Orientador : Marcia Regina Braga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:19:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_Kelly_M.pdf: 738471 bytes, checksum: 2b83f3abee751e2488f8da81c428b2c0 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Mucor ramosissimus Samutsevitsch, um fungo sapróbio isolado do filoplano de rubiáceas nativas tropicais, contém em seus esporos um potente eliciador capaz de induzir a síntese de fitoalexinas em espécies de rubiáceas e em cotilédones de soja. Estudos prévios indicaram que a atividade eliciadora dessa molécula pode ser inibida por ação de fragmentos pécticos (oligogalacturonídeos) derivados de parede celular de plantas. Este trabalho teve por objetivos purificar e caracterizar parcialmente este eliciador, e analisar a possível supressão de sua atividade indutora da síntese de fitoalexinas em cotilédones de soja por ação de oligogalacturonídeos. Parâmetros de crescimento, esporulação e atividade indutora determinadas para o fungo crescido em meio de cultura mínimo demonstraram que o 9° dia de cultivo é o melhor para obtenção de moléculas eliciadoras ativas na indução de gliceolinas. A purificação do eliciador por precipitação etanólica, cromatografias de troca iônica e de afinidade resultou em aumento de sua atividade específica e indicou a presença de ligações do tipo ? em sua estrutura química. O tratamento do eliciador de M. ramosissimus com periodato de sódio aboliu sua capacidade indutora de fitoalexinas em soja, indicando que esta atividade é determinada pela porção glicídica de sua molécula. Análises da composição de açúcares realizadas por HPLC e por GC/MS revelaram a presença de ácido glucurônico e manose em maiores proporções, seguidos de glucose, galactose e traços de fucose. Análises de ligação glicosídica revelaram a ausência de unidades de glucose 3 e 3,6 ligadas, indicando que este eliciador difere estruturalmente do ?-glucano isolado de micélios do fungo Phytophthora sojae. Ensaios de competição, nos quais o eliciador de M. ramosissimus foi co-aplicado com oligogalacturonídeos, revelaram que estes fragmentos parecem inibir diferencialmente as rotas biossintéticas dos metabólitos induzidos em soja pelo eliciador do fungo sapróbio M. ramosissimus quando comparado ao ?-glucano obtido do patógeno P. sojae. Os dados obtidos indicam que as plantas possuem a capacidade de responder a presença de fungos através do reconhecimento de moléculas eliciadoras com estruturas e atividades distintas e que são derivadas tanto de fungos patogênicos como de sapróbios. A atividade dessas moléculas eliciadoras pode ser alterada pela presença de oligogalacturonídeos / Abstract: Mucor ramosissimus Samutsevitsch is a saprophytic fungus isolated from the leaf surface of tropical Rubiaceae and that contains in its spores a potent elicitor of phytoalexin production in Rubiaceae species and soybean cotyledons. Previous results indicated that the eliciting activity of this elicitor could be suppressed by pectic fragments from plant cell walls (oligogalacturonides). The aims of this work were to purify and partially characterize the elicitor derived from spores of M. ramosissimus and analyze the suppression of its activity by oligogalacturonides. The 9th day of culture was the best to obtain the elicitor from autoclaved spores, considering growth parameters, sporulation, and inducing activity. The elicitor purification performed by ethanol precipitation and anion exchange and affinity chromatography, resulted in considerable increase in its specific activity, and indicated the presence of ?-linked sugar residues. The eliciting activity was abolished after treatment with sodium periodate, indicating that the sugar moiety is important for its activity. Sugar composition, analyzed by HPLC and GC/MS, revealed the predominance of glucuronic acid and mannose, followed by glucose, galactose and traces of fucose. Glycosyl-linkage analyses of the elicitor revealed the absence of 3 e 3,6-linked glucosyl residues indicating that the M. ramosissimus elicitor presents distinct structure and composition when compared to the ?-heptaglucoside obtained from Phytophthora sojae. The application of M. ramosissimus elicitor together with oligogalacturonides on soybean cotyledons resulted in inhibition of the biosynthetic pathways leading to the synthesis of secondary metabolites, this inhibition being different from that observed when the ?-glucan from P. sojae was used. Our results indicate that plants are able to respond to the presence of fungi by recognizing eliciting molecules with distinct structure and activity derived from pathogenic as well as from saprophytic species. The activity of these eliciting molecules can be altered by the presence of cell wall fragments derived of plant cell walls / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Com o objetivo de demonstrar a existência de substâncias extracelulares em urediniosporos de Hemileia vastatrix , capazes de desencadear a formação de fitoalexinas, foram utilizados bioensaios com cotilédones de soja. Para tanto foi inicialmente selecionada, através de bioensaios, a variedade de soja IAC-8, entre as variedades IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 e Cristalina, por ser a mais adequada quanto à capacidade de sintetizar a fitoalexina gliceolina e quanto à uniformidade de resposta em presença de um elicitor ativo nestes tecidos, proveniente de extrato comercial de células autolisadas da levedura Saccharomyces ceresiviae Meyen. Foi possível verificar que substâncias presentes no filtrado de suspensão aquosa de urediniosporos autoclavados de H. Vastatrix são capazes de desencadear a síntese da fitoalexina gliceolina em cotilédones de soja, variedade IAC-8. Objetivando o isolamento da substância elicitora extracelular, mais ativa, proveniente de urediniosporos de H. vastatrix, o filtrado aquoso foi submetido à purificação através de precipitação etanólica fracionada, seguida de cromatografias em colunas de Concanavalina-A Sepharose 4B, DEAE-celulose e Bio-Gel P-60, sendo estas etapas intercaladas por diálise. Pôde-se verificar que a atividade elicitora relativa aumentou gradativamente durante o processo de purificação, sendo que a fração elicitora mais pura apresentou uma atividade relativa 16,7 vezes maior do que aquela detecta- da para o filtrado aquoso bruto. O elicitor extracelular mostrou-se ativo mesmo quando concentrações equivalentes a 0,92 µg de carboidratos foram aplicadas por cotilédone. A atividade elicitora aumentou quando foram utilizadas concentrações crescentes do elicitor, atingindo um máximo à concentrações equivalentes a 10 µg de carboidratos por cotilédone. Foi possível observar que o elicitor, extracelular de H. vastatrix, solúvel em água e termoestável, e precipitado com etanol a 80% (v/v), não apresenta afinidade pela lectina Concanavalina-A e nem tampouco pelo trocador aniônico dietilaminoetil-celulose e possui um peso molecular menor que 60.000 e maior que 6.000 daltons. Visando elucidar a natureza química do elicitor extracelular de H. vastatrix, frações ativas foram submetidas a testes químicos para quantificação de carboidratos e proteínas, análise por cromatografia em fase gasosa e a tratamentos com metaperiodato de sódio e com as enzimas pronase, α-manosidase, β-galactosidase e β-glucosidase. O elicitor extracelular é oxidado pelo metaperiodato de sódio, o que acarreta a perda de sua atividade elicitora (94,63%), sendo esta parcialmente recuperada (56,20%) por redução com borohidreto de sódio e posterior hidrólise ácida fraca. Entretanto, a atividade elicitora não é alterada pelos tratamentos com as referidas enzimas. Os resultados ,obtidos evidenciam que o elicitor extracelular de H. vastatrix possui natureza polissacarídica, apresentando como principal componente a manose (88,77%), seguida pela glucose (6,67%) e a galactose (4,56%), sendo que os monossacarídeos componentes das moléculas dos polissacarídeos estão unidos entre si por ligações do tipo β.O polissacarídeo extracelular isolado de urediniosporos de H. vastatrix possui uma atividade biológica inespecífica, pois é capaz de desencadear a formação de fitoalexinas em uma planta não-hospedeira a H. vastatrix como a soja. / In order to demonstrate the presence of extracellular substances from uredionospores of Hemileia vastatrix, able to elicit the accumulation of phytoalexins, bioassays on soybean cotyledons were employed. Firstof all, among the soybean cultivars IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 and Cristalina, the IAC-8 cultivar was selected through the cotyledon bioassays for further experiments, since it exhibited a more suitable and uniform response to an active glyceollin elicitor, isolated from a commercially available extract of the yeast Saccharomyces cerevisiae Meyen. It was possible to verify that substances present in the filtrate of water-washes from autoclaved urediniospores of H. vastatrix were able to stimulate the synthesis of the phytoalexin glyceollin in IAC-8 soybean cotyledons. In order to isolate the extracellular elicitor from H. vastatrix, filtrates of water-washes of the autoclaved urediniospores, were purified through fractionated ethanolic precipitation, followed by column chromatography on Concanavalin-A Sepharose 4B, DEAE-cellulose and Bio-Gel P-60, intercalated with dialysis. It was possible to verify that the relative elicitor activity gradually increased throughout the purification steps and that the purest elicitor fraction showed a relative elicitor activity 16.7 times greater than that exhibited by the crude filtrate. The purified extracellular elicitor was active even when concentration equivalent to 0.92 μg of carbohydrate were applied per cotyledon. It was observed that the water-soluble extracellular elicitor from H. vastatrix was heat-stable, precipitated with 80% ethanol (v/v), had no affinity neither for the Concanavalin-A lectin nor for the anion exchanger diethyl aminoethyl-cellulose. The elicitor showed a molecular weight lower than 60,000 and greater than 6,000 daltons. In order to elucidate the chemical nature of the extracellular elícitor from H. vastatrix, active fractions were submitted to chemical tests, analysis through gas-liquid chromatography and treatments with sodium metaperiodate and a150 with pronase, α-mannosidase, β-galactosidase and β-glucosidase. The extracellular elicitor was sensitive to the sodium metaperiodate, that caused the elimination of its elicitor activity (94.63%). The biological activity was partially regained (56.20%) when the periodate-degraded polymers were reduced with sodium borohydride, followed by a mild acid hydrolysis. However, the elicitor activity was not affected by the mentioned enzyme treatments. Yet, the results showed that the extracellular elicitor from H. vastatrix was a β-linked polysaccharide that presented mannose the major component (88.77%), followed by glucose (6.67%) and galactose (4.56%). The extracellular polysaccharide isolated from urediniospores of H. vastatrix showed an unspecific biological activity, due to its ability to elicit phyto alexin accumulation on a non-host plant to H. vastatric as the soybean.

Com o objetivo de demonstrar a existência de substâncias extracelulares em urediniosporos de Hemileia vastatrix , capazes de desencadear a formação de fitoalexinas, foram utilizados bioensaios com cotilédones de soja. Para tanto foi inicialmente selecionada, através de bioensaios, a variedade de soja IAC-8, entre as variedades IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 e Cristalina, por ser a mais adequada quanto à capacidade de sintetizar a fitoalexina gliceolina e quanto à uniformidade de resposta em presença de um elicitor ativo nestes tecidos, proveniente de extrato comercial de células autolisadas da levedura Saccharomyces ceresiviae Meyen. Foi possível verificar que substâncias presentes no filtrado de suspensão aquosa de urediniosporos autoclavados de H. Vastatrix são capazes de desencadear a síntese da fitoalexina gliceolina em cotilédones de soja, variedade IAC-8. Objetivando o isolamento da substância elicitora extracelular, mais ativa, proveniente de urediniosporos de H. vastatrix, o filtrado aquoso foi submetido à purificação através de precipitação etanólica fracionada, seguida de cromatografias em colunas de Concanavalina-A Sepharose 4B, DEAE-celulose e Bio-Gel P-60, sendo estas etapas intercaladas por diálise. Pôde-se verificar que a atividade elicitora relativa aumentou gradativamente durante o processo de purificação, sendo que a fração elicitora mais pura apresentou uma atividade relativa 16,7 vezes maior do que aquela detecta- da para o filtrado aquoso bruto. O elicitor extracelular mostrou-se ativo mesmo quando concentrações equivalentes a 0,92 µg de carboidratos foram aplicadas por cotilédone. A atividade elicitora aumentou quando foram utilizadas concentrações crescentes do elicitor, atingindo um máximo à concentrações equivalentes a 10 µg de carboidratos por cotilédone. Foi possível observar que o elicitor, extracelular de H. vastatrix, solúvel em água e termoestável, e precipitado com etanol a 80% (v/v), não apresenta afinidade pela lectina Concanavalina-A e nem tampouco pelo trocador aniônico dietilaminoetil-celulose e possui um peso molecular menor que 60.000 e maior que 6.000 daltons. Visando elucidar a natureza química do elicitor extracelular de H. vastatrix, frações ativas foram submetidas a testes químicos para quantificação de carboidratos e proteínas, análise por cromatografia em fase gasosa e a tratamentos com metaperiodato de sódio e com as enzimas pronase, α-manosidase, β-galactosidase e β-glucosidase. O elicitor extracelular é oxidado pelo metaperiodato de sódio, o que acarreta a perda de sua atividade elicitora (94,63%), sendo esta parcialmente recuperada (56,20%) por redução com borohidreto de sódio e posterior hidrólise ácida fraca. Entretanto, a atividade elicitora não é alterada pelos tratamentos com as referidas enzimas. Os resultados ,obtidos evidenciam que o elicitor extracelular de H. vastatrix possui natureza polissacarídica, apresentando como principal componente a manose (88,77%), seguida pela glucose (6,67%) e a galactose (4,56%), sendo que os monossacarídeos componentes das moléculas dos polissacarídeos estão unidos entre si por ligações do tipo β.O polissacarídeo extracelular isolado de urediniosporos de H. vastatrix possui uma atividade biológica inespecífica, pois é capaz de desencadear a formação de fitoalexinas em uma planta não-hospedeira a H. vastatrix como a soja. / In order to demonstrate the presence of extracellular substances from uredionospores of Hemileia vastatrix, able to elicit the accumulation of phytoalexins, bioassays on soybean cotyledons were employed. Firstof all, among the soybean cultivars IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 and Cristalina, the IAC-8 cultivar was selected through the cotyledon bioassays for further experiments, since it exhibited a more suitable and uniform response to an active glyceollin elicitor, isolated from a commercially available extract of the yeast Saccharomyces cerevisiae Meyen. It was possible to verify that substances present in the filtrate of water-washes from autoclaved urediniospores of H. vastatrix were able to stimulate the synthesis of the phytoalexin glyceollin in IAC-8 soybean cotyledons. In order to isolate the extracellular elicitor from H. vastatrix, filtrates of water-washes of the autoclaved urediniospores, were purified through fractionated ethanolic precipitation, followed by column chromatography on Concanavalin-A Sepharose 4B, DEAE-cellulose and Bio-Gel P-60, intercalated with dialysis. It was possible to verify that the relative elicitor activity gradually increased throughout the purification steps and that the purest elicitor fraction showed a relative elicitor activity 16.7 times greater than that exhibited by the crude filtrate. The purified extracellular elicitor was active even when concentration equivalent to 0.92 μg of carbohydrate were applied per cotyledon. It was observed that the water-soluble extracellular elicitor from H. vastatrix was heat-stable, precipitated with 80% ethanol (v/v), had no affinity neither for the Concanavalin-A lectin nor for the anion exchanger diethyl aminoethyl-cellulose. The elicitor showed a molecular weight lower than 60,000 and greater than 6,000 daltons. In order to elucidate the chemical nature of the extracellular elícitor from H. vastatrix, active fractions were submitted to chemical tests, analysis through gas-liquid chromatography and treatments with sodium metaperiodate and a150 with pronase, α-mannosidase, β-galactosidase and β-glucosidase. The extracellular elicitor was sensitive to the sodium metaperiodate, that caused the elimination of its elicitor activity (94.63%). The biological activity was partially regained (56.20%) when the periodate-degraded polymers were reduced with sodium borohydride, followed by a mild acid hydrolysis. However, the elicitor activity was not affected by the mentioned enzyme treatments. Yet, the results showed that the extracellular elicitor from H. vastatrix was a β-linked polysaccharide that presented mannose the major component (88.77%), followed by glucose (6.67%) and galactose (4.56%). The extracellular polysaccharide isolated from urediniospores of H. vastatrix showed an unspecific biological activity, due to its ability to elicit phyto alexin accumulation on a non-host plant to H. vastatric as the soybean.

A indução de resistência em plantas contra fitopatógenos é um método alternativo de controle de doenças, o qual envolve a ativação de mecanismos de resistência latentes da planta. Hoje no mercado existem poucos produtos que atuam segundo este princípio. Na busca de novas moléculas que possam ser utilizadas em campo, diversos compostos de origem microbiana, com capacidade de estimular uma ou mais respostas de defesa, já foram isolados e caracterizados. A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura capaz de induzir resistência e elicitar respostas de defesa em algumas plantas. Com o objetivo de extrair da levedura um ou mais compostos capazes de induzir o acúmulo de fitoalexinas em cotilédones de soja e na proteção dessa leguminosa contra Microsphaera diffusa (agente causal do oídio da soja) e de pepino contra Colletotrichum lagenarium (agente causal da antracnose do pepino), células em suspensão foram autoclavadas. Os compostos assim extraídos foram inicialmente separados através de precipitação etanólica. Em seguida, foram realizadas cromatografias de troca iônica e de afinidade para separar as frações com maior poder elicitor das de baixo poder elicitor. A fração não adsorvida à resina DEAE-Celulose foi a que induziu maior acúmulo de fitoalexinas. No entanto, nenhum dos preparados testados foi capaz de conferir proteção a plantas de soja contra M. diffusa. Já no caso de pepino, plântulas tratadas com as frações resultantes da cromatografia de afinidade apresentaram reduções entre 50 e 70 % de área lesionada causada por C. lagenarium e aumento na atividade de peroxidases. Extratos incorporados à meio de cultivo não apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento e esporulação de C. lagenarium. Com base nesses resultados, concluímos que existe na parede da levedura compostos capazes de induzir resistência local em pepino contra C. lagenarium, sendo que pelo menos um destes compostos é um carboidrato, contendo provavelmente manana e glucosamina. / The acquired resistance of plants to pathogens is an alternative method to control diseases which includes the activation of resistance mechanisms in the plants. A few products already commercially available have their action based upon this mechanism. In the search for novel molecules that can be used under field conditions, many compounds from microbes with the ability to stimulate one or more defense responses were already isolated and characterized. Saccharomyces cerevisiae is an yeast with the ability to induce defense responses and resistance in some plants. A suspension of cells from the yeast was autoclaved with the purpose of extracting one or more compounds with the ability to induce the accumulation of phytoalexins in soybean cotyledons and to protect soybean plants against Microsphaera diffusa (causal agent of powdery mildew) and plants of cucumber against Colletotrichum lagenarium (causal agent of anthracnose). The compounds extracted by this method were separated using ethanolic precipitation. After this step, the fractions of higher elicitation activity were separated from those of lower one by using ion exchange cromatography and affinity cromatography. The non-adsorbed fraction to DEAE-Cellulose was the one that induced the highest accumulation of phytoalexins. However, none of the fractions were able to protect soybean plants from M. diffusa. In the case of cucumber, seedlings treated with the fractions from affinity chromatography were able to reduce disease symptoms caused by C. lagenarium by 50 to 70 % and to increase the activity of peroxidases. Extracts that were incorporated into growing media did exhibit any inhibitory effect on in vitro growth and sporulation of C. lagenarium. According to these results, it is possible to conclude that there are compounds in the cell walls of the yeast that are able to induce local resistance to C. lagenarium in cucumber and that at least one of these compounds is a carbohydrate that likely contains mannan and glucosamine.

A indução de resistência em plantas contra fitopatógenos é um método alternativo de controle de doenças, o qual envolve a ativação de mecanismos de resistência latentes da planta. Hoje no mercado existem poucos produtos que atuam segundo este princípio. Na busca de novas moléculas que possam ser utilizadas em campo, diversos compostos de origem microbiana, com capacidade de estimular uma ou mais respostas de defesa, já foram isolados e caracterizados. A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura capaz de induzir resistência e elicitar respostas de defesa em algumas plantas. Com o objetivo de extrair da levedura um ou mais compostos capazes de induzir o acúmulo de fitoalexinas em cotilédones de soja e na proteção dessa leguminosa contra Microsphaera diffusa (agente causal do oídio da soja) e de pepino contra Colletotrichum lagenarium (agente causal da antracnose do pepino), células em suspensão foram autoclavadas. Os compostos assim extraídos foram inicialmente separados através de precipitação etanólica. Em seguida, foram realizadas cromatografias de troca iônica e de afinidade para separar as frações com maior poder elicitor das de baixo poder elicitor. A fração não adsorvida à resina DEAE-Celulose foi a que induziu maior acúmulo de fitoalexinas. No entanto, nenhum dos preparados testados foi capaz de conferir proteção a plantas de soja contra M. diffusa. Já no caso de pepino, plântulas tratadas com as frações resultantes da cromatografia de afinidade apresentaram reduções entre 50 e 70 % de área lesionada causada por C. lagenarium e aumento na atividade de peroxidases. Extratos incorporados à meio de cultivo não apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento e esporulação de C. lagenarium. Com base nesses resultados, concluímos que existe na parede da levedura compostos capazes de induzir resistência local em pepino contra C. lagenarium, sendo que pelo menos um destes compostos é um carboidrato, contendo provavelmente manana e glucosamina. / The acquired resistance of plants to pathogens is an alternative method to control diseases which includes the activation of resistance mechanisms in the plants. A few products already commercially available have their action based upon this mechanism. In the search for novel molecules that can be used under field conditions, many compounds from microbes with the ability to stimulate one or more defense responses were already isolated and characterized. Saccharomyces cerevisiae is an yeast with the ability to induce defense responses and resistance in some plants. A suspension of cells from the yeast was autoclaved with the purpose of extracting one or more compounds with the ability to induce the accumulation of phytoalexins in soybean cotyledons and to protect soybean plants against Microsphaera diffusa (causal agent of powdery mildew) and plants of cucumber against Colletotrichum lagenarium (causal agent of anthracnose). The compounds extracted by this method were separated using ethanolic precipitation. After this step, the fractions of higher elicitation activity were separated from those of lower one by using ion exchange cromatography and affinity cromatography. The non-adsorbed fraction to DEAE-Cellulose was the one that induced the highest accumulation of phytoalexins. However, none of the fractions were able to protect soybean plants from M. diffusa. In the case of cucumber, seedlings treated with the fractions from affinity chromatography were able to reduce disease symptoms caused by C. lagenarium by 50 to 70 % and to increase the activity of peroxidases. Extracts that were incorporated into growing media did exhibit any inhibitory effect on in vitro growth and sporulation of C. lagenarium. According to these results, it is possible to conclude that there are compounds in the cell walls of the yeast that are able to induce local resistance to C. lagenarium in cucumber and that at least one of these compounds is a carbohydrate that likely contains mannan and glucosamine.

No presente estudo, foram avaliados o potencial dos óleos essenciais das espécies Cymbopogon nardus L. (Capim citronela), Copaifera sp. (Copaíba) e Ocimum basilicum L. (Manjericão) no controle de fitopatógenos associados a sementes comercializadas de manjericão; também foi determinada a composição química do óleo essencial de Morinda citrifolia L. (Noni) e sua atividade fungitóxica in vitro e in vivo no controle de fitopatógenos causadores de helmintosporiose, bem como seu potencial na indução de síntese de fitoalexinas e enzimas envolvidas nos mecanismos resistência a doenças e defesa em plantas de milho. Devido à complexidade da composição química dos óleos essenciais, tais substâncias têm apresentado potencial promissor no controle de agentes fitopatogênicos. Observou-se que os óleos essenciais apresentam potencial de inibição da micoflora associada às sementes de O. basilicum, e o óleo essencial de C. nardus foi eficiente no controle in vitro inibindo a germinação de conídios e o crescimento micelial do fitopatógeno Curvularia sp., além de ter sido também, eficaz no controle preventivo da mancha de Curvularia em plantas de O. basilicum. Apesar de não haver informações quanto a utilização do óleo essencial de frutos de M. citrifolia no controle de fitopatógenos, os resultados demonstraram que o óleo essencial desta espécie foi eficiente na inibição do crescimento micelial e na severidade da doença helmintosporiose do milho causada pelos fitopatógenos Bipolaris maydis e Exserohilum turcicum, apresentando valores de ACPD inferiores aos valores observados quando as plantas foram pulverizadas com fungicida. Também observou-se que o óleo essencial apresentou potencial na síntese de fitoalexinas envolvidas nos mecanismos de resistência e defesa vegetal em plantas de milho. / At the present study we evaluated the potential of essential oils of species Cymbopogon Nardus L. (Citronella grass), Copaifera sp. (Copaiba) and Ocimum basilicum L. (Basil) in control phytopathogens associated seeds marketed of O basilicum; the essential oil chemical composition of Morinda citrifolia L. (Noni) and its fungitoxic activity in vitro and in vivo in control of phytopathogens causers of leaf blotch, as well as the its potential for phytoalexin synthesis and enzymes induction involved in the mechanisms disease resistance and defense in maize plants. Due to the complexity of the chemical composition of essential oils, such substances have presented promising potential in the control of pathogenic agents. Observed that essential oils presented potential for inhibition of mycoflora associated to O. basilicum seeds, and the essential oil of C. nardus was effective in vitro control inhibiting spore germination and mycelial growth of the phytopathogen Curvularia sp., besides having been also, effective in the preventive control of Curvularia spot disease in O. basilicum plants. Although there is no information about the use of essential oil of M. citrifolia fruits on the control of phytopathogens, the results showed that the essential oil of this species was effective in inhibiting the mycelial growth and the blotch severity of disease caused by phytopathogens Bipolaris maydis and Exserohilum turcicum, presenting AUDPC values lower than those observed when plants were sprayed with fungicides. It was also observed that the essential oil presented potential in phytoalexin and enzymes synthesis involved in resistance and defense mechanisms in maize plants.

Orientador: Marcia Regina Braga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T08:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kretzschmar_FernandadosSantos_M.pdf: 1298329 bytes, checksum: ea1fc8a628a790dbf39de684ebe6192d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Plântulas de soja (Glycine max L. Merr), crescidas sob alta concentração de CO2 em sistema de câmaras de topo aberto apresentam incremento na fotossíntese e ganhos de produtividade, podendo alterar a produção de metabólitos secundários de importância farmacológica. Este trabalho teve como objetivo analisar a síntese de flavonas, isoflavonas e pterocarpanos em plântulas de soja (IAC-18, resistente ao fungo causador do cancro da haste Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis), cultivadas em atmosfera de 380 e 760 mmol mol-1 de CO2 e estimulada por diferentes eliciadores bióticos e abióticos. Fragmentos do b-glucano de Phytophthora megasperma, autoclavados de esporos de D. phaseolorum (Dpm) e moléculas doadoras de óxido nítrico (GSNO e SNP) foram utilizados como eliciadores. Os ensaios foram feitos aplicando-se os eliciadores sobre cotilédones destacados de plântulas de soja com 9 dias de idade (estádio VC). A exposição à 760 mmol mol-1 de CO2 estimulou a fotossíntese, aumentou a área e a massa fresca de cotilédones e folhas e resultou em incremento na produção de coumestrol, daidzeína, genisteína, luteolina e apigenina induzidas principalmente por SNP. Para gliceolinas e daidzina, o efeito estimulador do CO2 foi observado por indução apenas com o b- glucano. Parâmetros bioquímicos relativos aos carboidratos solúveis e estruturais das plântulas de soja também mostraram diferenças significativas entre os dois tratamentos com CO2. Os resultados obtidos reforçam a sugestão de que o incremento na disponibilidade de carbono pode modificar as defesas induzidas em soja contra patógenos, porém, essas alterações ocorrem em metabólitos específicos e dependem do eliciador utilizado / Abstract: Soybean seedlings (Glycine max L. Merr) grown in open top chambers under high CO2 concentrations have shown photosynthetic increment and increase in productivity, which in turn may modify the productio n of secondary metabolites with farmacological importance. The aim of this work was to analyze the synthesis of flavones, isoflavones and pterocarpans in soybean seedlings (IAC-18, a cultivar resistant to the causal agent of the stem canker disease Diaphorthe phaseolorum f. sp. Meridionalis), kept under 380 and 760 mmol mol-1 CO2 atmospheres stimulated by biotic and abiotic elicitors. The b-glucan from mycelial walls of Phythophytora megasperma, autoclaved espores of D. phaseolorum (Dpm) and the NO donors, GSNO and SNP, were used as elicitors. The assays were performed by applying the elicitors on detached cotyledons from 9 days old soybean seedlings (VC stage). The exposition to 760 mmol mol-1 of CO2 stimulated photosynthesis, increased the area and fresh mass of leaves and cotyledons, and raised the production of coumestrol, daidzein, genistein, luteolin and apigenin, mainly induced by SNP. For glyceollins and daidzin the CO2 stimulatory effect was observed only by the induction with the b-glucan. Biochemical parameters related to soluble and structural carbohydrates from soybean seedlings also showed significant differences between the two CO2 treatments. These results strengthen the suggestion that the increment in the carbon availability may modify the inducible defenses in soybean against pathogens. However, these alterations occur in specific metabolites and depend on the elicitor / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2017-11-22T17:51:25Z No. of bitstreams: 2 Omari DF Dildey 2017.pdf: 1365505 bytes, checksum: cb552699fd45b8b24d3b14fefe36a796 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-22T17:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Omari DF Dildey 2017.pdf: 1365505 bytes, checksum: cb552699fd45b8b24d3b14fefe36a796 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-05-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study aimed to purify by chromatography elicitors from Trichoderma longibrachiatum culture filtrate and mycelium extract and to test them in phytoalexin phaseolin inducing and resistance induced to anthracnose in common bean. The sodium phosphate buffer at 0.05 M (SPB) was used as the control treatment and the ASM (Acibenzolar-S-Metil) was used as the standard induction treatment. Ion Exchange Chromatography (IEC) and Gel Filtration Chromatography (GFC) were performed to separate fractions with eliciting power from the culture filtrate (CF) and T. longibrachiatum mycelium extract (TME). For the purification of elicitors by IEC, from GFC, it were obtained one glycidic and five glycoproteins fractions, totaling six fractions. For purification from TME, it were obtained three protein, one glycidic and two glycoproteins fractions, totaling six fractions. In both, were obtained twelve fractions from IEC. These, in turn, were purified in GFC, being obtained a total of thirty seven fractions. Among these, there were fourteen fractions of TME were classified according to their nature, being three proteins, two glycogen and nine glycoproteins. There were twenty-three fractions from TME, wich were classified according to their nature, being four proteins, nine glycogen and ten glycoproteins. Of the fractions purified in CFG from FTC and TME, eight presented phaseolin inducer potential (F17, F23, F25, F27, F31, F38 and F46). The 10 treatments consisted of the eight fractions and two controls: ASM and control (TAP). Treatments were applied in one of the primary leaves (treated leaf (TL)), and the other primary leaf was not treated (untreated leaf (UL)) to verify the systemic effect. Three leaf samples were taken for determination of enzymatic activity: before applying the fractions, after application of the fractions and after the pathogen inoculation. The defense enzyme analysis was performed for Peroxidase (POX), Polyphenoloxidase (PFO), Catalase (CAT), Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and β-1,3-glucanase (β-GASE). At the end, it was performed an evaluation of severity in the primary leaf of common bean, on the fifth day after inoculation. The in vivo test data were subjected to analysis of variance. The purification of samples from FTC and EXM of T. longibrachiatum, from IEC and GFC indicated fractions with the presence of eliciting molecules. The fractions F17, F23 and F25 from FTC and F27, F29, F31, F38 and F46 from EXM were able to induce phaseolin synthesis in common bean hypocotyls. The POX, PFO and β-GASE Increased when applied in the TL after application of the fractions and after inoculation of the pathogen. The fractions did not alter CAT and FAL enzymatic activity. The fractions F17, F23 and F27 reduced the anthracnose severity in the local effect. / O trabalho teve por objetivo purificar por cromatografia moléculas eliciadoras a partir de filtrado de cultura e extrato de micélio de Trichoderma longibrachiatum e testá-las na indução de fitoalexina faseolina e com potencial indutor de resistência contra antracnose no feijoeiro. O tampão fosfato de sódio 0,05 M (TAP) foi utilizado como tratamento controle e ASM (Acibenzolar-S-Metil) foi utilizado como tratamento padrão de indução. Cromatografia de troca iônica (CTI) e cromatografia de filtração em gel (CFG) foram realizadas para separar frações com poder eliciador a partir de filtrado de cultura (FTC) e extrato de micélio (EXM) de T. longibrachiatum. Para a purificação de eliciadores por CTI, a partir de FTC, foram obtidos uma fração glicídica e cinco glicoproteicas, total de seis frações. Para a purificação a partir de EXM, forma obtidos três frações proteicas, uma glicídica e duas glicoproteicas, total de seis frações, em ambos foi totalizado doze frações obtidas por CTI. Estas, por sua vez, foram purificadas em CFG, sendo obtidos um total de trinta e sete frações. Entre essas, quatorze frações para FTC, as mesmas foram classificadas de acordo com sua natureza, sendo três proteicas, duas glicídicas e nove glicoproteicas. E vinte e três frações para EXM, as mesmas foram classificadas com sua natureza, sendo quatro proteicas, nove glicídicas e dez glicoproteicas. Das frações purificadas na CFG a partir de FTC e EXM, oito apresentaram potencial indutor de faseolina (F17, F23, F25, F27, F31, F38 e F46. Os 10 tratamentos constituíram de oito frações e dois controles: ASM e controle (TAP). Foram aplicados os tratamentos em uma das folhas primária (folha tratada (FT)), sendo que outra folha primária não recebeu tratamento (folha não tratada (FNT)) para verificar o efeito sistêmico. Foram realizadas três coletas de folhas para determinação da atividade enzimática, antes da aplicação das frações, depois da aplicação das frações e coleta após a inoculação do patógeno. Foi realizada análise enzimática (peroxidase (POX), polifenoloxidase (PFO), catalase (CAT), fenilalanina amônia-liase (FAL) e β-1,3-glucanase (β-GASE)) e ao final, realizada avaliação de severidade no quinto dia após a inoculação da folha primária de feijoeiro. A purificação de amostras provenientes de FTC e EXM de T. longibrachiatum, por CTI e CFG indicaram frações com presença de moléculas eliciadoras. As frações F17, F23 e F25 de origem FTC e F27, F29, F31, F38 e F46 de origem EXM foram capazes de induzir a síntese de faseolina em hipocótilos de feijoeiro. A atividade de POX, PFO e β-GASE aumentou quando aplicado na FT após a aplicação das frações e após a inoculação do patógeno. As frações não alteraram a atividade enzimática de CAT e FAL. As frações F17, F23 e F27 reduziram a severidade da antracnose no efeito local.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:40:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane_Claudia_Meinerz.pdf: 1140657 bytes, checksum: 515f23cafb30196ea1e4641ed2debc7d (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Induced resistance involves the activation of latent defense mechanisms existing in plants in response to treatment with biotic or abiotic agents. The use of plant extracts in order to induce resistance mechanisms is an attractive alternative to chemical control, however, these extracts may occur the presence of inducer, as well ass the presence of suppressor. This study aimed to evaluate biochemical, physiological and growth of sorghum (Sorghum bicolor L.) treated with extracts of Rosmarinus officinalis, Curcuma longa and Pycnoporus sanguineus. It was evaluated the induction of phytoalexins deoxiantocianidinas, peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia lyase, β-1,3 glucanase and chitinase, carbon metabolism (photosynthesis and respiration) and growth of sorghum plants. Mesocotyls sorghum were treated with the fungal and plant extracts, and acibenzolar-S-methyl (ASM) (125 mg L-1 elicitor would like reference) and distilled water. Sorghum seedlings were treated with the inducers and at 24, 48, 96 and 144 hours samples were taken for analyzes of defense enzymes. Evaluations of gas exchange were conducted periodically over 7 days with three days interval of application of foliar treatments. Were determined rate of net CO2 assimilation (A, CO2 mol m-2s-1), stomatal conductance (gs mmol H2O m-2s-1), sweating (E, H2O mmol m-2s-1) efficiency Water use (U.S. mol m-2s-1) and intrinsic efficiency of the use of water (EIUA, mol m-2s-1). For growth analysis, carried out 120 days after sowing, the parameters evaluated were: fresh leaves and roots, dry weight of leaves and roots and root volume. The parameters for production analysis were the number of panicle, seed number, mean grain mass and total production. Biotic inducers rosemary, turmeric and Pycnoporus sanguineus induced phytoalexins in mesocotyls and biochemical activities in different cultivars of sorghum, may note that the results reveal an important target for the action of elicitors in these extracts. Overall, rosemary extract caused increase in peroxidase, polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase activities, the turmeric extract induced phenylalanine ammonia-lyase activity and the extract of P. sanguineus polyphenol oxidase and β-1,3 glucanase activities. ASM interfere with the metabolism of BRS 610 sorghum in relation to the efficiency of water use (U.S.) and intrinsic efficiency of water use (EIUA), without interfering with productivity, improving the quality of production and improving markedly the number of panicle, panicle, grain number and grain weight. The fungal and plant extracts did not affect these parameters. It was possible to induce defense mechanisms in sorghum by application of extracts of rosemary, turmeric and P. sanguineus, which may allow the obtention of new molecules, and the development of alternative methods for controlling plant diseases / A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos. A aplicação de extratos vegetais visando à indução de mecanismos de resistência é uma alternativa interessante ao controle químico, entretanto, nestes extratos pode ocorrer além da presença de indutores, a presença de supressores. Este trabalho teve por objetivo avaliar aspectos bioquímicos, fisiológico e de crescimento de sorgo (Sorghum bicolor L.) tratado com extratos de Rosmarinus officinalis, Curcuma longa e Pycnoporus sanguineus. Foram avaliados a indução de fitoalexinas deoxiantocianidinas, enzimas peroxidase, polifenoloxidase, fenilalanina amônia-liase, β-1,3 glucanase e quitinase, metabolismo de carbono (fotossíntese e respiração) e crescimento de plantas de sorgo. Mesocótilos de sorgo foram tratados com os extratos vegetais e fúngico, além de acibenzolar-S-metil (ASM) (125 mg L-1 do i.a. como elicitor de referência) e água destilada. Plântulas de sorgo foram tratadas com os indutores e às 24, 48, 96 e 144 horas foram retiradas amostras para as análises das enzimas de defesa. As avaliações de trocas gasosas foram realizadas periodicamente no período de 7 dias, com três dias de intervalo da aplicação dos tratamentos via foliar. Foram determinados: taxas de assimilação líquida de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática (gs, mmol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso de água (EUA, mol m-2s-1) e eficiência intrínseca do uso de água (EIUA, mol m-2s-1). Para análise de crescimento, realizada 120 dias após a semeadura, os parâmetros avaliados foram: massa fresca das folhas e raízes; massa seca das folhas e raízes e volume de raiz. Os parâmetros avaliados na análise de produção foram: número de panícula, número de sementes; massa média de grão e produção total. Os indutores bióticos alecrim, cúrcuma e Pycnoporus sanguineus induziram fitoalexinas em mesocótilos e atividades bioquímicas nas diferentes cultivares de sorgo, podendo ressaltar que os resultados revelam um importante alvo de ação de elicitores presentes nesses extratos. De forma geral, o extrato de alecrim causou incremento na atididade de peroxidase, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase; o extrato de cúrcuma induziu a atividade de fenilalanina amônia-liase e o extrato de P. sanguineus as atividades de polifenoloxidase e β-1,3 glucanase. O indutor ASM interferiu no metabolismo da cultivar BRS 610 de sorgo em relação à eficiência do uso da água (EUA) e eficiência intrínseca do uso da água (EIUA), sem interferir na produtividade, melhorando a qualidade da produção e melhorando acentuadamente o número de panícula, massa de panículas, número de grãos e massa de grãos. Os extratos vegetais e fúngico não interferiram nesses parâmetros. Foi possível induzir mecanismos de defesa em sorgo pela aplicação dos extratos de alecrim, cúrcuma e P. sanguineus, o que pode permitir a obtenção de novas moléculas e o desenvolvimento de métodos alternativos para controle de doenças em plantas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Phenolic compounds in plants have attracted considerable attention during the last decade due to their contribution to human health in reduce the risk of chronic diseases. The grape is one of the largest sources of these substances and like other plants, the synthesis of these compounds is usually associated with defense responses against stress factors, also called elicitors. More recently, ultrasound has been studied as possible abiotic elicitors of secondary metabolites due to mechanical stress and microstreaming induced by acoustic cavitation. Thus, this work aimed evaluate the application of different power densities (53 and 113 W cm-2) and exposure times (1, 5 and 10 minutes) to ultrasound in Isabel and Cabernet Sauvignon grapes about the effects on total polyphenols of juices made from this two cultivars. The samples were also subjected to the determination of total anthocyanins, tannins, total soluble solids, total acidity, pH and sensory evaluation. The Isabel cultivar showed more significant results in response to ultrasound, an increase of up to 83% in the levels of total polyphenols of juice, as well as significant increase in the content of total anthocyanins and tannins. These results were also accompanied by an increase in total soluble solids and total acidity of the juices. The application of ultrasound emphasized color, odor and taste of the Isabel grape juice, and the sonicated treatments were preferred by tasters. About Cabernet Sauvignon cultivar, it only showed a little variation in the most parameters. Power density and exposure time to ultrasound influenced the most of parameters evaluated in juices regarding to degree of response to sonication. Treatment with 5 and 10 min of exposure to ultrasound and power density of 113 W cm-2, is the combination that proved more effective for the elicitation of phenolic compounds by activation of plant secondary metabolism, improving the quality of the Isabel grape juice. / Compostos fenólicos em plantas têm atraído grande atenção durante a última década devido à sua contribuição para a saúde humana, podendo reduzir os riscos de doenças crônicas. A uva é uma das maiores fontes dessas substâncias e assim como os demais vegetais, tem a síntese desses compostos geralmente associada a respostas de defesa contra fatores de estresse, também chamados elicitores. Mais recentemente, o ultrassom vem sendo estudado como possível elicitor abiótico de metabólitos secundários devido a estresse mecânico e microagitação induzidos por cavitação acústica. Dessa forma, este trabalho foi conduzido com o intuito de avaliar a aplicação de diferentes densidades de potência (53 e 113 W cm-2) e tempos de exposição (1, 5 e 10 minutos) ao ultrassom em uvas Isabel e Cabernet Sauvignon quanto aos efeitos sobre os polifenóis totais dos sucos elaborados com as duas cultivares. As amostras também foram submetidas à determinação de antocianinas totais, taninos, sólidos solúveis totais, acidez total, pH e análise sensorial. A cultivar Isabel mostrou resultados mais significativos em resposta ao ultrassom, com elevação de até 83% nos níveis de polifenóis totais do suco, bem como, importante aumento no conteúdo de antocianinas totais e taninos. Estes resultados também foram acompanhados por um aumento nos sólidos solúveis totais e acidez total dos sucos. A aplicação do ultrassom acentuou cor, odor e sabor dos sucos de uvas Isabel, sendo os tratamentos sonicados os preferidos pelos provadores. Quanto a cultivar Cabernet Sauvignon, esta somente apresentou pequena variação na maioria dos parâmetros analisados. A densidade de potência e tempo de exposição ao ultrassom influenciaram a maioria dos parâmetros avaliados nos sucos quanto ao grau de resposta à sonicação. Tratamentos com 5 e 10 min de exposição ao ultrassom, com densidade de potência de 113 W cm-2 mostraram ser a combinação mais efetiva para a elicitação de compostos fenólicos mediante ativação do metabolismo secundário da planta, melhorando a qualidade dos sucos de uva Isabel.