Bone remodelling is a fundamental mechanism for removing and replacing bone during adaptation of the skeleton to mechanical loads. Skeletal unloading leads to severe hypoxia (1%O2) in the bone microenvironment resulting in imbalanced bone remodelling that favours bone resorption. Hypoxia, in vivo, is a physiological condition for osteocytes, 5% O2 is more likely physiological for osteocytes than 20% O2, as osteocytes are embedded deep inside the mineralized bone matrix. Osteocytes are thought to be the mechanosensors of bone and have been shown to orchestrate bone formation and resorption. Oxygen-deprived osteocytes seem undergo apoptosis and actively stimulate osteoclasts. Hypoxia and oxidative stress increase 150-kDa oxygen-regulated protein (ORP 150) expression in different cell types. It is a novel endoplasmic-reticulum-associated chaperone induced by hypoxia/ischemia. It well known that ORP 150 plays an important role in the cellular adaptation to hypoxia, as anti-apoptotic factor, and seems to be involved in osteocytes differentiations. The aims of the present study are 1) to determine the cellular and molecular response of the osteocytes at two different conditions of oxygen deprivation, 1% and 5% of O2 compared to the atmospheric oxygen concentration at several time points. 2) To clarify the role of hypoxic osteocytes in bone homeostasis through the detection of releasing of soluble factors (RANKL, OPG, PGE2 and Sclerostin). 3) To detect the activation of osteoclast and osteoblast induced by condition media collected from hypoxic and normoxic osteocytes. The data obtained in this study shows that hypoxia compromises the viability of osteocytes and induces apoptosis. Unlike in other cells types, ORP 150 in MLO-Y4 does not seem to be regulated early during hypoxia. The release of soluble factors and the evaluation of osteoclast and osteoblast activation shows that osteocytes, grown under severe oxygen deprivation, play a role in the regulation of both bone resorption and bone formation.

El epitelio intestinal forma una barrera que permite el paso de nutrientes pero restringe el de substancias potencialmente nocivas. La alteración de dicha función se relación a con enfermedades gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en la que, además, la producción de eicosanoides en la mucosa intestinal se encuentra incrementada. Por ese motivo, el objetivo del presente trabajo ha sido investigar el papel de los eicosanoides producidos en la cascada del ácido araquidónico en la regulación de la función epitelial de barrera en un modelo intestinal de células Caco-2. La permeabilidad paracelular (PP) se ha estudiado en cultivos mantenidos sobre filtros, a partir de la determinación de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y de los flujos de dextrano. La concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) se ha determinado por espectrofluorimetría, y la de AMPc así como la activación de NFkB por enzima inmuno ensayo. La fosforilación de la cadena ligera de miosina (MLC) se ha realizado por western blot y la localización de las proteínas de la unión estrecha (TJ) por inmunofluorescencia. Los resultados revelan que la PGE2, la PGE3, el LTD4 y los 5-, 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE son capaces de romper la función barrera. En cambio, la PGD2, el LTB4, el 13-HODE, el 20-HETE, los 11,12- y 14,15-EET, los 11,12 y 14,15-DHETE y el 12-HEPE no tienen este efecto. La PGE2 y PGE3 incrementan la PP al interacciónar con los receptores EP1 y EP4 que a su vez activan la vía de la PLC-IP3-Ca2+ y la via del AMPc-PKA, respectivamente. En el caso de LTD4, se ha observado que el receptor implicado en la disrupción de la función barrera es el CysLT1R. En el caso del 5-HETE se ha descartado la participación de BLT1, BLT2, CysLT1R y CysLT2R. En el caso del LTD4 y 5-HETE, además de inducir un incremento de la [Ca2+]i, se ha demostrado la activación de la vía de la PLC-Ca2+/PKC y de la vía de la PKA independiente de AMPc y de NFkB. En el caso de 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE también se ha observado un incremento de la [Ca2+]i pero no de AMPc, a excepción de 12-(S)-HETE que si que incrementa la concentración de AMPc. En todos los casos en los que un eicosanoide ha alterado la función epitelial de barrera se ha observado una relación entre el incremento de la PP y la redistribución hacia el citosol de las proteínas de la TJ ocludina y claudina-4, sin alteración de la localización de ZO-1, claudina-1 o claudina-2. Dichos eicosanoides, a excepción del 5-HETE, también incrementan la actividad de la MLCK provocando la desorganización del anillo de actina. A pesar de que la disrupción de la función epitelial de barrera observada en pacientes con IBD se ha atribuido tradicionalmente al efecto de citocinas proinflamatorias como TNF-α e IFN-γ, en la presente memoria se aportan evidencias del papel de los eicosanoides en la regulación de la PP. Además se aporta una posible explicación para los efectos negativos de la inhibición de la COX en pacientes con IBD y la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas. Si bien se ha descrito un efecto beneficioso del consumo de aceite de pescado o ácidos grasos n-3 en pacientes con IBD, este no puede ser atribuido a la reducción de la relación PGE2/PGE3 ya que ambas PG tienen un efecto negativo sobre la función epitelial de barrera. Sin embargo, dicho efecto sí que podría atribuirse a la generación de 12-HEPE que al contrario que 12-HETE no altera la PP. / The intestinal epithelium forms a barrier that allows the passage of nutrients but restricts the passage of potentially harmful substances. Alteration of epithelial barrier function is the mechanism responsible for the persistence of inflammation that occurs in gastrointestinal diseases such as inflammatory bowel disease (IBD) in which various eicosanoids are increased in the mucosa. For this reason, the objective of this study was to investigate the role of eicosanoids produced by different pathways of AA metabolism in the regulation of epithelial barrier function in a Caco-2 cell model. The paracellular permeability (PP) was estimated in Caco-2 cell cultures from the transepithelial electrical resistance (TER) and dextran fluxes. Intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) was quantified by spectrofluorimetry, cAMP and NFkB levels by enzyme immunoassay, MLC phosphorylation by Western blot and the state of the tight junction (TJ) proteins by immunofluorescence. The results indicate that PGE2, PGE3, 5-, 12-(R)-, 12-(S)-, 15-HETE and LTD4 are able to increase PP, whereas no alteration is induced by 13-HODE, 20-HETE, 11,12- and 14,15-EET, 11,12- and 14,15-DHETE or 12-HEPE. PGE2 and PGE3 alter the barrier function through the interaction with EP1 and EP4 receptors that activate the PLC-IP3-Ca2+ pathway and the cAMP-PKA pathway, respectively. In the case of LTD4 and 5-HETE, along with an increase in [Ca2+]i there is an activation of PLC-Ca2+/PKC and PKA independent of cAMP and NFkB pathways. For 12- and 15-HETE we have also observed an increase in [Ca2+]i but not in cAMP, except for 12-(S)-HETE which did increase cAMP levels. From the study of the TJ protein immunolocalization, in all cases in which an eicosanoid has increased PP a redistribution of occludin and claudin-4 without altering ZO-1, claudin-1 or -2 can be observed. Furthermore, the alteration of the actin ring and the increase in MLCK activity has been observed in all the eicosanoids that increased PP except for 5-HETE. Although the disruption of epithelial barrier function observed in IBD patients has been traditionally attributed to the effect of proinflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ, this thesis evidences a role for the eicosanoids in the regulation of PP, opening up possibilities for new therapeutic strategies.

The extracellular matrix (ECM) hinders diffusion in both tissues and hydrogels used in 3D cultures. However, how geometric and non-geometric ECM properties contribute to diffusion hindrance remains poorly understood. To address this question, the effective diffusivity D of FITC-dextrans with molecular weight (Mr, 4-70 kDa) spanning the physiological range of signaling factors was measured in a panel of acellular ECM gels with an optical macroscopic assay. Gels included reconstituted basement membrane/Matrigel, fibrin and type I collagen, and exhibited an average pore size much larger than any dextran size. Unexpectedly, a decay of D with Mr following a power-law with an exponent that matched that predicted by the Stokes-Einstein law in all gels (D ~ Mr-1/3, r2=0.99) was observed, revealing that hindered diffusion is dominated by nongeometric viscous factors. This law predicted that Matrigel and fibrin exhibited similar viscosities, which was confirmed with microrheology measurements by atomic force microscopy. Moreover, gels with the lowest D exhibited diffusion hindrance comparable to the extreme physiologic hindrance of brain tissue, which has a typical pore size much smaller than ECM gels. In contrast, diffusion hindrance in sparse (</=1 mg/ml) gels was very weak and below any reported tissue diffusivity data. These observations reveal a major role for the enhanced viscosity of the extracellular space in regulating the passive transport in both 3D culture and tissues, and indicate that dense ECM gels (>/=3 mg/ml) are suitable tissue surrogates in terms of macromolecular diffusion. Additionally, it is unknown to what extent current 3D culture protocols provide physiologic oxygen tension conditions. To address this limitation, oxygen tension was measured within the acellular or cellularized ECM gels with A549 cells, and analyzed in terms of oxygen diffusion and consumption. Oxygen diffusivity in acellular gels was up to 40% smaller than that of water, and the lower values were observed in the denser gels. In 3D cultures, physiologic oxygen tension was achieved after 2 days in dense (>/=3 mg/ml) but not sparse gels, revealing that the latter gels are not suitable tissue surrogates in terms of oxygen distribution. In dense gels, a dominant effect of ECM composition over density in oxygen consumption as observed. All diffusion and consumption data were used in a simple model to estimate ranges for gel thickness, seeding density and time-window that may support physiologic oxygen tension. Thus, critical variables for oxygen tension in ECM gels were identified, and a model to assess initial values of these variables was introduced, which may short-cut the optimization step of 3D culture studies. / Tradicionalmente, las células han sido cultivadas en placas Petri en un entorno bidimensional por más de un siglo. Sin embargo, las células de un organismo vivo tienen un entorno tridimensional. Todas las células del tejido se unen a una matriz extracelular (ECM). Además, la difusión y la vinculación de muchas proteínas tales como factores de crecimiento, está regulada por la matriz 3D. El reconocimiento del importante papel regulador de la ECM in vivo ha extendido los usos de los cultivos en 3D basados en el crecimiento de las células dentro de geles con componentes nativos de ECM . El objetivo general de esta tesis fue estudiar las características de los cultivos celulares tridimensionales de matriz extracelular más comunes en términos de difusión. Los resultados ilustran que la relación de Stokes-Einstein derivada para fluidos newtonianos puede extenderse a la compleja estructura enmarañada de geles de ECM para partículas esféricas mucho más pequeñas que el tamaño de poro medio de la ECM. Además, el impedimento a la difusión (tortuosidad) en geles de ECM está dominada por factores no-geométricos hidrodinámicos (es decir, viscosidad ECS) en lugar de las propiedades geométricas (estérica) del gel tal y como se asume en la literatura. Los cultivos en 3D basados en geles densos (3 mg/ml) son sustitutos adecuados de los tejidos en términos de difusión y son incluso capaces de reproducir la tortuosidad fisiológica extrema del tejido cerebral. Estos resultados apoyan que la ECM es un importante aporte a la tortuosidad del tejido, particularmente en grandes densidades de ECM y se destaca la importancia de utilizar los portadores con baja RH en la entrega de fármacos. Se han proporcionado las primeras mediciones del consumo de oxígeno en células A549 en cultivos 3D, las cuales han revelado un efecto dominante de la composición de ECM sobre la densidad en el consumo de oxígeno. Las predicciones de modelos pueden ser útiles como puntos de partida para el grosor y la densidad celular inicial en los estudios de cultivos 3D, reduciendo así la optimización inicial. Muchos de los efectos no deseados de difusión pueden ser superados mediante simples modificaciones experimentales como el espesor del gel o la densidad de siembra inicial.

Los tensioactivos son compuestos altamente versátiles con amplia utilización en la industria farmacéutica y cosmética. Aquellos derivados de aminoácidos presentan una baja toxicidad y elevada biodegradabilidad y, por lo tanto, tienen un abanico más amplio de aplicaciones y constituyen una alternativa a los tensioactivos sintéticos convencionales. En los últimos años, existe un interés creciente en la utilización de excipientes bioactivos con actividad lítica pHsensible en sistemas nanoestructurados, con el fin de aumentar la especificidad y eficacia de dichos vehículos para la liberación de fármacos en órganos o células dianas. En este trabajo se ha planteado estudiar dos grupos de tensioactivos derivados de lisina: tensioactivos aniónicos de doble cadena derivados de la N(α,)N(ε)-dioctanoil lisina y tensioactivos catiónicos de cadena simple derivados de la N(ε)-acil lisina o N(α)-acil lisina. En primer lugar, se ha procedido con el estudio de las propiedades de interacción de estos tensioactivos con membranas celulares en función del pH del medio, utilizando el eritrocito como modelo de membrana endosomal. Se ha demostrado que los tensioactivos aniónicos tienen actividad lítica pHdependiente independiente del contraión, mientras que las propiedades de los tensioactivos catiónicos dependen especialmente de la posición de la carga catiónica y, en menor medida, de la longitud de cadena alquílica. La actividad pH-sensible se atribuye a la presencia de la carga positiva en el grupo α-amino de la lisina, mientras que el aumento de la fluidez de la membrana y la pérdida de sus proteínas estructurales se han evidenciado como los mecanismos involucrados en el aumento de la lisis celular a pH ácidos. Una vez corroborado el potencial lítico pH-dependiente de los tensioactivos, se ha avanzado en el desarrollo, caracterización y estudio toxicológico de sistemas nanoestructurados conteniendo estos compuestos. En primer lugar, se han desarrollado nanovesículas lipídicas con los tensioactivos catiónicos y se ha procedido con el estudio de sus efectos tóxicos en células representativas de la piel, como propuesta de su potencial aplicación en formulaciones de administración tópica. Se han observado efectos citotóxicos moderados, respuesta inflamatoria leve y ausencia de fototoxicidad. A continuación, se han llevado a cabo estudios de los mecanismos involucrados en la toxicidad de las nanovesículas, además de la evaluación de su capacidad de internalización celular. Se ha propuesto que el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la apoptosis son los principales mecanismos involucrados en la toxicidad. Por otra parte, los estudios de internalización celular y estabilidad endosomal han mostrado la capacidad de las nanovesículas que contienen los tensioactivos con carga positiva en el grupo α-amino de la lisina para romper la membrana de los endosomas, lo que corrobora su actividad pH-dependiente. Por último, se han desarrollado nanopartículas poliméricas incluyendo el tensioactivo aniónico 77KL como excipiente pH-sensible. Se ha encapsulado el fármaco antitumoral metotrexato y se ha demostrado su mayor actividad en inhibir la proliferación de las células tumorales en comparación con el fármaco libre no encapsulado. Este hecho se atribuye, especialmente, a la actividad pH-dependiente de las nanopartículas. Tras la internalización y liberación específica del fármaco a nivel intracelular, la inhibición del ciclo celular, la apoptosis y, en menor medida, el daño mitocondrial y lisosomal, se han demostrado como los mecanismos involucrados en la actividad antitumoral del metotrexato encapsulado en las nanopartículas. En conclusión, es importante destacar que el desarrollo de vehículos con actividad pHdependiente es una propuesta interesante para mejorar la liberación intracelular de fármacos y para aumentar sus efectos terapéuticos. Por lo tanto, se considera que los tensioactivos derivados de lisina estudiados en esta Tesis son potenciales excipientes bioactivos en formulaciones nanoestructuradas. Del mismo modo, los métodos in vitro utilizados se mostraron eficaces en demostrar los mecanismos involucrados en los efectos tóxicos de los nanomateriales. / Surfactants are among the most versatile and widely applied excipients in cosmetics and pharmaceuticals. Amino acid-based surfactants, which have this versatility together with biocompatibility, low toxicity and pH-responsive membrane-disruptive activity, could be potential bioactive excipients in intracellular drug delivery systems. In this line, five anionic and three cationic lysine-based surfactants were studied concerning their pH-dependent properties using the erythrocyte as a model of endosomal membrane. All the anionic surfactants showed pH-sensitive activity independently on the counterion, whereas among the cationic amphiphiles, only those with the positive charge on the α-amino group of lysine displayed membrane-lytic activity dependent on the pH. Thereafter, these amphiphiles were applied in the development of pH-sensitive nanocarriers. The cationic surfactants were included in lipid-based nanovesicles, while the anionic compound 77KL was used for the preparation of methotrexate-loaded chitosan nanoparticles. It was assessed whether the cationic compounds increase the likelihood of intracellular delivery and modulate the toxicity of the nanovesicles, as a proposal for their potencial intravenous application. Due to increasing concern over animal use, in vitro alternative methods were used for all studies. The induction of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis were the general mechanisms underlying cytotoxicity. Fluorescence microscopy analysis demonstrated that nanovesicles were internalized by cells, and evidenced that their ability to release endocytosed materials into cell cytoplasm depends on the structural parameters of amphiphiles. Moreover, the cytotoxicity of nanovesicles was evaluated using representative skin cell lines, and the wide range of in vitro assays proved the applicability of these nanocarriers for topical administration. On the other hand, the pH-sensitive behavior of nanoparticles containing 77KL allowed accelerated release of methotrexate in an acidic medium, as well as membrane-lytic pH-dependent activity, which facilitated the cytosolic delivery of endocytosed materials. Besides, our results clearly proved that the drug encapsulated into the nanoparticles were more active against the tumor cells than the free drug. Altogether, these studies showed that the design of nanocarriers containing pHsensitive surfactants as bioactive excipients for endosome disruption is a promise approach for intracellular drug delivery and increased therapeutic effects. Furthermore, the insights into some toxicity mechanisms of these new nanomaterials contribute to reducing the uncertainty surrounding their potential health hazards.

Estudios previos demostraron que la disminución de la liberación del ácido araquidónico (AA) bloqueaba la proliferación de los fibroblastos 3T6 inducida por suero fetal. Además, la inhibición de las ciclooxigenasas (COXs) producía una reducción parcial de la proliferación celular, mientras que los antagonistas receptoriales de la prostaglandina (PG) E2 bloqueaban casi completamente el crecimiento de los fibroblastos 3T6. Estos resultados sugirieron la implicación de los metabolitos del AA producidos a través de otras vías como la de las lipoxigenasas (LOXs), que produce leucotrienos (LTs) y ácidos hidroxiecosatetraenoicos (HETEs), o la de los citocromos P-450 (CYPs), que forma HETEs y ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs). El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar la implicación de estas vías sobre el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6. Nuestros resultados han sugerido que el suero induce la síntesis de PGE2 y 12(S)-HETE en los fibroblastos 3T6, mientras que los niveles de LTB4 son muy bajos y se encuentran en el límite de detección. Por otro lado, los inhibidores específicos de la 5-LOX (zileuton) y de la 12/15-LOXs (baicaleína), y los antagonistas de los receptores de los LTs (U-75302, REV-5901, LY-171883) no inhibieron de forma significativa el crecimiento de los fibroblastos 3T6 ni la incorporación de timidina. Sin embargo, en los macrófagos RAW 264.7, estos mismos tratamientos fueron capaces de inhibir la proliferación celular y la incorporación de timidina, y el zileuton produjo un retraso en el ciclo celular, sin inducir citotoxicidad o apoptosis. Estos resultados sugieren la implicación de la 5-LOX y los receptores de los LTs en el control de la proliferación de los macrófagos RAW 264.7. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que la adición exógena de LTB4 o LTD4, en ausencia de suero, induce un incremento del crecimiento y de la incorporación de timidina en los macrófagos RAW 264.7, y este efecto está mediado por la activación de las vías MAPK y PI3K/Akt. El EPA compite con el AA para ser metabolizado por la COX-2, formando PGE3, y por la 5-LOX, dando lugar al LTB5. Nuestros resultados demuestran que la PGE3 y el LTB5 estimulaban la proliferación de los macrófagos con una potencia similar a la de la PGE2 y LTB4. Dado que la vía de las LOXs no parecía implicada en el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6, se centró nuestro interés en estudiar los metabolitos del AA producidos por los CYPs. Nuestros resultados demostraron que inhibidores de los CYPs como el SKF-525A, 17-ODYA, ABT o PPOH inhibieron la síntesis de 12(S)-HETE, el crecimiento celular y la síntesis de DNA. Además, el 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE y 20-HETE revertieron la inhibición del crecimiento celular inducida por el SKF-525A, mientras que el 11,12-EET no lo hizo. Además, nuestros resultados mostraron que en ausencia de factores de crecimiento, el 5-HETE, 12(S)-HETE y 15(S)-HETE inducen el crecimiento de los fibroblastos 3T6 y la síntesis de DNA, y en este efecto estaba implicada la activación de la vía PI3K/Akt. Por otro lado, la adición exógena de 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE o 11,12-DHETE inhibió la proliferación de los fibroblastos 3T6 y la incorporación de timidina inducida por PDGF. Además, sugerimos que estos metabolitos son pro-apoptóticos ya que aumentan la externalización de la fosfatidilserina, la actividad caspasa total y la fragmentación de la cromatina nuclear. Finalmente, observamos que los EETs como el 11,12-EET y 14,15-EET aumentaron la actividad caspasa-3 y caspasa-12 en los fibroblastos 3T6. En resumen, la proliferación de los fibroblastos 3T6 estaría regulada por los metabolitos del AA producidos por la vía de las COXs y por la vía de los CYPs. En este último caso, están implicados los HETEs con efecto proliferativo, y los EETs, con efectos anti-proliferativo y pro-apoptótico. / Free arachidonic acid (AA) can be metabolized by three pathways: the cyclooxygenases (COXs), which produces prostaglandins (PGs) and thromboxanes; the lipoxygenases (LOXs), which forms leukotrienes (LTs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and lipoxins; and the cytochrome P450 monooxygenases (CYPs), which pruduces hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and epoxyeicosatrienoic acids (EETs). Finally, the cytosolic epoxide hydrolases catalyze a rapid enzymatic hydration of the EETs to dihydroxyeicosatetraenoic acids (DHETEs). Previous studies demonstrated the role of AA metabolites derived through cyclooxygenase pathway on 3T6 fibroblast growth. These results suggested the implication of other pathways such as LOX or CYP in this function. Therefore, the aim of this thesis was to study the role of AA metabolites derived through LOX or CYP activity on 3T6 fibroblast growth. Our results showed that LOX pathway is not important in the control of 3T6 fibroblast proliferation, while LOX inhibitors and LT receptor antagonists blocked RAW 264.7 macrophage growth. Moreover, in the absence of serum, LTB4 and LTD4 increased RAW 264.7 macrophage proliferation through MAPK and PI3K/Akt pathways activation. On the other hand, CYP inhibitors reduced cell growth, thymidine incorporation and 12(S)-HETE synthesis on 3T6 fibroblasts. Furthermore, 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE and 20-HETE reverted the cell growth inhibition induced by the CYP inhibitor SKF-525A. In the absence of growth factors, 5-HETE, 12(S)-HETE and 15(S)-HETE increased cell growth and thymidine incorporation through PI3K/Akt pathway activation. However, exogenous addition of 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE or 11,12-DHETE inhibited 3T6 fibroblast growth and thymidine incorporation induced by PDGF. Moreover, these metabolites were pro-apoptotic increasing phosphatidylinositol externalization, total caspase activity and DNA fragmentation. Finally, we observed that EETs such as 11,12-EET and 14,15-EET increased caspase-3 and caspase-12 activity. In summary, 3T6 fibroblast growth is regulated by metabolites derived from AA-COX and AA-CYP, the last mentioned includes HETEs which have proliferative effect and EETs wich have anti-proliferative and pro-apoptotic effects.

El daño tisular secundario que se produce tras una lesión de la médula espinal contribuye de manera significativa a las pérdidas funcionales que se observan pacientes que padecen este tipo de afectación. Aunque la regeneración axonal y la sustitución de las neuronas dañadas tras el traumatismo medular son objetivos importantes para reparar estas lesiones, el desarrollo de estrategias experimentales que tengan como meta evitar el daño secundario sobre axones, neuronas, mielina y las células gliales, sea probablemente más factible de conseguir. La respuesta inflamatoria que se produce después de la lesión contribuye de manera significativa al daño secundario. Actualmente se conocen varios mecanismos encargados de promover el reclutamiento de leucocitos de la circulación periférica al tejido medular lesionado, y la activación de las células gliales endógenas. Sin embargo, las moléculas que desencadenan y modulan estas respuestas no se conocen con detalle. El ácido lisofosfatídico (LPA) es un potente mediador lipídico que activa y regula una gran variedad de respuestas celulares, tales como la homeostasis de calcio, la remodelación del citoesqueleto, la proliferación y supervivencia , la adhesión y migración, y la respuesta inflamatoria . El LPA ejerce todas estas funciones biológicas mediante la activación de 6 receptores acoplados a proteínas G, conocidos como LPARs (LPAR1-6). Estudios recientes ponen de manifiesto la implicación del LPA en el desarrollo de varias patologías, coma la arteriosclerosis, el cáncer y la fibrosis pulmonar, entre otros. Sin embargo, escasos estudios han evaluado hasta el momento si LPA está implicado en el transcurso de patologías que afectan sistema nervioso. Varias observaciones que proceden de cultivos celulares revelan que el LPA es capaz de activar las células microgliales y astrogliales, de inducir la muerte de neuronas, y promover la retracción axonal. Estudios realizados con animales de experimentación también muestran que el LPA está implicado en la etiología de la hidrocefalia fetal, y en el desarrollo de dolor neuropático tras la lesión del nervio ciático y tras isquemia cerebral. Sin embargo, se desconoce actualmente si el LPA participa de manera activa en la fisiopatología de la lesión medular. Durante los últimos 3 años hemos obtenido datos experimentales que demuestran que los niveles de LPA aumentan rápidamente en la médula espinal lesionada. También tenemos evidencias convincentes que sugieren que el aumento de los niveles de LPA que se produce en el parénquima medular tras una lesión por contusión desempeña un papel clave en la activación de una respuesta inflamatoria y en el desarrollo del daño secundario, y consecuentemente, en la aparición de déficits funcionales. En la presente tesis hemos elucidado qué receptores del LPA pertenecientes a la familia génica de diferenciación endotelial (LPA1-3) ejercen efectos nocivos en la lesión medular. Demostramos que los receptores LPA1 y LPA2 contribuyen a la generación del daño tisular tras la lesión medular y a la generación de déficits functionales, mientras que el receptor LPA3 ejerce efectos neutrales. Asimismo, describimos los mecanismos por los cuales los receptores LPA1 y LPA2 promueven daño neuronal y desmielinización. Dado que las principales compañías farmacéuticas están interesadas en el desarrollo de agonistas y antagonistas de los distintos receptores del LPA para el tratamiento de varias patologías de gran repercusión clínica, dicha estrategia tiene una gran posibilidad de traslación clínica. / Secondary tissue damage that occurs after spinal cord injury (SCI) contributes significantly to permanent functional disabilities. Although regeneration of damaged axons and replacement of lost neurons are important goals to repair the injured spinal cord, the secondary damage to axons, neurons, myelin and glial cells that follows the initial trauma is likely to be more easily amenable to treatment. Therefore, preventing or minimizing such secondary damage after SCI is expected to substantially reduce functional deficits. The inflammatory response that occurs after SCI strongly contributes to secondary injury. A number of mechanisms underlie the recruitment of leukocytes from the peripheral circulation, and the activation of these cells and endogenous microglia and astrocytes within the injured spinal cord. However, the molecules that trigger these responses are not completely known. Lysophosphatidic acid (LPA) is a potent, biologically active lipid mediator that regulates many physiological functions such as of cellular Ca2+ homeostasis, cytoskeleton remodeling, proliferation and survival, adhesion and migration and inflammation. LPA exerts all these functions by signaling via 6 G-protein coupled receptors known as LPARs (LPA1-6). Recent studies highlight the involvement of LPA in the development of many human diseases, such as atherosclerosis, cancer and pulmonary fibrosis. However, few studies have assessed so far whether LPA contributes to nervous system pathologies. Several in vitro observations reveal that LPA activates astrocytes and microglial cells, causes neuronal cell death, and promotes axonal retraction. In vivo studies also show that LPA is involved in the etiology of fetal hydrocephalus, as well as the development of neuropathic pain after sciatic nerve injury and cerebral ischemia. However, whether LPA is involved in the pathophysiology of SCI is still unknown. We currently have novel unpublished data demonstrating that LPA levels rapidly increased in the contused spinal cord. We have also clear evidences indicating that administration of LPA into the uninjured spinal cords triggers glial cell activation and demyelination, and leads to motor impairments. Altogether, our preliminary results strongly suggest that the increased levels of LPA that occurs after SCI may play an important role in triggering secondary damage and functional impairments. The present thesis aimed at assessing which of endothelial differentiation gene family LPA receptors (LPA1-3) exert such harmful effects in SCI. We found that LPA1 and LPA2 contribute to tissue damage and functional impairments after SCI, whereas LPA3 has a neutral effect.. Moreover, we reveal the mechanisms underlying neuronal cell death and demyelination triggered by LPA1 and LPA2. Since major pharmaceutical companies are interested in the development of LPA receptor agonists and antagonists for the treatment of several human diseases, such treatments have a high likelihood of progressing rapidly to the clinic.

The evaluation of chronic activity of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis is critical for determining the impact of chronic stressful situations. The potential use of hair glucocorticoids as a non-invasive, retrospective, biomarker of long term HPA activity is of great interest, and it is gaining acceptance in humans and animals. However, there are still no studies in literature examining hair cortisol concentration in pigs and corticosterone concentration in laboratory rodents. Therefore, we developed and validated, for the first time, a method for measuring hair glucocorticoids concentration in commercial sows and in Sprague-Dawley rats. Our preliminary data demonstrated: 1) a validated and specific washing protocol and extraction assay method with a good sensitivity in both species; 2) the effect of the reproductive phase, housing conditions and seasonality on hair cortisol concentration in sows; 3) similar hair corticosterone concentration in male and female rats; 4) elevated hair corticosterone concentration in response to chronic stress manipulations and chronic ACTH administration, demonstrating that hair provides a good direct index of HPA activity over long periods than other indirect parameters, such adrenal or thymus weight. From these results we believe that this new non-invasive tool needs to be applied to better characterize the overall impact in livestock animals and in laboratory rodents of chronic stressful situations that negatively affect animals welfare. Nevertheless, further studies are needed to improve this methodology and maybe to develop animal models for chronic stress of high interest and translational value in human medicine.

Il temperamento può essere definito come l’attitudine che un cane esprime verso le persone e verso altri animali, la combinazione di tratti fisici e mentali, acquisiti e non, che determinano il comportamento del cane. Tale parametro delinea perciò il carattere di un individuo, inclinazioni e tendenze, eccitabilità, tristezza, rabbia e il modo caratteristico di comportarsi di un individuo, con particolare riferimento alle interazioni sociali. La presente tesi di Dottorato rappresenta uno studio su alcuni tratti del temperamento nel cane domestico elaborato in 3 progetti sperimentali. Nei primi due progetti sono state analizzate le differenze attitudinali tra alcune razze canine attraverso l’applicazione di un test di temperamento in cuccioli di 60 giorni e in cani adulti, per valutare e confrontarne il temperamento, la socialità ed identificare profili tipici di razza. Nel terzo progetto un campione di cani morsicatori di canile e di proprietà è stato confrontato con due rispettivi gruppi di controllo. Analizzando i risultati è stato possibile mettere in evidenza caratteristiche di razza omogenee nell’interazione con stimoli inanimati, nelle interazioni sociali e in relazione alla possessività e sono stati delineati profili di razza sia nei cuccioli sia negli adulti. Si sono tuttavia, osservate variabilità individuali, intra-razza e intra-cucciolata, a testimonianza dell’influenza complessa e multifattoriale delle componenti genetica e ambientale sul comportamento dei cani. Il confronto tra cani morsicatori di canile e di proprietà ha messo in luce interessanti differenze tra i soggetti in termini di reattività, socievolezza, propensione all’interazione con il proprietario o con un estraneo, comportamenti di evitamento e velocità di reazione agli stimoli presentati. Il test applicato è risultato un valido strumento per valutare il temperamento di cani dichiarati aggressivi che sono stati sottoposti a situazioni nuove e a stimoli sconosciuti per poter ottenere una migliore visione d’insieme del temperamento del soggetto. / Temperament has been defined as the attitude expressed by the dog toward people or other animals, the combination of physical and mental traits, acquired or not, which determine the behavior of the dog and therefore delineates the character of an individual, his inclinations, trends and the characteristic way of behaving, with particular reference to social interactions. This work represents a study of temperamental traits in the Domestic Dog, developed in 3 experimental projects. In the first two projects the attitudinal differences between some dog breeds are analyzed, through the application of a temperament test in puppies 60 days old and adult, in order to evaluate and compare their temperament and sociability and to identify specific breed profiles. In the third project, a sample of biters dogs coming from different kennel of and pet biters dogs were tested and compared with two respective control groups. Analyzing the results, it was possible to highlight consistent breed characteristics in the interaction with inanimate stimuli, in social interactions and in relation to possessivness and a first breed profile has been outlined for both puppies and adults. However, individual variabilities were observed, relative to breed and litter, reflecting the complex and multifactorial influence of genetic and environmental components on the behavior of the dog. Furthermore, the study allowed us to evaluate dogs biters and compare them with the control groups, on the base of temperament traits. The comparison between biters coming from kennels and pet ones underlined differences in terms of reactivity, sociability, attitude to interact with the owner or with a stranger, in avoiding trends and velocity of reaction to the stimuli presented . The temperament test can be considered a valid tool to assess the temperament of aggressive dogs, in order to get a better overview of the temperament of the subjects.

Hair cortisol is a novel marker to measure long-term secretion cortisol free from many methodological caveats associated with other matrices such as plasma, saliva, urine, milk and faeces. For decades hair analysis has been successfully used in forensic science and toxicology to evaluate the exposure to exogenous substances and assess endogenous steroid hormones. Evaluation of cortisol in hair matrix began about a decade ago and have over the past five years had a remarkable development by advancing knowledge and affirming this method as a new and efficient way to study the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis activity over a long time period. In farm animals, certain environmental or management conditions can potentially activate the HPA axis. Given the importance of cortisol in monitoring the HPA axis activity, a first approach has involved the study on the distribution of hair cortisol concentrations (HCC) in healthy dairy cows showing a physiological range of variation of this hormone. Moreover, HCC have been significantly influenced also by changes in environmental conditions and a significant positive correlation was detected between HCC and cows clinically or physiologically compromised suggesting that these cows were subjected to repeated HPA axis activation. Additionally, Crossbreed F1 heifers showed significantly lower HCC compared to pure animals and a breed influence has been seen also on the HPA axis activity stimulated by an environmental change showing thus a higher level of resilience and a better adaptability to the environment of certain genotypes. Hair proved to be an excellent matrix also in the study of the activation of the HPA axis during the perinatal period. The use of hair analysis in research holds great promise to significantly enhance current understanding on the role of HPA axis over a long period of time.

The aim of this study was to investigate cortisol and progesterone (P4) trends in hair from birth up to postweaning in Italian trotter foals. Hair sampling is non-invasive and hair concentrations provide retrospective information of integrated hormone secretion over periods of several months. Samples were collected at birth and at a distance of 30 days, collecting only regrowth hair, up to post weaning. From birth to 3 months, foals cortisol falls from 47.64±5.6 to 4.9±0.68 pg/mg (mean±standard error), due to the interruption of foetal-placental connection and progressive adaptation to extrauterine life. From the third month of life to post weaning concentrations don’t vary significantly, underlining a non-chronic activation of the HPA axis. Hair P4 significantly decreases in the first two samples (from 469.68±72,54 to 184.65±35.42 pg/mg). At 2 (111.78±37.13 pg/mg) and 3 months (35.96±6.33 pg/mg) hair concentrations don’t show significant differences. These concentrations are not due to interactions of the utero-placental tissues with foals, animals are still prepuberal and P4 isn’t produced by adrenals as a result of high stress. We could therefore hypothesize that the source of foal hair P4 could be milk, suckled from mares. The high individual variability in hair at 2 and 3 months is due to a gradual and subjective change in foal diet, from milk to solid food, and to the fact that mares do not allow to suckle. From fourth month to post weaning P4 concentration in hair remains around 37.56±6.45 pg/mg. In conclusion, hair collected at birth, giving information about last period of gestation, could be used along with traditional matrices, to evaluate foals maturity. Hair cortisol could give indications about foals capacity to adapt to extra-uterine life. Finally milk, configuring as a bringer of nutrients and energy and assuming the characteristic of a nutraceutical, could give fundamental information about parental care.