Orientador: João Ruggiero Neto / Resumo: Os peptídeos sintéticos L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) e seu análogo acetilado (acL1A, Q = +2e) utilizados neste estudo foram projetados para que tenham características estruturais semelhantes ao peptídeo Polybia-MP1 extraído do veneno da vespa Polybia paulista, em que um dos dois resíduos ácidos ocupa a segunda posição na região Nterminal, e resíduos básicos são terceiros e/ou quartos vizinhos dos resíduos ácidos. Esses peptídeos possuem significativa atividade bactericida seletiva para bactérias Gram-negativas, especialmente Escherichia coli, sem serem hemolíticos. Estudos anteriores, em sistemas modelo, demonstraram que a acetilação do N-terminal resultou no aumento da atividade lítica em vesículas aniônicas (8POPC/2POPG) em comparação com o L1A, o que sugeriu perturbação do empacotamento lipídico de modo mais eficaz para o análogo que é menos carregado. Considerando que a membrana plasmática de bactérias Gram-negativas contém majoritariamente fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilglicerol (PG), o presente trabalho propôs investigar o impacto dos peptídeos L1A e acL1A em membranas modelo compostas por 3POPE/1DOPG utilizando uma variedade de técnicas experimentais. Os resultados demonstraram que ambos os peptídeos induziram segregação lipídica, sendo o análogo acetilado mais eficiente em recrutar PG e segregar PE. / Abstract: The synthetic peptides L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) and its acetylated analog (acL1A, Q = +2e) used in this study were designed to have some structural features similar to the peptide Polybia-MP1 extracted from the venom of the wasp Polybia paulista, in which one of the acidic residues occupies the second position on the N-terminus region and basic residues are third and/or fourth neighbors of the acidic residues. These peptides display significant bactericidal activity against Gram-negative bacteria, especially Escherichia coli, being non-hemolytic. Previous work performed in model membrane systems has shown that the N-terminal acetylation led to an increase on the lytic activity in anionic vesicles (8POPC/2POPG) compared with L1A, suggesting that the less charged peptide has higher ability to perturb the lipid-packing. Considering that the Gram-negative cell membranes contain mainly phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), the present work proposed to investigate the impact of L1A and acL1A on model membranes composed of 3POPE/1DOPG using a variety of experimental techniques. The results suggested that both peptides induced lipid segregation being the acetylated analog more efficient in recruiting PG and segregating PE. / Mestre

Membrane proteins are vital for cellular homeostasis. They maintain the electrochemical gradients that are essential for signaling and control the fine balance of trace elements. In order to fulfill these tasks, they need to undergo controlled conformational transitions within the lipid bilayer of a cell membrane. It is well-recognized that membrane protein structure and function depends on the lipid membrane. However, much less is known about the role of water re-partitioning at the protein–lipid interface and particularly within a membrane protein during functional transitions. Intra-membrane protein hydration is expected to be particularly important for ion transport processes, where the hydration shell of a solvated ion needs to be rearranged and partially removed in order to bind the ion within the transporter before it is re-solvated upon exiting the membrane protein. These processes are spatially and temporally organized in metal-transporting ATPases of the PIB-subtype of P-type ATPases. Here, the functional role of water entry into the transmembrane region of the copper-transporting PIB-type ATPase CopA from Legionella pneumophila (LpCopA) has been investigated. The recombinant protein was affinity-purified and functionally reconstituted into nanodiscs prepared with the extended scaffolding protein MSP1E3D1. Nanodiscs provide a planar native-like lipid bilayer in a water-soluble nanoparticle with advantageous optical properties for spectroscopy. The small polarity-sensitive fluorophore 6-bromoacetyl-2-dimethylaminonaphthalene (BADAN) was used as a probe for the molecular environment of the conserved copper-binding cysteine-proline-cysteine (CPC) motif which is located close to a wide “entry platform” for Cu+ to the transmembrane (TM) channel. The systematic study of proteins with mutated metal-binding motifs using steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy indicates that strong gradients of hydration and protein flexibility can exist across the narrow range of the CPC motif. The data suggest that Cu+ passes a “hydrophobic gate” at the more cytoplasmic C384 provided by rather stable TM helix packing before entering a more flexible and readily hydratable site in the interior of LpCopA around C382 where the polarity is strongly regulated by protein–lipid interactions. This flexibility could also be partly mediated by rearrangements of an adjacent amphipathic protein stretch that runs parallel to the membrane surface as a part of the cytoplasmic entry site. Using tryptophan fluorescence, circular dichroism, and Fourier-transform infrared absorption spectroscopy of a synthetic peptide derived from this segment, its lipid-dependent structural variability could be revealed. Depending on lipid-mediated helix packing interactions, the CPC motif has the potential to support a strong dielectric gradient with about ten units difference in permittivity across the CPC distance. This property may be crucial in establishing the directionality of ion transport by a non-symmetric re-solvation potential in the ion release channel of LpCopA. The experimental elucidation of these molecular details emphasizes not only the importance of intra-membrane protein water which has been hypothesized particularly for PIB-type ATPases. Moreover it is shown here, that the lateral pressure of a cell membrane may provide a force that restores a low hydration state from a transiently formed state of high internal water content at the distal side of the CPC motif. ATP-driven conformational changes that induce intra-membrane protein hydration of a conformational intermediate of the Post-Albers cycle could thus be set back efficiently by lateral pressure of the cell membrane at a later step of the cycle.

Um das Verhalten von Actiniden im Menschen (Stoffwechsel), in geologischen und in biologischen Systemen vorherzusagen, ist es erforderlich deren Speziation genau zu kennen. Zur Bestimmung dieser wird das chemische Verhalten des Urans hinsichtlich Komplexbildungsreaktionen und Redoxreaktionen in Modellsystemen untersucht. Anhand der gewonnenen thermodynamischen Konstanten und dem Redoxverhalten können Risikoabschätzungen für das jeweilige untersuchte System getroffen werden. Das umweltrelevante Uran(IV)-Uran(VI)-Redoxsystem besitzt mit der metastabilen fünfwertigen Oxidationsstufe einen zumeist kurzlebigen Zwischenzustand. Innerhalb dieser Arbeit gelang es erstmalig die Uran(V)-Fluoreszenz mittels laserspektroskopischer Methoden nach zu weisen. Beispielsweise konnte das Bandenmaximum von aquatischem Uranyl(V) im perchlorhaltigem Medium (λex = 255 nm) mit 440 nm, bei einer Fluoreszenzlebensdauer von 1,10 ± 0,02 µs bestimmt werden. Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung eines aquatischen [U(V)O2(CO3)3]5--Komplexes (λex= 255 nm und 408 nm) zeigte bei Raumtemperatur keine Fluoreszenz. Durch Anwendung der Tieftemperaturtechnik wurden bekannte Quencheffekte des Carbonats unterdrückt, so dass bei beiden Anregungswellenlängen ein für Uran(V) typisches Fluoreszenzspektrum im Bereich von 375 nm bis 450 nm, mit Bandenmaxima bei 401,5 nm (λex = 255 nm) und 413,0 nm (λex = 408 nm) detektiert werden konnte. Darüber hinaus konnte bei 153 K (λex = 255 nm) eine Fluoreszenzlebensdauer von 120 ± 0,1 µs bestimmt werden. Untersetzt wurden diese fluoreszenzspektroskopischen Nachweise durch mikroskopische Studien verschiedener Uran(IV)-Festphasen (Uraninit…UO2, Uran(IV) Tetrachlorid…UCl4) und einer sulfathaltigen Uran(IV)-Lösung (UIVSO4). Diese wurden durch kontinuierliche Sauerstoffzufuhr zu Uran(VI) oxidiert. Die ablaufende Oxidation wurde mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM) verfolgt, wobei die Proben mit einer Wellenlänge von 408 nm zur Fluoreszenz angeregt wurden. Die auftretenden Bandenmaxima bei 445,5 nm (UO2), bei 445,5 nm (UCl4) und bei 440,0 nm (UIVSO4) konnten eindeutig der Uran(V)-Fluoreszenz zugeordnet werden. Zur Bestimmung thermodynamischer Konstanten mit Hilfe der Tieftemperaturfluoreszenz wurde zunächst der Einfluss der Temperatur auf das Fluoreszenzverhalten des freien Uranyl(VI)-Ions näher betrachtet. Es zeigte sich, dass mit Erwärmung der Probe (T>298 K) die Fluoreszenzlebensdauer von 1,88 µs (298 K) deutlich absinkt. Die Fluoreszenzintensität verringerte sich dabei um 2,3 % pro 1 K zwischen 273 K und 313 K. Im Gegensatz dazu, steigt die Fluoreszenzlebensdauer um das 150-fache auf 257,9 µs bei einer Verminderung der Temperatur (T <298 K) auf 153 K. Das weitere Absenken der Temperatur (T <153 K) zeigte keinen Einfluss auf die Fluoreszenzlebensdauer. Die Lage der Hauptemissionsbanden des freien Uranyl(VI)-Ions (488,0 nm, 509,4 nm, 532,4 nm, 558,0 nm, 586,0 nm) zeigte bei diesen Untersuchungen keine temperaturabhängige Verschiebung. Die Validierung der Tieftemperaturtechnik zur Bestimmung thermodynamischer Konstanten mittels zeitaufgelöster laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie erfolgte anhand des Uran(VI)-Citrat-Systems. Im Gegensatz zu bisherigen fluoreszenzspektroskopischen Betrachtungen bei Raumtemperatur wurde das Fluoreszenzsignal bei tiefen Temperaturen mit einsetzender Komplexierung nicht gequencht, woraus die Ausprägung einer gut interpretierbaren Fluoreszenz resultierte. Die Analyse der spektralen Daten mit SPECFIT ergaben mit log β101 = 7,24 ± 0,16 für den [UO2(Cit)]--Komplex und log β202 = 18,90 ± 0,26 für den [(UO2)2(Cit)2]2 -Komplex exakt die in der Literatur angegebenen Stabilitätskonstanten. Zudem konnten Einzelkomponentenspektren mit Bandenmaxima bei 475,3 nm, 591,8 nm, 513,5 nm, 537,0 nm und 561,9 nm für den 1:0:1-Komplex und 483,6 nm, 502,7 nm, 524,5 nm, 548,1 nm und 574,0 nm für den 2:0:2-Komplex und Fluoreszenzlebensdauern von 79 ± 15 µs (1:0:1) und 10 ± 3 µs (2:0:2) bestimmt werden. Zur Modellkomplexierung des Uran-Citrat-Systems wurde in dieser Arbeit auch das Komplexbildungsverhalten von U(IV) in Gegenwart von Citronensäure untersucht. Hierbei wurden über den gesamten pH-Wertbereich gelöste Uran-Citrat-Spezies spektroskopisch nachgewiesen und die Stabilitätskonstanten sowie die Einzelkomponentenspektren für die neu gebildeten Uran(IV) und (VI)-Spezies bestimmt. Für die neu gebildeten Citrat-Komplexe des sechswertigen Urans wurden Komplexbildungskonstanten von log β203 = 22,67 ± 0,34 ([(UO2)2(Cit)3]5-) und log β103 = 12,35 ± 0,22 ([UO2(Cit)3]7-) und für die Komplexe des vierwertigen Urans von log β1-21 = -9,74 ± 0,23 ([U(OH)2Cit]-) und log β1 31 = -20,36 ± 0,22 ([U(OH)3Cit]2-) bestimmt. Untersuchungen zum Redoxverhalten von Uran in Gegenwart von Citronensäure zeigten unter aeroben und anaeroben Versuchsbedingungen eine photochemische Reduktion vom U(VI) zu U(IV), welche spektroskopisch nachgewiesen werden konnte. Dabei zeigt speziell die Reaktion unter oxidierenden Bedingungen, welchen großen Einfluss vor allem organischen Liganden auf das chemische Verhalten des Urans haben können. Sowohl die Reduktion unter O2- als auch die unter N2-Atmosphäre, weisen ein Maximum bei einem pH Wert von 3,5 bis 4 auf. Unter anaeroben Bedingungen reduziert die Citronensäure mit ca. 66 %, 14 % mehr Uran(VI) zu Uran(IV) als unter anaeroben Bedingungen mit ca. 52 %. Ab einem pH-Wert von 7 konnte eine Reduktion nur unter sauerstofffreien Bedingungen festgestellt werden. Die Wechselwirkung von U(VI) in Gegenwart von Glucose wurde hinsichtlich Reduktion und Komplexierung des Uran(VI) betrachtet. Mit Hilfe der zeitaufgelösten laserinduzierten Fluoreszenzspektroskopie bei tiefen Temperaturen wurde dabei ein Uranyl(VI)-Glucose-Komplex nachgewiesen. Die Komplexierung wurde lediglich bei pH 5 beobachtet und weist eine Komplexbildungskonstante von log βI=0,1 M = 15,25 ± 0,96 für den [UO2(C6H12O6)]2+-Komplex auf. Mit einer Fluoreszenzlebensdauer von 20,9 ± 2,9 µs und den Hauptemissionsbanden bei 499,0nm, 512,1 nm, 525,2 nm, 541,7 nm und 559,3 nm konnte der Uranyl(VI)-Glucose-Komplex fluoreszenzspektroskopisch charakterisiert werden. Unter reduzierenden Bedingungen wurde, ab pH-Wert 4 eine auftretende Umwandlung vom sechswertigen zum vierwertigen Uran durch Glucose in Gegenwart von Licht beobachtet. Der Anteil an gebildetem Uran(IV) steigt asymptotischen bis zu einem pH-Wert von 9, wo das Maximum mit 16 % bestimmt wurde. Als Reaktionsprodukt der Redoxreaktion wurde eine Uran(VI)-Uran(IV)-Mischphase mit der Summenformel [UIV(UVIO2)5(OH)2]12+ identifiziert. Mit Hilfe der cryo-TRLFS wurde, durch Verminderung von Quencheffekten die Uranspeziation in natürlichen Medien (Urin, Mineralwasser) direkt bestimmt. Proben mit Uran Konzentrationen von < 0,1 µg/L konnten dadurch analysiert werden. In handelsüblichen Mineralwässern wurde die zu erwartende Komplexierung durch Carbonat nachgewiesen. Im Urin zeigte sich in Abhängigkeit vom pH-Wert eine unterschiedliche Uranspeziation. Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung wies bei niedrigerem pH Wert (pH<6) eine Mischung aus Citrat- und Phosphat-Komplexierung des U(VI) und bei höheren pH-Wert (pH>6) eine deutliche Beteilung von Carbonat an der Komplexierung auf. Diese Ergebnisse stehen in sehr guter Übereinstimmung mit theoretischen Modellrechnungen zur Uranspeziation im Urin. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass für eine zuverlässigere Prognose des Urantransportes in Geo- und Biosphäre in Zukunft nicht nur Betrachtungen zur Komplexchemie, sondern auch zum Redoxverhalten des Urans nötig sind, um die Mobilität in der Natur richtig abschätzen zu können.:I. Zusammenfassung XI II. Summary XV III. Danksagung XIX 1. Motivation und Zielstellung 1 2. Grundlagen 2 2.1. Zur Chemie des Urans 2 2.1.1. Uran im aquatischen System 2 2.1.2. Redoxchemie des Urans 7 2.2. Citronensäure 10 2.3. Glucose 16 2.4. Komplexbildungskonstanten 22 3. Spektroskopie 28 3.1. Spektroskopie des Urans 30 3.1.1. UV/VIS-Spektroskopie 30 3.1.2. Zeitaufgelöste laserinduzierte Fluoreszenzspektroskopie 32 3.1.3. Infrarot-Spektroskopie 36 3.1.4. Spektroskopie bei tiefen Temperaturen 38 3.2. Spektroskopie organischer Verbindungen 40 4. Ergebnisse und Diskussion 43 4.1. Zur Fluoreszenz des Urans 43 4.1.1. Uran(V)-Fluoreszenz 43 4.1.1.1. Nachweis der Uran(V)-Fluoreszenz 43 4.1.1.2. Mikroskopische Visualisierung der Uran(V)-Fluoreszenz 47 4.1.1.3. Verifizierung der Anregungswellenlänge 408 nm 50 4.1.2. Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenz des freien Uranyl(VI)-Ions 52 4.2. Wechselwirkung von Uran mit Citronensäure 54 4.2.1. Uran(VI)-Komplexierung durch Citronensäure 54 4.2.1.1. Photochemische Stabilität 54 4.2.1.2. Spektroskopische Untersuchung zur Uran(VI) Komplexierung durch Citronensäure 55 4.2.1.3. Bestimmung der Komplexbildungskonstanten 63 4.2.2. Uran(IV)-Komplexierung mit Citronensäure 68 4.2.2.1. Spektroskopische Untersuchung zur Uran(IV) Komplexierung durch Citronensäure 68 4.2.2.2. Bestimmung der Komplexbildungskonstanten zwischen Uran(IV) und Citronensäure 69 4.2.3. Uran(VI)-Reduktion durch Citronensäure 72 4.3. Wechselwirkung von Uran mit Glucose 79 4.3.1. Komplexierung von Uran(VI) mit Glucose 79 4.3.1.1. Photochemische Stabilität 79 4.3.1.2. pH-Abhängigkeit der Komplexierung 82 4.3.1.3. Bestimmung der Komplexbildungskonstante 89 4.3.2. Reduktion von Uran(VI) durch Glucose 92 4.3.2.1. pH-Abhängigkeit 92 4.3.2.2. Identifizierung der Reaktionsprodukte der Redoxreaktion 94 4.3.2.3. Reduktion durch verschiedene Zuckerderivate 97 4.3.2.4. Reduktion im gepufferten System 99 4.4. Zur Bestimmung der Uranspeziation in natürlichen Proben 101 5. Anwendung der Erkenntnisse auf die zukünftige Betrachtung uranhaltiger Umweltsysteme 108 5.1. Komplexbildungsreaktionen 108 5.2. Redoxreaktionen 112 6. Experimenteller Teil 115 6.1. Chemikalien 115 6.2. Bestimmung der molaren Extinktionskoeffizienten von Uran(IV) 116 6.3. Uran(V)-Fluoreszenz 119 6.4. Temperaturabhängigkeit der Uranyl(VI)-Fluoreszenz 120 6.5. Stabilität citronensäurehaltigen Uranyl(VI)-Lösungen 120 6.6. Komplexierung zwischen Uran(VI) und Citronensäure 121 6.7. Komplexierung zwischen Uran(IV) und Citronensäure 122 6.8. Reduktion von Uran(VI) durch Citronensäure 122 6.9. Stabilität glucosehaltigen Uranyl(VI)-Lösungen 122 6.10. Komplexierung zwischen Uran(VI) und Glucose 123 6.11. Reduktion von Uran(VI) durch Glucose 124 6.12. Uran in natürlichen Proben 125 7. Geräte 127 7.1. Lasersysteme 127 7.2. UV/VIS-System 129 7.3. IR-Systeme 129 7.4. Neonlicht 131 7.5. Elementaranalysen 131 7.6. pH-Wert-Messung 132 7.7. Experimente unter Inertgas 132 7.8. Proben schütteln 132 7.9. Probenzentrifugation 132 8. Literaturverzeichnis 133 9. Abkürzungen und Symbole 147 10. In Verbindung mit dieser Arbeit entstandene Publikationen 151

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The exact role of opioid receptors in drug addiction and modulatory mechanism of action of monovalent cations on these receptors are still not fully understood. Our results support the view that the mechanism of addiction to morphine is primarily based on desensitization of μ- and δ-opioid receptors. Desenzitization of agonist response proceeds already at the level of G protein functional activity. Long-term exposure of rats to morphine resulted in increase of number of δ-opioid receptors and change of their sensitivity to sodium ions. Analysis of the effect of different monovalent ions on agonist binding in δ-OR- Gi1α (Cys351 -Ile351 )-HEK293 cell line confirmed the preferential sensitivity of δ-opioid receptor to sodium ions. We have distinguished the high- and low-affinity Na+ sites. Biophysical analysis of interaction of lithium, sodium, potassium and cesium ions with plasma membranes isolated from HEK293 cells with the help of fluorescent probes indicated that monovalent ions interact, in low-affinity manner, with the polar, membrane-water interface of membrane bilayer. Key words: morphine, forebrain cortex, opioid receptors, G proteins, monovalent ions, plasma membrane, fluorescence spectroscopy.

The exact role of opioid receptors in drug addiction and modulatory mechanism of action of monovalent cations on these receptors are still not fully understood. Our results support the view that the mechanism of addiction to morphine is primarily based on desensitization of μ- and δ-opioid receptors. Desenzitization of agonist response proceeds already at the level of G protein functional activity. Long-term exposure of rats to morphine resulted in increase of number of δ-opioid receptors and change of their sensitivity to sodium ions. Analysis of the effect of different monovalent ions on agonist binding in δ-OR- Gi1α (Cys351 -Ile351 )-HEK293 cell line confirmed the preferential sensitivity of δ-opioid receptor to sodium ions. We have distinguished the high- and low-affinity Na+ sites. Biophysical analysis of interaction of lithium, sodium, potassium and cesium ions with plasma membranes isolated from HEK293 cells with the help of fluorescent probes indicated that monovalent ions interact, in low-affinity manner, with the polar, membrane-water interface of membrane bilayer. Key words: morphine, forebrain cortex, opioid receptors, G proteins, monovalent ions, plasma membrane, fluorescence spectroscopy.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Protein-protein interactions play a crucial role in a wide range of biological processes. Research on the design and synthesis of small molecules to modulate these proteinprotein interactions can lead to new targets and drugs to modulate their function. In Chapter one, we discuss the design and synthesis of small molecules to probe a proteinprotein interaction in a voltage-gated Ca2+ channel. Virtual screening identified a compound (BTT-3) that contained a 3,4-dihydro-3,4’-pyrazole core. This compound had modest biological activity when tested in a fluorescence polarization (FP) assay. The synthetic route to BTT-3 consisted of six steps. In addition, analogs of BTT-3 were made for a structure-activity study to establish the importance of a carboxylate moiety. We also synthesized a biotinylated benzophenone photo-affinity probe and linked it to BTT-3 to identify additional protein targets of the compound. In Chapter two, small-molecule antagonists targeting uPA-uPAR protein-protein interaction are presented. A total of 500 commercially-available compounds were previously identified by virtual screening and tested by a FP assay. Three classes of compounds were found with biological activity. The first class of compounds contains pyrrolidone core structures represented by IPR- 1110, the second class has a novel pyrrolo[3,4-c]pyrazole ring system, represented by xv IPR-1283 and the last series had compounds with a 1,2-disubstituted 1,2- dihydropyrrolo[3,4-b]indol-3(4H)-one core structure, represented by IPR-540. Each of these three compounds were synthesized and assessed by FP and ELISA assays. A binding mode of IPR-1110 with uPA was subsequently proposed. Based on this binding mode, another 61 IPR-1110 derivatives were synthesized by us to illustrate the SAR activity. Analogs of the other two series were also synthesized.

In this diploma thesis, the interactions between polyelectrolyte and surfactant at low and also at high concentration were studied. There was used pyrene as fluorescent probe during the fluorescence spectroscopy measurement, a cationic surfactant cetyltrimethylammonium bromide and as a main polyelectolyte has been chosen sodium polystyrene sulfonate at 1 MDa molecular size. In the medium containing 0.15 M NaCl we could observed a creation of the complexes – precipitates in the surrounding of CMC concentration and behind of this concentration. In the mixtures containing sodium polystyrene sulfonate and hyaluronan together, there was stronger tend to keep aggregation properties of sodium polystyrene sulfonate during difference concentration ratios. Beyond CMC concentration, hyaluronan starts to influence the aggregation properties of the system as well.

Fyzikálně-chemická povaha hydrofobních domén huminových kyselin byla studována z několika hledisek. K objasnění významu fluorescenčních spekter byly vzorky podrobeny sekvenční frakcionaci, která pomohla k částečnému objasnění vlivu vodorozpustných složek, volných a vázaných lipidů na optické vlastnosti huminových kyselin. Výsledky naznačily, že fluorescenční píky tradičně přiřazované superpozici jednotlivých struktur jsou spíše důsledkem agregačních vlastností huminových molekul tvořících vlivem hydrofobního efektu zdánlivě vysoce aromatické struktury. Dále pak bylo zjištěno, že na optických vlastnostech huminových kyselin mají podíl i molekuly, které nemají primárně fluoroforní nebo chromoforní vlastnosti. Tento pohled je v souladu s teorií supramolekulárního uspořádání huminových kyselin. Dále byly studovány agregace, konformační chování a termodynamická stabilita huminových kyselin pomocí metody vysoce rozlišovací ultrazvukové spektroskopie. Bylo prokázáno, že huminové kyseliny mají schopnost agregovat už od velmi nízkých koncentrací (

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