La carence en donneurs de méthyle (acide folique et vitamine B12) (MDD) pendant la gestation et la lactation produit une stéato-hépatite non alcoolique (NASH) chez les animaux soumis au régime riche en graisses (HE) pendant l'âge adulte, en dépit d’une normalisation histologique et métabolique par un régime normal entre le sevrage (J21) et l’âge de puberté (J50). Le microbiote peut déclencher l'inflammation par les lipopolysaccharides (LPS) par inadaptation de l’activation de récepteur Toll-like 4(TLR4). Notre hypothèse de base est que le régime MDD, le régime HE, les LPS du microbiote et l’inflammation intestinale (modèle Dextran Sodium Sulfate (DSS) comme déclencheurs et l'immunité innée en tant que modulateur font partie d’un même scénario conduisant à la NASH. Des rats carencés (MDD), soumis ou non au régime riche en graisse à l’âge adulte (HE) et exposés ou non à deux inducteurs de l’inflammation locale et systémique, le DSS (inflammation intestinale) et les LPS (effets systémiques de l’inflammation intestinale) ont été étudiés. Nous n’observons pas d’altération de l’immunité innée (TLR4) dans les groupes MDD/DSS, MDD/HE et MDD/HE/LPS. L’inflammation observée au niveau intestinal chez les rats MDD/DSS est également observée au niveau hépatique, avec de stéatose et activation de l’inflammasome et de la chimiokine MCP-1 et IL-1beta. De façon surprenante, cet effet systémique ne met pas en jeu la voie TLR4 et son ligand LPS même quand les rats étaient exposés au LPS directement au niveau péritonéal.Notre étude permet de conclure que la NASH favorisée par les effets systémiques de l’inflammation intestinale est médiée par MCP-1/IL-1β, mais pas par l'activation de TLR4 par translocation de LPS. L’immunité innée n’ étant pas impliquée même par l’injection directe du LPS, les effets respectifs et synergiques de régime MDD, du régime HE et du LPS restent à décrypter par la suite. / Deficiency of methyl donors (folic acid and vitamin B12) (MDD) during pregnancy and lactation produces non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in animals fed high fat (HE) diet, despite histological and metabolic normalization by a normal diet between weaning (J21) and puberty (J50). The microbiota can trigger inflammation by lipopolysaccharides (LPS) by inadaptation of Toll-like receptor activation 4 (TLR4). Our basic assumption is that MDD, HE diet, microbiota LPS and intestinal inflammation (Dextran Sodium Sulfate (DSS) model) as triggers and innate immunity as a modulator are part of the same scenario leading to NASH. Deficient rats (MDD), whether or not exposed to the high-fat diet in adulthood (HE) and whether or not exposed to two inducers of local and systemic inflammation, DSS (intestinal inflammation) or LPS (systemic effects intestinal inflammation) were studied. We did not observe alterations in innate immunity (TLR4) in the MDD/DSS, MDD/HE and MDD/HE/LPS groups. Inflammation observed in the intestines in MDD/DSS rats is also observed in the liver, with steatosis and activation of the inflammasome and chemokine MCP-1 and IL-1beta. Surprisingly, this systemic effect does not involve the TLR4 pathway and its ligand LPS even when the rats were exposed to LPS directly at the peritoneal level. Our study conclude that NASH favored by the systemic effects of Intestinal inflammation is mediated by MCP-1/IL-1β, but not by activation of TLR4 by translocation of LPS. Since innate immunity is not involved even by the direct injection of LPS, the respective and synergistic effects of MDD diet, HE diet and LPS remain to be decribed thereafter.

Les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE) interagissent au niveau de points de contacts appelés « Mitochondria-Associated ER Membranes » (MAM), afin d'échanger du Ca2+ via le complexe TP3Rl/Grp75/VDACl et maintenir l'homéostasie énergétique. Bien que des dysfonctions mitochondriales, un stress du RE et des altérations de l'homéostasie du Ca2+ participent au développement de l'insulino-résistance, on ne sait pas si ce sont des facteurs indépendants ou s'ils sont inter-reliés par une altération des MAM. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un nouveau rôle des MAM dans l'insulino-résistance hépatique. J'ai mis au point et validé la technique d'in situ PLA pour visualiser et quantifier les interactions mitochondrie-RE dans les cellules. J'ai montré que l'intégrité des MAM était nécessaire pour la signalisation de l'insuline dans le foie, et qu'un défaut d'intégrité des MAM était impliqué dans l'insulino-résistance hépatique. Des données préliminaires suggèrent qu'une altération des MAM est également associée à l'insulino-résistance musculaire. J'ai ensuite mis en évidence la présence de la protéine kinase B, une protéine clé de la signalisation de l'insuline, dans les MAM, et démontré que sa phosphorylation par l'insuline est altérée dans cette fraction dans le foie de souris diabétique. Enfin, j'ai participé à la mise en évidence l) de la présence de la cyclophilin D à l'interface des MAM régulant les échanges calciques entre les deux organites dans les cardiomyocytes et les hépatocytes, et 2) d'une régulation des MAM par le glucose dans le foie qui permet un contrôle de la dynamique et de la fonction mitochondriale au cours des transitions nutritionnelles. Par conséquent, mes travaux ont permis d'améliorer les connaissances actuelles sur les partenaires, la fonction et la régulation des MAM et de dévoiler les MAM comme une nouvelle cible pour moduler la signalisation de l'insuline et le métabolisme hépatique / Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes (MAM) are functional domains between both organelles involved in Ca2+ exchange, through the voltage-dependent anion channel (VDAC)-1/glucose regulated protein 75 (Grp75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (TP3R)-1 complex, and regulating energy metabolism. Whereas mitochondrial dysfunction, ER stress, and altered Ca2+ homeostasis are associated with altered insulin signalling, the implication of MAM dysfunctions in insulin resistance is unknown. During my PhD, my work has underlined a new role of MAM in hepatic insulin- resistance. T have developed a quantitative method called in situ Proximity Ligation Assay to visualise and quantify the interactions between ER and mitochondria. T have shown that MAM integrity is required for insulin signalling and that disruption of MAM is implicated in hepatic insulin resistance. Preliminary data also suggest that MAM alterations are also associated with muscle insulin resistance. T have also identified the presence of the protein kinase B (PKB), a key protein involved in metabolic effects of insulin, at the MAM interface, and demonstrated that its phosphorylation by insulin is altered in this fraction in liver of diabetic mice. Lastly, T have also participated to the identification of: 1) the presence of cyclophilin D (CypD) at MAM interface which regulates calcium transfer from ER to mitochondria in both cardiomyocytes and hepatocytes, and 2) a regulation of MAM by glucose in liver, which is involved in the regulation of mitochondria dynamics and function during nutritional transitions. Consequently, my work improved the knowledge on the composition, function and regulation of MAM, and highlighted MAM as a potential new target for the modulation of hepatic insulin action and metabolism

L’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC) a indiqué que le travail posté qui provoquait une disruption circadienne était probablement cancérogène chez l’Homme. Ainsi, une perturbation expérimentale sévère du système circadien accélère-t elle la progression tumorale et pourrait favoriser la cancérogénèse. Durant ma thèse, j’ai démontré que la disruption circadienne résultant d’une mutation ou d’une mise au silence des gènes de l’horloge Per ou Cry accélérait la cancérogénèse hépatique induite par la diéthylnitrosamine, en favorisant l’instabilité génomique, la prolifération cellulaire, et l’inflammation. J’ai montré que l’alimentation programmée ou la dexaméthasone modifiaient la régulation circadienne de ces trois caractéristiques du cancer, suggérant ainsi qu’une intervention thérapeutique ciblant le système circadien pourrait prévenir la cancérogénèse. J’ai ainsi mis en évidence le contrôle circadien de trois mécanismes moléculaires de la cancérogenèse précoce et proposé deux interventions ciblant l’horloge circadienne dans un but de prévention de la cancérogenèse. / The International Agency for Research on Cancer (IARC) concluded that “shift-work that involves circadian disruption is probably carcinogenic to humans”. Severe disruption alteration accelerated tumor progression and enhanced carcinogenesis. During my PhD, I demonstrated that circadian disruption resulting from mutation of Per and Cry clock genes accelerated liver carcinogenesis induced by diethylnitrosamine through promoting genomic instability, cellular proliferation, and inflammation. I showed that meal timing or dexamethasone altered circadian regulation of these three characteristics of cancer, suggesting a therapeutic intervention targeting the circadian system could prevent carcinogenesis. I have thus demonstrated the circadian control of three molecular mechanisms of early carcinogenesis and proposed two interventions targeting the circadian clock for liver carcinogenesis prevention.

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Les formes sévères de l’infection par les virus de la fièvre jaune (YFV) et de la dengue (DENV) sont caractérisées par une atteinte du foie, plus sévère lors d’une infection YFV. L’objectif de cette thèse est de comparer les infections de YFV et DENV dans un modèle d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches (iHeps) afin d’identifier des facteurs à l’origine de cette différence de pathogenèse. Dans un premier temps, nous avons comparé le tropisme de YFV aux 4 sérotypes de DENV dans notre modèle hépatique établi en monocouche cellulaire. Nous avons observé une faible propagation de DENV dans les iHeps par rapport YFV. Les mêmes observations ont été faites dans des hépatocytes primaires. L’utilisation de souches chimériques 17D/DENV a permis de mettre en évidence que cette faible propagation serait liée à une faible efficacité d’entrée de DENV dans les hépatocytes. Nous avons également étudié l’infection dans des sphéroïdes iHeps, métaboliquement plus actifs que les iHeps 2D. Une infection productive a été observée uniquement avec YFV. Ce résultat pourrait s’expliquer par la faible accessibilité des cellules à l’intérieur des sphéroïdes. Dans un 2ème temps, nous avons étudié les réponses cellulaires induites dans les iHeps 2D après infection par les différents virus en utilisant une approche RNAseq. Les résultats préliminaires suggèrent un lien entre le taux de réplication et le nombre de gènes activés. La réponse interféron est plus précocement détectée dans le cas de YFV, mais l’infection par DENV induit un plus grand nombre de gènes. De plus, DENV-1 et DENV-4 induisent une augmentation d’expression de certains gènes impliqués dans la présentation d’antigène comme HLA-E et TAP-2, alors que YFV diminue l’expression de certains gènes de chimiokines et molécules d’adhésion. L’analyse préliminaire des voies liées au métabolisme hépatique révèle une inhibition de la voie de la coagulation dans le cas de l’infection par YFV, qui n’est pas observée lors de l’infection par DENV. Des observations similaires ont été décrites in vivo, au niveau protéique, confirmant la pertinence du modèle iHeps / Severe forms of infection with yellow fever virus (YFV) and dengue virus (DENV) are characterized by liver damage, with more severe symptoms observed during YFV infection. The aim of this thesis is to compare YFV and DENV infections in a model of human hepatocytes derived from stem cells (iHeps) in order to identify factors that could explain their difference in pathogenesis.First, we compared YFV tropism to the four DENV serotypes in 2D iHeps. We observed a low spread of DENV compared to YFV in both iHeps and primary hepatocytes. By using chimeric 17D/DENV strains, we demonstrate that this low propagation is linked to a low DENV entry efficiency in hepatocytes. We also studied infection in iHeps spheroids, metabolically closer to primary cells than 2D iHeps. A productive infection was observed with YFV only. The low accessibility of cells inside the spheroids could explained this result. Second, we studied cellular responses induced following infection by different viruses in 2D iHeps using an RNAseq approach. Preliminary results suggest a link between replication rate and the number of activated genes. The interferon response is detected earlier following YFV infection, but DENV induces a greater number of genes implicated in this pathway. Moreover, DENV-1 and DENV-4 up-regulate some genes involved in antigen presentation such as HLA-E and TAP-2, while YFV down-regulates genes encoding chemokines and adhesion molecules. Preliminary analysis of hepatic metabolism pathways reveals inhibition of the coagulation pathway induced by YFV infection, which is not observed during DENV infection. Similar observations have been described in vivo, at the protein level, confirming the relevance of the iHeps model

Les fibroses anormales sont responsables de plus de 40% des décès pour raison médicale ; elles se développent suite à une inflammation chronique. Les fibroses hépatiques causées par les schistosomes et par le virus HCV sont en grande partie déterminées par la génétique du malade. Notre thèse a consisté à poursuivre le travail de caractérisation du déterminisme génétique des fibroses hépatiques et cutanées.La première partie de notre thèse, est l’étude informatique et statistique des données de génotypage GWAS de Brésiliens qui présentent une fibrose hépatique bilharzienne grave sur plus de 2,5 millions de SNPs. 180 SNPs qui montraient une association suggestive avec les fibroses graves ont été sélectionnés, dont certains affectent les gènes des voies Wnt. Ces SNPs ont été testés sur une cohorte de 460 pêcheurs ougandais exposés à S.mansoni et nous avons confirmé l’association avec la fibrose de 4 SNPs.La deuxième partie de notre thèse est l’analyse transcriptômique (RNA-Seq) des mécanismes responsables des fibroses anormales de la peau de sujets affectés par des fibroses chéloïdes de 20 tissus chéloïdes, 7 tissus sains et 7 tissus affectés par des cicatrices hypertrophiques. Cette analyse montre que le développement des chéloïdes est la conséquence d’une stimulation anormale des voies de la cicatrisation en partie due à l’activation de la voie Wnt βcatenin et Wnt PCP. Pour conforter cette proposition, nous avons effectué une analyse génétique de la voie Wnt dans deux cohortes indépendantes. L’analyse statistique montre que des SNPs dans 6 gènes de la voie Wnt βcatenin contribuent au développement des fibroses chéloïdes. / Abnormal fibrosis is responsible for more than 40% of medical deaths. They develop as a result of chronicinflammation. Hepatic fibroses caused by schistosomes andHCV virus are largely determined by the genetic background of the patient. Our thesis consisted of continuing thework of characterizing the genetic determinism of liver and skin fibrosis.The first part of our thesis is the computer and statistical study of GWAS genotyping data of Brazilians whohave severe bilharzeal liver fibrosis on more than 2.5 million SNPs. 180 SNPs that showed suggestive associationwith severe fibrosis were selected, some of which affect the Wnt pathway. These SNPs were then tested on a cohortof 460 Ugandan fishers exposed to S.mansoni and the results confirmed the association of 4 SNPs with fibrosis.The second part of our thesis is the genomic analysis (transcriptome and genetics) of the mechanismsresponsible for the abnormal skin fibrosis with subjects affected by keloid scars. We performed an analysis of genes(RNASeq) expressed differently between 20 keloids, 7 healthy tissues and 7 tissues affected by hypertrophic scars.This analysis shows that the development of keloids is the consequence of an abnormal stimulation of cicatrizationpathways with strong activation of the Wnt βcatenin and Wnt PCP pathway. To support this proposal, we performeda genetic analysis of the Wnt pathway in two independant cohorts.The statistical analysis of the results shows that polymorphisms in 6 genes of the Wnt βcatenin pathway contributeto the development of keloid fibrosis.

Le foie est un organe qui exerce un rôle majeur dans le contrôle de l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme en maintenant la glycémie à un taux constant. LKB1 est une sérine-thréonine kinase qui joue un rôle clef dans la physiologie cellulaire en couplant le contrôle du métabolisme au statut énergétique de la cellule. A l’aide de modèles murins ayant une délétion de LKB1 dans les hépatocytes adultes, nous avons identifié un rôle complexe pour LKB1 au sein de l’homéostasie énergétique. L’objectif de ma thèse était de caractériser ce phénotype et d’en comprendre les bases physiologiques. Nos résultats montrent une hyperglycémie à jeun chez les animaux mutants, associée à une perte de masse maigre (muscle), une accumulation du glycogène à jeun et une activation constitutive de la voie de l’insuline, qui, à long terme, conduit à une cachexie. Nos résultats suggèrent que Lkb1 hépatique exercerait un dialogue complexe avec la signalisation insuline dans le contrôle de la gluconéogenèse avec une dépendance énergétique aux acides aminés. Nous avons aussi montré qu’il existait un dialogue complexe entre LKB1 et la voie Wnt/β-caténine dans le foie. En effet, les carcinomes hépatocellulaires (CHC) mutés CTNNB1 ont des caractéristiques phénotypiques en termes de polarité et de métabolisme (absence de stéatose). Nous avons émis l’hypothèse que ce phénotype pouvait être secondaire à l’activation du gène suppresseur de tumeurs LKB1. Les mutations CTNNB1 sont en effet capable d’induire l’expression protéique de LKB1 dans les lignées hépatomateuses humaines, et les CHC mutés CTNNB1 présentent une expression protéique accrue de LKB1. De plus, dans deux modèles murins d’invalidation hépatospécifique de Lkb1, LKB1 est apparu comme requis pour l’activation du programme transcriptionnel de β-caténine mais de façon dépendante du stade de développement et du contexte nutritionnel. / The liver plays a major role in the control of both metabolic and energetic homeostasis in the body by maintaining glycemia. LKB1 is a serine-threonine kinase that plays a crucial role in cell physiology by controlling cell metabolism and cell energetic status. Using murine model with LKB1 hepatospecific deletion, we identified a complex role for LKB1 in energy homeostasis. The aim of my thesis was to characterize this phenotype and to understand its physiological basis. Our results show a hyperglycemia at fasted state in mutants animals, associated with a loss of dry mass, a glycogen accumulation and a constitutive activation of insulin signaling, which leads to a cachexia at long term. Our results suggest that hepatic Lkb1 is involved in a cross talk with insulin signaling in the control of neoglucogenesis with amino acid dependence. We also showed a cross talk between LKB1 and Wnt/β-catenin signaling in the liver. Indeed, CTNNB1-mutated hepatocellular carcinoma (HCC) have phenotypic features in terms of polarity and metabolism (lack of lipid accumulation). Our hypothesis is that this phenotype would be secondary to the activation of the tumour suppressor gene LKB1. CTNNB1 mutations induce LKB1 proteic expression in human hepatoma cell lines and CTNNB1-mutated HCC show an increased proteic LKB1 expression. In two murine models of Lkb1 hepatospecific invalidation, LKB1 seems to be necessary for the activation of the β-catenin transcriptional program in a way that is dependent on developpemental state and nutritional context.

Cette thèse porte sur la segmentation des tumeurs du foie sur des images tomodensitométriques. Ce sujet présente un intérêt certain pour le domaine médical puisque les médecins pourraient ainsi bénéficier d'une méthode reproductible et fiable pour segmenter de telles lésions. Une segmentation précise des tumeurs du foie permettrait en effet d'aider les médecins lors de l'évaluation des lésions (détection, localisation, quantification), du choix d'un traitement, et de sa planification. Les méthodes développées dans ce cadre doivent faire face à trois principales difficultés scientifiques: (i) la grande variabilité de l'apparence et de la forme des structures recherchées, (ii) leur ressemblance avec les régions environnantes et finalement (iii) la faiblesse du rapport signal sur bruit observé dans les images dans lesquelles on travaille. Ce problème est abordé dans une optique d'application clinique et est résolu en suivant une approche en deux temps commençant par le calcul d'une enveloppe du foie, avant de segmenter les tumeurs présentes à l'intérieur de cette enveloppe. Nous commençons par proposer une approche basée sur des atlas pour le calcul d'une enveloppe des foies pathologiques. Tout d'abord, un outil de traitement d'image a été développé pour calculer une enveloppe autour d'un masque binaire, afin d'essayer d'obtenir une enveloppe du foie à partir d'une estimation du parenchyme sain. Un nouvel atlas statistique a ensuite été introduit, puis utilise pour la segmentation à travers son recalage difféomorphique avec une image. La segmentation est finalement réalisée en combinant les coûts d'appariement des images avec des a priori spatiaux et d'apparence, le tout en suivant une approche multi échelle basée sur des MRFs. La deuxième étape de notre approche porte sur la segmentation des lésions continues dans ces enveloppes en combinant des techniques d'apprentissage par ordinateur avec de méthodes basées sur des graphes. Un espace d'attributs approprié est tout d'abord défini en considérant des descripteurs de textures déterminés à travers des filtres de diverses tailles et orientations. Des méthodes avancées d'apprentissage automatique sont ensuite utilisées pour déterminer les attributs pertinents, ainsi que l'hyperplan qui sépare les voxels tumoraux des voxels correspondant à des tissus sains dans cet espace d'attributs. Pour finir, la segmentation est réalisée en minimisant une énergie sous forme de MRF, laquelle combine les probabilités d'appartenance de chaque voxel à une classe, avec celles de ses voisins. Des résultats prometteurs montrent les potentiels de notre méthode.

Radiofrequency ablation (RFA) is a minimally invasive treatment for either hepatocellular carcinoma or metastasis liver carcinoma. In order to resect large lesions, the surgeon has to perform multiple time-consuming destruction cycles and reposition the RFA needle for each of them. The critical step in handling a successful ablation and preventing local recurrence is the correct positioning of the needle. For small tumors, the surgeon places the middle of the active needle tip in the center of the tumor under intra-operative ultrasound guidance. When one application is not enough to cover the entire tumor, the surgeon needs to repeat the treatment after repositioning of the needle, but US guidance is obstructed by the opacity stemming from the first RFA application. In this case the surgeon can only rely on anatomical knowledge and the repositioning of the RFA needle becomes a subjective task limiting the treatment accuracy. We have developed a computer assisted surgery guidance application for this repositioning procedure. Our software application handles the complete process from preoperative image analysis to tool tracking in the operating room. Our framework is mostly used for this RFA procedure, but is also suitable for any other medical or surgery application.

La phase aigue de l'inflammation sytemique est une periode de transition subsequente au trauma, coordonnee par des mediateurs telles les cytokines. Ces dernieres ciblent ma joritairement le foie, lequel regule alors principalement la production des APPs et des APRIPs. <br />Ce travail montre d'abord la creation d'une plate-forme a puces a ADN dediee a l'etude du transriptome hepatique humain et fondee d'une part sur le developpement de la puce elle-meme par la designation des sondes ADNc qui la definissent, d'autre part sur la creation d'une base de donnees standardisee et ́egalement sur l'ecritre de programmes d'analyse statistique. <br />Il montre enfin comment cette plate-forme a permis de mettre en evidence d'une part une correlation entre 134 transcripts et le degre de l'inflammation et d'autre part une liste de genes repartis en 12 groupes fonctionnels subissant une alteration de leur transcription, de leur stabilite post-transcriptionnelle et de leur traduction durant la phase aigue de linflammation.