only two genes encoding for CB1 and CB2 were reduced in LPS-treated cells. Circulating monocytes of cirrhotic patients showed a significantly diminished mRNA expression of CB1 and CB2. Markedly low CB1 and CB2 mRNA levels were found in peritoneal macrophages of cirrhotic patients with ascites, being almost suppressed when analyzed in patients with peritonitis. LPS reduces CB2 expression in human monocytes resulting in depressed chemotactic activity and therefore impaired host defense response of these cells. / La característica más destacable de la fibrosis es la desregulación de la ME. El equilibrio que existe entre la síntesis y la degradación de la ME en un hígado normal se pierde, y como consecuencia se favorece la síntesis y acumulación de fibras de colágeno, el cual provoca la distorsión de la arquitectura del parénquima y de la red vascular hepática. El CO3-610 es un producto de degradación del colágeno III que ha mostrado estar correlacionado significativamente con el aumento de la cantidad de colágeno y progresión de la fibrosis. Los valores máximos de CO3-610 se han encontrado ratas cirróticas. El resultado más importante es que el CO3-610 ha mostrado tener una estrecha correlación con los valores de presión portal. Existe un gran interés en investigar y desarrollar terapias dirigidas a la prevención de la progresión de la fibrosis. Los endocannabinoides son moléculas lipídicas que participan en un amplio rango de procesos fisiológicos. Los efectos son mediados por dos tipos de receptores, el CB1 y el CB2. El sistema de la apelina es otro sistema endógeno que ha despertado mucho interés en los últimos años. La apelina es el único ligando conocido para el receptor APJ. El tratamiento con AM1241, un agonista selectivo de CB2 y F13A, un antagonista de APJ mejoró la función hepática, la hemodinámica sistémica y portal, y provocó una reducción significativa del grado de fibrosis hepática. Ambos tratamientos produjeron una disminución del infiltrado inflamatorio, angiogénesis y del grado de apoptosis en el parénquima hepático. El análisis de la expresión del mRNA de varios genes importantes implicados en el proceso fibrogénico, reveló que el tratamiento tanto con AM1241 como con F13A, producían una disminución de la expresión del PDGFRβ, del αSMA y de genes de remodelado tisular. La inhibición parcial de la vía de PDGF mediante la administración de un dominante negativo para la fracción soluble del receptor β de PDGF, ha demostrado que mejora la hemodinámica sistémica y la presión portal además de mejorar el grado de fibrosis. Por último, los pacientes cirróticos con ascitis tienen una mayor probabilidad de sufrir infecciones (peritonitis bacteriana espontánea, PBE). Se ha observado que estos pacientes tienen una menor expresión de CB2. In vitro se han realizado experimentos con células monocíticas (U937) y se ha observado que el LPS disminuye drásticamente la expresión de CB2 al igual que afecta a la capacidad de migración de estas células. En conjunto, se puede concluir que la evaluación de la fibrosis hepática es una herramienta muy importante para el diagnostico de la enfermedad hepática y que éste puede mejorarse a través del uso de biomarcadores no invasivos que correlacionen con la hemodinámica y el grado de fibrosis hepática. La prevención de la progresión de la fibrosis a través de fármacos o bien actuando sobre genes clave involucrados en la fibrogénesis son posibles dianas terapéuticas. Finalmente, es posible mejorar la calidad de vida de los pacientes cirróticos con ascitis con infección por PBE mediante terapias que involucren los receptores de cannabinoides CB2.

El objetivo general de esta tesis consistió en el estudio, in vitro (baño de órganos y microelectrodos), de la fisiología del cuerpo esofágico (EB) y del esfínter esofágico inferior (LES) con tejido de dos especies, humana y porcina. Permitiendo: Estudiar los neurotransmisores y mecanismos que controlan las respuestas inducidas por la estimulación de las motoneuronas (MNs) inhibitorias y excitatorias del plexo mientérico (MP) en el esófago (LES y EB) humano y animal. El modelo porcino está considerado como un modelo animal homólogo, ya que ambas especies tienen muchas similitudes tanto funcionales como estructurales respecto al tracto gastrointestinal. El objetivo del primer estudio, fue evaluar el efecto de la estimulación selectiva de las MNs inhibitorias y excitatorias en el LES porcino a través de los receptores nAChRs, 5-HT3 y P2X. Se estudiaron tiras de LES circular, de cerdos adultos, en baño de órganos. Se compararon los efectos de la estimulación de las MNs mediante estimulación eléctrica de campo (EFS:26V, 0.3-20Hz); nicotina (1-300μΜ); 5-HT y 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) y α,β-meATP (1-100μΜ) en tres soluciones: Krebs estándar, solución no-adrenérgica no-nitrérgica no-purinérgica (NANNNP) y solución no-adrenérgica no-colinérgica (NANC). Los resultados sugieren mecanismos selectivos para estimular las vías motoras inhibitoria y excitatoria en el LES porcino. Las MNs inhibitorias se estimulan intensamente mediante los receptores nAChRs y no responden a la estimulación de los receptores 5-HT3 y P2X. Por contra, las MNs excitatorias se estimulan a través de los receptores 5-HT3 y P2X, la estimulación a través de los nAChRs es difícil causando una respuesta débil. El objetivo del segundo estudio, fue explorar los mecanismos mientéricos de control de la motilidad esofágica humana y el efecto de los neurotransmisores nitrérgicos y no-nitrérgicos, mediante tiras esofágicas circulares en baño de órganos y microelectrodos. Se compararon las respuestas obtenidas tras la EFS de las MNs entéricas ó a través de los receptores nAChRs en el cuerpo esofágico (EB) y en las regiones clasp y sling del LES. Los resultados muestran una especialización regional en la estimulación de las MNs entéricas en el esófago humano, con respuestas inhibitorias más intensas en las fibras clasp del LES y respuestas excitatorias colinérgicas más intensas en el EB. Las respuestas inhibitorias están desencadenadas principalmente por las MNs entéricas nitrérgicas que median los potenciales postunión inhibitorios (IJP) en el LES y en el EB, la relajación-on inducida por EFS en las zonas clasp y sling del LES y la latencia en el EB. También se encontró un papel menor para las purinas (a través de receptores P2Y1) y el VIP mediando parte de la relajación no-nitrérgica en la zona clasp del LES. El objetivo del tercer estudio, fue caracterizar los neurotransmisores implicados en el origen y modulación de las contracciones del músculo liso circular del EB porcino. Se estudiaron las respuestas al EFS de las MNs de las tiras de EB en baño de órganos y microelectrodos. Se caracterizó el efecto de los antagonistas de los neurotransmisores inhibitorios (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) y excitatorios (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) y gangliónicos (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM). Los resultados sugieren que el timing (latencia) y amplitud de las contracciones esofágicas están determinadas por un equilibrio de interacciones complejas entre las MNs inhibitorias y excitatorias. La latencia depende de la activación de las MNs inhibitorias liberando NO y una contribución purinérgica menor a través de receptores P2Y1, y de las MNs excitatorias liberando ACh. La amplitud depende de una contribución principal de las MNs excitatorias liberando ACh y taquiquininas, y también de las MNs inhibitorias liberando NO, ATP o una purina relacionada y neurotransmisores peptidérgicos actuando como fuertes moduladores de la transmisión neuroefectora excitatoria. / The aim of this Doctoral Thesis was to study, in vitro, the physiology of the esophageal body (EB) and the lower esophageal sphincter (LES) with tissue from human and porcine species. To do these we used organ baths and microelectrodes, which have allowed us: To study both the neurotransmitters and the mechanisms that control the responses induced by stimulation of inhibitory and excitatory motorneurons (MNs) of the myenteric plexus (MP) in the human and animal esophagus (LES and EB). The porcine model is considered as a homologous animal model to human, as both species have many functional and structural similarities regarding the gastrointestinal tract. The aim of the first study was to assess the effect of selective stimulation of inhibitory and excitatory MNs in porcine LES through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 5-HT3 and P2X receptors. Circular LES strips from adult pigs were studied in organ baths. We compared the effects of stimulation of MNs by electrical field stimulation (EFS: 26V, 0.3-20Hz); nicotine (1-300μΜ; 5-HT and 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) and α,β-meATP (1-100μΜ) in standard Krebs solution, a non-adrenergic non-nitrergic non-purinergic (NANNNP) solution and a non-adrenergic non-cholinergic (NANC) solution. Our results suggest selective mechanisms for stimulation of intrinsic excitatory and inhibitory motor pathways in porcine LES. Inhibitory MNs are strongly stimulated by nAChRs and do not respond to stimulation of 5-HT3 and P2X receptors. By contrast, excitatory MNs are stimulated through 5-HT3 and P2X receptors, stimulation through nAChRs being difficult and causing a weak response. The aim of the second study was to explore the myenteric mechanisms of control of human esophageal motility and the effect of nitrergic and nonnitrergic neurotransmitters. Human circular esophageal strips were studied in organ baths and with microelectrodes. Responses following electrical field stimulation (EFS) of enteric motorneurons (MNs) or through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) were compared in the esophageal body (EB) and in clasp and sling regions in the lower esophageal sphincter (LES). Our study shows a regional specialization to stimulation of EMNs in the human esophagus, with stronger inhibitory responses in clasp LES fibers and stronger cholinergic excitatory responses in the EB. Inhibitory responses are mainly triggered by nitrergic enteric MNs mediating the inhibitory junction potentials (IJP) in the LES and EB, EFS on-relaxation in clasp and sling LES sides, and latency in the EB. We also found a minor role for purines (through P2Y1 receptors) and vasoactive intestinal peptide-mediating part of nonnitrergic clasp LES relaxation. The aim of the third study was to characterize the neurotransmitters involved in the origin and modulation of circular smooth muscle esophageal body (EB) contractions in the porcine esophagus. Responses of porcine EB strips to electrical stimulation of motorneurons (MNs) were assessed in organ baths and with microelectrodes. The effect of antagonists of inhibitory (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) and excitatory neurotransmitters (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) and of ganglionic neurotransmitters (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM) were characterized. Our results suggest that timing (latency) and amplitude of esophageal contractions are determined by a balance of complex interactions between excitatory and inhibitory MNs. Latency depends on the activation of inhibitory MNs releasing NO and a minor purinergic contribution through P2Y1 receptors, and excitatory MNs releasing ACh. Amplitude depends on a major contribution of excitatory MNs releasing ACh and tachykinins, and also on inhibitory MNs releasing NO, ATP or related purines, and peptidergic neurotransmitters acting as strong modulators of the excitatory neuroeffector transmission.

La neurotransmissió inhibitòria participa en el control de l’activitat motora del còlon. Els neurotransmissors inhibitoris hiperpolaritzen la membrana del múscul llis, generant un potencial d'unió inhibitori (”Inhibitory Junction Potential” IJP) que és la base electrofisiològica de la relaxació muscular. Així, l’adenosina trifosfat (ATP), l’òxid nítric (NO) i el sulfur d’hidrogen (H2S) són molècules de senyalització que poden exercir aquest control. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat valorar la participació de l’ATP, el NO i el H2S en la transmissió neuromuscular inhibitòria en el còlon humà i de rata. El hidrogensulfur de sodi (NaHS) va ser utilitzat com font de H2S. Els antagonistes específics dels receptors P2Y1 van inhibir completament el component purinèrgic de l’IJP en el còlon humà i de rata (rang de potència: MRS2500>MRS2279>MRS2179). El β-NAD va produir hiperpolarització i relaxació de la musculatura del còlon humà. Tanmateix, la relaxació no va ser bloquejada pels antagonistes P2Y1. En el còlon de rata es va observar que l’alliberament de neurotransmissors inhibitoris produïa la generació d’IJP espontanis i un potencial de membrana muscular hiperpolaritzat. Mitjançant MRS2500 es va posar de manifest que els receptors P2Y1 participaven en la gènesi dels IJP espontanis. El Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) va permetre establir que l'estat de hiperpolarització tònic del potencial de membrana era d'origen nitrèrgic. L’ús d’apamina, spadina i ODQ va permetre valorar la participació dels canals de potassi de baixa conductància activats per calci (SKCa), els canals de potassi relacionats amb TWIK tipus 1 (TREK1) i la via de la guanilat ciclasa (GC) sobre la neurotransmissió purinèrgica i nitrèrgica. L’apamina va bloquejar tots dos components amb diferents nivells d'afinitat. L’ODQ només va bloquejar la neurotransmissió nitrèrgica. D’altra banda, tot i posar de manifest la presència de canals TREK1 en el còlon de rata, la spadina, un blocador de TREK1, no va bloquejar cap dels components. L’expressió dels enzims de síntesi del H2S es va determinar immunohistoquímicament en l’epiteli, el múscul i les neurones del còlon de rata. A més, es va demostrar que el teixit de rata era capaç de produir enzimàticament H2S. Tot i que en alguns casos es van observar efectes no específics dels inhibidors dels enzims de síntesi del H2S, aquestos van produir despolarització de les cèl·lules musculars i un increment de l’activitat mecànica del còlon. En segments de còlon de rata, el NaHS administrat per serosa va causar un efecte dual sobre els patrons de motilitat. El NaHS va inhibir les contraccions d'alta amplitud, mentre que va incrementar les contraccions de baixa amplitud. El NaHS va inhibir els potencials d'unió excitador i va hiperpolaritzar el múscul. Tanmateix, l’H2S no va alterar el marcapassos colònic situat a nivell del plexe submucós. El NaHS via luminal no va modificar la motilitat del còlon. La neurotransmissió purinèrgica al còlon humà i de rata es produeix a través del receptor P2Y1. L’ATP i el NO són alliberats per les neurones inhibitòries del plexe mientèric i tenen funcions complementàries en el còlon. D'una banda, l’ATP exerceix una acció fàsica sobre el potencial de membrana i l’activitat mecànica, mentre que el NO té una acció tònica. Ambdues respostes nitrèrgica i purinèrgica son en part sensibles a apamina, suggerint que els canals SKCa poden esta involucrats en les dues vies. El NO exerceix el seu efecte sobre el potencial de membrana a través de l’activació de la via de GC però no activa els canals TREK1. El H2S és produït i alliberat endògenament en el còlon de rata i pot actuar com una molècula de senyalització amb acció moduladora sobre la motilitat colònica. El seu mecanisme d’acció implica una inhibició de la neurotransmissió colinèrgica i hiperpolarització muscular. / Inhibitory neuromuscular transmission is involved in the control of colonic motility. Inhibitory neurotransmitters cause membrane hyperpolarization of smooth muscle, that is, an inhibitory junction potential (IJP) which is the electrophysiological basis of muscle relaxation. Thus, adenosine triphosphate (ATP), nitric oxide (NO) and hydrogen sulphide (H2S) are signalling molecules which can exert this control. The aim of this thesis was to evaluate the role of ATP, NO and H2S in inhibitory neuromuscular transmission in the rat and human colon. Sodium hydrosulphide (NaHS) was used as the source of H2S. Specific P2Y1 receptor antagonists completely inhibited the purinergic component of the IJP in the human and rat colon (potency range: MRS2500> MRS2279> MRS2179). β-NAD produced smooth muscle hyperpolarization and relaxation in the human colon. However, the relaxation was not blocked by P2Y1 antagonists. In the rat colon, it was observed that the release of inhibitory neurotransmitters produced both spontaneous IJP and a sustained muscle hyperpolarization. MRS2500 revealed that P2Y1 receptors were responsible for spontaneous IJP. Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) allowed us to establish that the tonic state of muscle hyperpolarization was nitrergic in origin. Apamin, spadin and ODQ were used to assess the involvement of small-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa), TWIK-related potassium channels 1 (TREK1) and the guanylate cyclase (GC) pathway on purinergic and nitrergic neuromuscular transmission. Apamin blocked both components with a different relative sensitivity. ODQ only blocked nitrergic neuromuscular transmission. Furthermore, even though the presence of TREK1 channels was revealed in rat colon, none of the components was blocked by spadin, an effective TREK1 channel inhibitor. The expression of H2S-producing enzymes was determined by immunohistochemistry in the epithelium, muscle and nerve cells in the rat colon. In addition, it was demonstrated that the rat tissue was able to enzymatically produce H2S. Although in some cases the effects of H2S-producing enzymes inhibitors were not specific, they caused muscle depolarization and an increase in colonic mechanical activity. In segments of rat colon, NaHS caused a dual effect on motility patterns when administered via serosa. NaHS inhibited propulsive contractions whereas it caused an increase in the amplitude of ripples. NaHS inhibited cholinergic excitatory junction potentials and hyperpolarized smooth muscle cells. However, NaHS did not modify the colonic pacemaker located at the level of the submucosal plexus. Luminal addition of NaHS did not modify motility patterns. Purinergic neurotransmission in the rat and human colon is mediated by P2Y1 receptors. ATP and NO are released by myenteric plexus inhibitory neurons and have complementary functions in the colon. I.e. ATP produces a phasic action on membrane potential and mechanical activity and NO has a tonic effect. Both purinergic and nitrergic responses are in part apamin sensitive suggesting a possible involvement of SKCa in both pathways. NO effects on membrane potential are produced by GC activation but TREK1 channels are not involved. In the rat colon, H2S is produced and released endogenously and it might be a signalling molecule modulating action on colonic motility. H2S mechanism of action involves inhibition of neurally mediated cholinergic responses and muscle hyperpolarization.