Orientadores: Hiroshi Aoyama, Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Medeiros_LucianadeCamposLeite_D.pdf: 2382438 bytes, checksum: d3106e1ce3acaecc348d589d473d3411 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Em nosso laboratório foram purificadas quatro isoformas de fosfatases ácidas, a partir de sementes de soja quiescentes, tendo sido também estudadas suas propriedades cinéticas e físico-químicas. Estudos físicos e estruturais destas enzimas requerem uma grande quantidade da proteína pura, o que exigiria várias purificações convencionais, que, em geral, são bastante trabalhosas. Devido a este fato e a existência de poucas de tais proteínas clonadas e expressas, nos propusemos a clonar e expressar uma proteína tirosina fosfatase (PTP) de soja. O estudo da cinética da PTP recombinante revelou que esta enzima possui características típicas de uma fosfatase e maior especificidade para tirosina-fosfato em relação a outros substratos analisados. Foi feito o estudo de desnaturação térmica da enzima, através de dicroísmo circular, que mostrou que a enzima recombinante apresenta baixa estabilidade térmica. Identificamos por western blot a presença da GmPTP nos diferentes tecidos de soja, germinados tanto no claro como no escuro. Estes resultados, confrontados com os obtidos no PCR quantitativo, mostram uma expressão aumentada do tecido raiz, quando comparada aos outros tecidos avaliados, que está em concordância com o encontrado na literatura, referente à importância fisiológica da enzima neste tecido. Níveis adequados de fósforo são necessários para o crescimento e desenvolvimento de todos os organismos para o bom funcionamento de funções como estrutura molecular, geração de energia e regulação metabólica. A demanda por fósforo e sua conseqüente absorção do solo pelas raízes, aumenta dramaticamente durante o período de rápido crescimento e divisão, por exemplo, na germinação de sementes. Sendo assim, como supridores importantes de fósforo para o metabolismo da planta, podemos citar as fitases e fosfatases, que, além de contribuírem para prover nutrientes, as fosfatases também desempenham papel importante no controle de diferentes funções da planta, particularmente na regulação das cascatas de transdução de sinal. Utilizamos microarranjos de quinases como ferramenta para avaliação do quinoma da raiz nas plântulas de soja germinadas na presença e ausência de luz. Assim, concluímos que fatores ambientais, como a presença de luz e disponibilidade de nutrientes fazem com que diferentes vias estejam ativas e que diferentes fitormônios estejam agindo predominantemente. Relacionando as condições de germinação das plântulas de soja com esses fatores e às quinases mais ativadas no chip, propomos um modelo de sinalização onde o hormônio ácido abscísico responde ao estresse através da ativação de vias como as de MAPKs e de cálcio, causando modulação da atividade de fosfatases e quinases, resultando em respostas como proliferação e rearranjo do citoesqueleto das raízes. Neste trabalho, nós descrevemos a clonagem, expressão de uma de soja, sua caracterização cinética, localização tecidual e investigação da possível relação com a sinalização disparada pela presença ou ausência de luz. A investigação e caracterização de PTPs em plantas podem fornecer informações relevantes no campo de pesquisa do metabolismo vegetal. Sendo assim, nós disponibilizamos dados bioquímicos relevantes os quais sugerem que as plântulas de soja contêm PTP típicas que são principalmente expressas em raízes e aparentemente desempenham papel importante durante a germinação da semente. / Abstract: Our group previously described the purification and characterization of four acid phosphatase isoforms obtained from mature soybean seeds, and determined the kinetic and physico-chemical properties of these enzymes. Structural and physical studies demand high amounts at purity levels of these enzymes, requiring efforts in laborious conventional purifications. Due to this fact and to the existence of few plant proteins that already has been cloned and expressed, we proposed to clone and express a protein tyrosine phosphatase (PTP) from soybean. The kinetic studies of the recombinant PTP revealed an enzyme with phosphatase typical features and higher specificity toward Tyr-phosphate when compared to other analysed substrates. The analysis of thermal inactivation of the enzyme was carried out by circular dichroism, which showed that GmPTP had low thermal stability. The immunolocalization of GmPTP, by western blot, identified the enzyme in different soybean tissues, which were germinated in the presence and absence of light. These results are in agreement with those obtained from the quantitative PCR results, that showed a higher expression of GmPTP in roots when compared with other evaluated tissues. The physiological importance of this tissue to the plant metabolism corroborates our results, because adequate levels of phosphorus are required for the good operation of metabolic functions, as growth and development. The phosphorus demand and the consequent soil absorption through the roots dramatically increase in periods of high growth rate, for instance, during germination. Therefore, phytases and phosphatases are important suppliers for plant metabolism and besides the contribution to provide nutrients, phosphatases could play an important role in regulation of signal transduction cascades. Kinase microarrays were employed as a strong tool to analyse the root kinome in soybean plantlets germinated in light and dark conditions. We concluded that abiotic factors as light presence and nutrients availability were responsible for the activation of different pathways and different phytormones prevalence. Relating the germination conditions of soybean plantlets to these factors and to the analysis of the most activated kinases on the chip, we propose a signaling model to explain that, when the hormone abscisic acid is the main response of stress stimuli, it triggers the activation of MAPK and calcium signaling, and the resulting modulation of kinases and phosphatases activities led to proliferation and cytoskeleton rearrangement in roots. In this work, we described the cloning and expression of a soybean PTP, its kinetic characterization, tissue distribution and investigation of a putative relationship with the signaling pathway triggered by light and dark. The investigation and characterization of PTPs from plants can add relevant information in the plant metabolism research field. Therefore, we provided a wealth biochemical data which suggest that soybean plantlets contain typical PTP, which is mainly expressed in roots and apparently plays a critical role during germination. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Aspergillus fumigatus é um fungo patogênico oportunista capaz de infectar pacientes imunocomprometidos causando eventualmente infecções disseminadas difíceis de serem controladas e com alta taxa de mortalidade dos indivíduos infectados.. Para um melhor entendimento de como esse fungo age no hospedeiro é importante saber como as vias de sinalização que regulam esses fatores de virulência são orquestradas. Proteínas fosfatases são centrais em uma grande variedade de vias de transdução de sinal. Neste trabalho, nós caracterizamos a proteína fosfatase 2A SitA, a proteína homóloga de Sit4 em Saccharomyces serevisiae. O gene sitA não é essencial e por isso fomos capazes de construir um mutante nulo em A. fumigatus. A cepa ?sitA apresenta aumento na fosforilação da MpkA, é mais sensível à agentes que causam dano na parede celular, tem um aumento na quantidade de ?-1,3 glicano e quitina, e também tem problemas na adesão e formação de biofilme. O mutante ?sitA é mais sensível a vários metais e íons, como MnCl2, CaCl2, LiCl, entretanto é mais resistente à ZnSO4. O mutante ?sitA é avirulento em modelo de aspergilose pulmonar invasiva em camundongos. Esses resultados revelam que a fosfatase SitA está envolvida na via de integridade da parede celular de A. fumigatus possivelmente modulando a atividade de PkcA/MpkA / Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic fungus able to infect immunocompromised patients causing eventually disseminated infections that are difficult to be controlled, and lead to high mortality rates. It is important to understand how are orchestrated the signalling pathways that regulate these factors involved in virulence. Protein phosphatases are central to numerous signal transduction pathways. Here we characterize A. fumigatus protein phosphatase 2A SitA, the S. cerevisiae Sit4p homologue. The sitA gene is not an essential gene and we were able to construct an A. fumigatus null mutant. The ?sitA strain had increased MpkA phosphorylation, was more sensitive to cell wall damaging agents, had increased ??1,3?glican and chitin, and was impaired in biofilm formation. The ?sitA strain is more sensitive to several metals and ions such as MnCl2, CaCl2, and LiCl, however, it is more resistant to ZnSO4. The ?sitA strain was avirulent in a murine model of invasive pulmonary aspergillosis. These results stress the importance of A. fumigatus SitA as a possible modulator of PkcA/MpkA activity and its involvement in the cell wall integrity pathway

Introdução e Objetivos. Fosfatases são enzimas promissoras para aplicação na degradação de organofosforados. Por exemplo, a enzima paraoxonase 1 (PON1), associada à lipoproteína de alta densidade (HDL), hidrolisa lactonas, ésteres aromáticos e compostos organofosforados (OP) neurotóxicos. \"Módulos de ligação a carboidrato\" (CBM) têm diversas aplicações biotecnológicas. Nosso objetivo é a obtenção de proteínas quiméricas contendo fosfatases ligadas a um módulo de ligação de celulose, o que possibilitaria a imobilização dessas enzimas em suportes de celulose. Resultados. Como prova de conceito, uma proteína quimérica contendo uma \"fosfatase ácida\" (appA) de E.coli e CBM familia 2 (CBM2) de uma celulase de Xanthomonas axonopodis pv citri foi montada e produzida em E. coli como uma proteína recombinante solúvel. appA-CBM2 purificada demonstrou ser totalmente funcional exibindo atividade de ligação à celulose microcristalina (Avicel PH101) e atividade de fosfatase sobre p-nitrofenil fosfato. A ligação à Avicel evidenciou um comportamento de saturação descrito por uma \"constante de ligação\" (Kb) de 26 mg e um \"máximo de ligação\" (Bmax) de 4,45 U/µg. Além disso, a ligação de appA-CBM2 em Avicel foi maior em pH 2,5 e diminuiu acima de pH 6,5, como observado anteriormente para CBM2. Finalmente, o efeito de concentração de p-nitrofenil fosfato na atividade catalítica de appA-CBM2 e appA foi idêntico, exibindo um Km de 2,8 mM. Portanto, esses dados mostram que o conceito de uma proteína que combina as propriedades da fosfatase e do domínio de ligação à celulose é possível e funcional. De forma similar, os segmentos de DNA que codificam para o CBM2 e para a PON1 de Homo sapiens, foram fusionados resultando em um segmento que codifica para uma proteína quimérica (PON1-CBM2). PON1 nativa e PON1-CBM2 foram produzidas na forma solúvel e ativa em E.coli cepa Arctic. Embora não tenha sido viável sua purificação, estas enzimas foram caracterizadas. PON1-CBM2 liga-se em Avicel PH101 com um comportamento de saturação, descrito por uma constante de ligação (Kb) de 27 mg, valor idêntico àquele observado para appA-CBM2, o que sugere que o domínio CBM2 é igualmente funcional nestas duas enzimas quiméricas. PON1-CBM2 também exibe atividade paraoxonásica com Km similar àquele observado para PON1 nativa (1,3 mM), sugerindo que o \"domínio\" PON1 encontra-se totalmente funcional na enzima quimérica. Conclusão. Uma estratégia para a construção e expressão heteróloga em E. coli de PON1 e das enzimas quiméricas appA-CBM2 e PON1-CBM2 foi desenvolvida. As enzimas quiméricas mostraram-se totalmente funcionais e conservaram as propriedades de seus \"domínios\" constituintes. / Introduction and Aims. Phosphatases are promising enzymes for application in the degradation of organophosphates, whereas carbohydrate binding module has significant and demonstrated biotechnological applications. The high-density lipoprotein-associated enzyme paraoxonase 1 (PON1) hydrolyzes lactones, aromatic esters, and neurotoxic organophosphorus (OP) compounds. Our aim is to obtain chimeric proteins containing a phosphatase domain linked to a carbohydrate binding module (CBM), which could be immobilized on a cellulose supports. Results. As a proof of concept, a chimeric protein combining an acid phosphatase (appA) from E.coli and a CBM family 2 (CBM2) from Xanthomonas axonopodis pv. citri was assembled and produced in E.coli as a recombinant soluble protein. Purified appA-CBM2 was fully functional, was bound to microcrystalline cellulose and exhibited phosphatase activity upon p-nitrophenyl phosphate. The binding to microcrystalline cellulose Avicel PH101 exhibited saturation with a binding constant (Kb) of 26 and a maximum binding (Bmax) of 4,45 U/µg. In addition, the binding was higher at pH 2.5 and decreased above pH 6.5, as previously observed for CBM2. Finally, effect of p-nitrophenyl phosphate concentration on appA-CBM2 and native appA activities were identical, exhibiting a Km of 2.8 mM. Taken together, these data show that the conceptual design of a protein combining the properties and biotechnological advantages of phosphatases and cellulose binding domains is possible and functional. Similarly, DNA segments coding for CBM2 and for PON1 from Homo sapiens combined resulting in a segment coding for a chimeric protein (PON1-CBM2). Native PON1 and PON1-CBM2 were produced as recombinant protein in E. coli Arctic. Although purification was not accomplished, these enzymes were characterized. PON1-CBM2 binds to microcrystalline cellulose, exhibiting a saturation behavior described by a Kb of 27 mg. PON1 and PON1- CBM2 have the same Km for paraoxon (1.3 mM), indicating that the phosphatase domain was fully functional. Conclusion. An effective strategy for heterologous expression of the native PON1 and chimeric appA-CBM2 and PON1-CBM2 in E. coli was attained. The chimeric enzymes were fully functional and maintained the properties of their original domains

Orientador: Renato de Mello Prado / Banca: Itamar Andrioli / Banca: Pedro Luis da Costa Aguiar Alves / Banca: Milton Ferreira de Moraes / Banca: Francisco Maximino Fernandes / Resumo: A adubação fosfatada no sulco de plantio da cana-de-açúcar, com fertilizante mineral associado a resíduo orgânico, apresenta-se como alternativa para aumentar a taxa de recuperação do fósforo (P) pelas plantas. Objetivou-se avaliar os efeitos de doses e fontes de P, na ausência e na presença de torta de filtro, sobre o P no solo, estado nutricional e a produtividade da cana planta cultivada em Argissolo e em Latossolo. Foram realizados dois ensaios durante o ano agrícola 2012/2013 no estado de São Paulo, em áreas com baixos teores de P. Utilizaram-se três fontes (fosfato de Araxá, fosfato Bayóvar e superfosfato triplo) e quatro doses de P (zero; 90; 180 e 360 kg ha-1 de P2O5), na ausência e na presença de 7,5 t ha-1 de torta de filtro (base seca). Os tratamentos foram aplicados no sulco de plantio da cana-deaçúcar. Avaliaram-se as variáveis de crescimento aos quatro e aos seis meses após a brotação, a disponibilidade de P no solo aos seis meses após o plantio, o teor foliar de macro e micronutrientes aos quatro e aos oito meses após a brotação, a atividade da fosfatase ácida foliar aos oito meses após a brotação, a produtividade de palhada e de colmos e o acúmulo de fósforo pelas plantas aos 12 meses após a brotação, assim como a qualidade tecnológica da cana-de-açúcar. A aplicação de doses de P, independentemente da fonte, aumentou a disponibilidade do nutriente no solo, o crescimento da cana-de-açúcar, melhorou a nutrição fosfatada da cana planta e resultou em aumento de produtividade, no entanto, não influenciou a qualidade tecnológica. A determinação do teor de P no solo pelo método resina mostrou-se mais adequado que o remanescente. A diagnose foliar em P pode ser realizada seguindo ambos os critérios de recomendação. A atividade da fosfatase ácida não demonstrou eficiência no diagnóstico nutricional em P. Em ambos os solos os efeitos ... / Abstract: Phosphorus fertilization in sugarcane planting furrow with mineral fertilizer combined with organic waste is presented as an alternative to increase the rate of recovery of phosphorus by plants. The aim of the study was to evaluate the effects of different phosphorus rates and sources, in the absence or presence of filter cake on phosphorus in soil, nutritional status and productivity of sugarcane crop grown in Ultisol and Oxisol. Two experiments were conducted during the agricultural year 2012/2013 in the state of São Paulo, in areas with low levels of phosphorus. Three phosphorus sources were used (triple superphosphate, Araxa rock phosphate and Bayovar rock phosphate) and four application rates (0, 90, 180 and 360 kg ha-1 of P2O5) in the presence or absence of filter cake (7.5 t ha-1, dry basis). Treatments were applied in sugarcane planting furrow. The growth variables were evaluated at four and six months after sprouting, the availability of phosphorus in soil at six months after planting, the leaf content of macro and micronutrients at four and eight months after sprouting, the activity of leaf acid phosphatase at eight months after sprouting, the productivity of straw and stalks and phosphorus accumulation by plants at 12 months after planting, as well as the sugarcane technological quality. The application rates of phosphorus, regardless of source, increased this nutrient availability in soil, the growth of the sugarcane, improved phosphorus nutrition of sugarcane plant and resulted in increased productivity, although, it did not influence the technological quality. The determination of phosphorus in soil by the resin method was more suitable than the remaining. Leaf phosphorus analysis can be performed following both criteria of sampling recommendation. The acid phosphatase activity showed no efficiency in diagnosing nutritional phosphorus. In both soil treatment effects were ... / Doutor

Orientador: Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo / Resumo: Diante da iminente escassez de fósforo (P) para utilização agrícola, surge a necessidade de estudos voltados para o melhor entendimento de estratégias de suprimento deste elemento. Estudos recentes demonstram que a atividade hormonal potencializa processos em que o P é vital para ocorrência no metabolismo, destacando os análogos de Brassinoesteróides (BR) pela influência sobre o desenvolvimento vegetal. São escassos os estudos sobre a interação P e BR e sua aplicação em grandes culturas consumidoras de fósforo, como é o caso da cana-de-açúcar. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da aplicação de doses do análogo de BR 24-epibrassinolide (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg. L-1), associado à presença ou ausência de fertilização fosfatada sobre os parâmetros de crescimento, fosfatase, micorrização e fotossíntese de plantas jovens de cana-de-açúcar. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, em DBC com fatorial 4x2 com seis repetições. A aplicação dos BR proporcionou um incremento nos valores de massa seca radicular até o ponto máximo da curva de 1,27 mg.L-1. A interação P com BR incrementou respectivamente em 30% e 48% os valores de massa seca aérea nas doses 0,5 e 1,0 mg.L-1 do hormônio; e apresentou uma correlação de Pearson positiva das doses de BR com adição de P sobre essa variável. A presença de P estimulou todas as variáveis de crescimento da cana-de-açúcar. O BR desencadeou um pico significativo na atividade da enzima fosfatase ácida na dose de 1,0 mg. L-1 ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In view of the imminent shortage of phosphorus (P) for agricultural use, increase the need for studies aimed at better understanding the supply strategies of this element. Recent studies show that hormonal activity potentiates processes in which it is vital for the occurrence of metabolism, highlighting the analogues of Brassinoesterteroids (BR) for their influence on plant development. There are few studies on P and BR interaction and their application in large phosphorus-consuming crops, such as sugar cane. Thus, the objective of the present study was to evaluate the effect of applying doses of the 24-epibrassinolide dialogue (0; 0.5; 1.0; 2.0 mg. L-1), associated with the presence or absence of phosphate fertilization on the growth, phosphatase, mycorrhization and photosynthesis parameters of young sugarcane plants. The experiment was conducted in the greenhouse, in the DBC with a 4x2 factorial with six replications. The application of BR provides an increase in the values of root dry mass up to the maximum point of the curve of 1.27 mg. L-1. A P interaction with BR increases, respectively, by 30% and 48% the values of air dry mass at doses 0.5 and 1.0 mg.L-1 of the hormone; and showed a positive Pearson correlation of BR doses with the addition of P on this variable. The presence of P stimulates all sugar cane growth variables. BR triggered a significant peak of acid phosphatase enzyme activity at a dose of 1.0 mg. L-1 and did not affect root mycorrhizal colonization. The... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A fertilização promove incrementos de 30 a 50 % na produtividade de eucaliptos, com especial resposta ao P. O manejo adequado da fertilização fosfatada contribui para a otimização dos custos no primeiro ano. Existem no mercado diversas opções de fornecimento de P às plantas. Em geral, as fontes fosfatadas distinguem-se pela concentração, forma e solubilidade do P. O alto teor de oxihidróxidos de Fe e Al nos solos tropicais diminuem a eficiência desse nutriente devido ao processo de adsorção. Novas tecnologias de fertilizantes fosfatados estão sendo desenvolvidas visando aumentar esta eficiência de utilização, as quais necessitam de validação e comprovação dos seus efeitos em condições reais de crescimento do povoamento. Uma alternativa para aumentar a eficiência do P é a complexação deste com substâncias húmicas (complexo P-metal- SH), pois podem diminuir os processos de adsorção e possibilitar o maior aproveitamento do nutriente. O uso de técnicas de fracionamento do P no solo são amplamente utilizadas para identificar os reservatórios de P no solo e, consequentemente, sua disponibilidade à planta. A dinâmica das frações de P no solo é influenciada diretamente pela planta e pela microbiota do solo por meio de adaptações físicas e químicas do sistema radicular e ou remobilização interna de ácidos orgânicos. Objetivando compreender a dinâmica do P na interface planta- solo em um plantio de Eucalyptus grandis, foram propostos dois estudos: i) caracterização dos reservatórios de P a longo prazo e as adaptações desenvolvidas pelas plantas para aumentar a absorção de P, ii) identificação dos reservatórios de P inorgânico (Pi) lábil e a remobilização dos ácidos orgânicos nos tecidos vegetais ao longo de um ano. Constatou-se que o uso de fontes minerais de P alteram as frações lábeis e moderadamente lábeis do P no solo, não influenciando a fração não-lábil. As frações orgânicas lábeis e moderadamente lábeis contribuem consideravelmente para a nutrição da planta, em especial quando não há fertilização com P. O uso do complexo P-metal-SH incrementou a fração orgânica moderadamente lábil nos primeiros 12 meses com posterior redução. Houve equilíbrio entre as frações de P no solo e após o esgotamento das frações lábeis, as frações não lábeis foram reduzidas. O P-residual diminuiu em todos os tratamentos, em especial, no tratamento Controle. A produção de raízes finas na camada de 0-100 cm ultrapassou 6 Mg ha-1, sem diferenças entre os tratamentos. Todavia, notou-se claramente o efeito da aplicação localizada do fertilizante na densidade do sistema radicular, que apresentou maiores concentrações na linha de plantio. O comprimento específico das raízes finas na camada superficial apresentou distribuição oposta à atividade da fosfatase ácida e da ectomicorrização nos tratamentos Controle e fosfato reativo (FNR), exceto para o P solúvel convencional (PSC) que apresentou distribuição homogênea ao redor da árvore. O uso do P solúvel convencional estimulou a simbiose com micorrizas, e estas contribuíram para os processos de mineralização das frações orgânicas de P no solo por meio da exsudação de fosfatase ácida. Analisando a dinâmica das frações inorgânicas lábeis em curto período, nos primeiros 120 dias pós-plantio foi observado equilíbrio dinâmico entre as frações de Pi lábil no solo, exceto para o Controle que apresentou reduções constantes em todas as frações. Em períodos de excedente hídrico, as plantas absorveram altas quantidades de P, acumulando altos teores de ácidos orgânicos no tronco e, em períodos de estresse hídrico, houve remobilização dos ácidos orgânicos do tronco para as folhas, a fim de manter os processos metabólicos. / Fertilization promotes 30 to 50% increments in forest productivity, with a special response to P input. The adequate management of phosphate fertilization contributes to cost optimization in the first year. There are several options on the market for supplying P to plants. In general, phosphate sources are distinguished by the concentration, form and solubility of P. The high content of Fe and Al oxyhydroxides in tropical soils reduces the efficiency of this nutrient due to adsorption processes. New phosphate fertilizer technologies are being developed aiming to increase this efficiency of use, which need validation and proof of their effects under real conditions of population growth. An alternative to increase the efficiency of the P is the complexation of this with humics substances (AH- CA-P complex), since they can decrease the adsorption processes and allow the greater use of the nutrient. The use of P fractionation techniques in soil are widely used to identify P reservoirs in the soil and consequently their availability to the plant. The dynamics of P fractions in soil are directly influenced by the plant and soil microbiota through physical and chemical adaptations of the root system and / or internal remobilization of organic acids. Two experiments were carried out: i) long-term characterization of P reservoirs and adaptations developed by plants to increase P uptake; and ii) identification of labile Pi reservoirs and remobilization of organic acids in plant tissues over a year. It was found that the mineral source use of P changes the labile and moderately labile fractions of P in the soil, not influencing the non-labile fraction. The labile and moderately labile organic fractions contribute considerably to plant nutrition, especially when not fertilized with P. The use of the P- metal-SH complex increased the moderately labile organic fraction in the first 12 months with subsequent reduction. We observed the equilibrium between the fractions of P in the soil and after the exhaustion of the labile fractions, the non-labile fractions were reduced. The P-residual decreased for all treatments, especially for the control treatment. The yield of fine roots in the 0- 100 cm layer exceeded 6 Mg ha-1, with no differences between treatments. However, the effect of the localized application of the fertilizer on the density of the root system, which presented higher concentrations in the planting line, was clearly noticed. The specific length of the roots in the superficial deep presented opposite distribution to the activity of the acid phosphatase and ectomycorrhizal colonization for all the treatments, except for the PSC that presented homogenous distribution around the tree. The use of conventional soluble phosphorus stimulated the symbiosis with mycorrhizae, and this contributed to the processes of mineralization of the organic fractions of P in the soil through the exudation of acid phosphatase. Analyzing the dynamics ofthe inorganic fractions in a short period, in the first 120 days post-planting, equilibrium was observed between the fractions of labile Pi in the soil, except for the control treatment that showed constant reductions in all fractions. In periods of water supply, the plants absorbed high amounts of P, accumulating high levels of organic acids in the stem and during periods of water stress, it was observed the remobilization of the AOs from the stem to the leaves, to maintain the metabolic processes.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação do ultra-som (US) de 1 MHz comparando as freqüências de repetição de pulso de 100 Hz e 16 Hz na recuperação da fratura de fíbula, por análise morfológica e bioquímica, entre animais tratados e não-tratados. Foram utilizados 60 ratos machos albinos Wistar divididos em 4 grupos experimentais: referência, controle, tratados com US com freqüência de repetição de pulso de 16 Hz ou 100 Hz. Os animais dos grupos tratado e controle foram submetidos a uma fratura com perda óssea da fíbula direita. O tratamento teve início 24 h após a fratura, durante 5 dias por semana, com intensidade de 0,5 W/'CM POT.2', modo pulsado 1/5, freqüência de repetição de pulso a 100 Hz ou 16 Hz, por 3 min/dia. No 7°, 14º e 21º dia após a indução da fratura foi realizada coleta do sangue através de punção cardíaca para quantificação dos níveis de fosfatase alcalina e cálcio sérico e em seguida os animais foram submetidos à eutanásia e a fíbula foi removida para análise histológica. Foram determinadas a densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos. Os níveis de fosfatase alcalina e cálcio foram significativamente (P < '10 POT.-7') diferentes nos grupos experimentais. A densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos também foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais. O tratamento com US acelerou a regeneração óssea e modulou os níveis sanguíneos de fosfatase alcalina e cálcio, sendo que, o US pulsado com freqüência de repetição de pulso a 100 Hz e freqüência de base da 1 MHz demonstrou ser mais eficaz / The aim of this work was to evaluate the effect of 1 MHz ultrasound application, comparing the 100 Hz and 16 Hz pulse repetition frequency in the recovering of fibula fracture, using morphological and biochemical analysis, between treated and non-treated animals. We used 60 male albino Wistar rats divided into 4 experimental groups: reference; control; treated with 100 Hz or 16 Hz pulse repetition frequency ultrasound. The treatment began 24 h after fracturing, lasted for 5 days per week, with 0.5 W/'CM POT. 2', pulsed mode 1/5, pulse repetition frequency of 100 Hz or 16 Hz, for 3 min a day. In the 7th, 14th and 21st after fracture induction, blood was collected through cardiac punction to alkaline phosphatase and calcium levels quantification and following that, the animals were euthanised and the fibula was removed to histological analysis. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densityes were determined. The levels of alkaline phosphatase and calcium were significantly (P < '10 POT.-7') different among the experimental group. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densities were significantly different among experimental groups. The US treatment accelerated the bone regeneration and modulated the alkaline phosphatase and calcium blood levels, being the pulsed US with 100 Hz pulse repetition frequency and base current 1 MHz the most efficient

O ultra-som pulsado de baixa intensidade é uma onda mecânica com efeitos osteogênicos promisso- res para o tratamento da osteoporose. Baseada neste efeito, a pesquisa tem como objetivo a identificação das mudanças causadas pela aplicação do ultra-som em ossos osteopênicos e a comparação com as mudanças causadas pelos exercícios físicos. Aplicou-se o protocolo experimental em um modelo animal de ratos fêmeas maduras ovariectomizadas. Utilizaram-se 35 ratos fêmeas, divididas em 5 grupos: ovariectomia controle (OVX), pseudo ovariectomia (PSEUDO-OVX), ovariectomia tratado com ultra-som (US), ovariectomia treinado com caminhada (CAMINHADA) e ovariectomia treinado com exercício resistido (SALTO). O protocolo de tratamento estendeu-se por 12 semanas, com aplicação ultra-sônica diária de 20 minutos (seis vezes por semana) e realização de exercício três vezes por semana, sendo 40 minutos para CAMINHADA e três séries de 10 exercícios para o SALTO. Para a identificação dos efeitos do tratamento de ultra-som e dos exercícios em ratos fêmeas osteopênicas utilizaram-se os seguintes parâmetros: massa corporal, dosagem de fosfatase alcalina, área trabecular, histomorfometria e valor de microdureza Vickers. Conclui-se que os três tipos de tratamento executados exerceram um efeito preventivo na perda de massa óssea pós-ovariectomia quando comparados ao OVX, mas não foram capazes de alcançar os valores encontrados no PSEUDO-OVX para os parâmetros analisados. As avaliações da quantidade óssea indicaram que o tratamento mais efetivo foi o SALTO para este parâmetro. Os resultados do US e CAMINHADA foram semelhantes nos parâmetros analisados / The low intensity pulsed ultra-sound is a mechanical wave with promising osteogenics effects for the osteoporosis treatment. Based in these effects, the research aims the identification of changes caused by ultra-sound application and physical exercises in osteopenics bones; and if there are similarity between them. Thus, it was applied an experimental protocol in an animal model of mature ovariectomized rats. It was used 35 rats, divided in 5 groups: control ovariectomized (OVX), pseudo ovariectomized (PSEUDO-OVX), ovariectomized with ultra-sound treatment (US), ovariectomized trained with walk (CAMINHADA) and ovariectomized trained with resisted exercise (SALTO). The protocol of treatment lasted 12 weeks, with the application of ultra-sound daily for 20 minutes (six times per week) and the realization of exercises three times per week, with 40 minutes for CAMINHADA and three sets of 10 exercises for SALTO. It was used the followed parameters to identify the effects of the ultra-sound treatment and the exercises in osteopenic rats: body mass, alkaline phosphatasis dosage, trabecular area, histomorphometry and Vickers microhardness value. The results showed that the three types of applied treatments have a preventive effect in the loss of bone mass after ovariectomy when compared with OVX. However, they could not reach the found values in PSEUDO-OVX for the analysed parameters. The evaluations of bone quantity indicated that the most effective treatment was SALTO for this parameter. The results of US and CAMINHADA were similar in evaluated parameters

As proteínas fosfatases são enzimas responsáveis pela desfosforilação de resíduos de fosfoaminoácidos, principalmente fosfotirosina e fosfoserina/treonina, o que divide esta classe de proteínas nas famílias PTP (proteína tirosina fosfatase) e PP (proteína serina/treonina fosfatase). Diversos membros da família das PPs, em particular da subfamília PPP (Phosphoprotein Phosphatase), existem como holoenzimas compostas de uma subunidade catalítica associada a uma ou mais subunidades reguladoras, que lhes conferem diversidade funcional. Neste trabalho tivemos como objetivo identificar, utilizando ensaios no sistema de duplo híbrido em leveduras, proteínas que interagem com as subunidades catalíticas das serina/treonina fosfatases do tipo 1 (DdPP1c) e do tipo 4 (DdPP4c) da ameba social D. discoideum. Varreduras de bibliotecas de cDNA das fases de crescimento e desenvolvimento da linhagem AX4 de D. discoideum com as iscas DdPP1c e uma variante mutante da DdPP1c (DdPP1cF269C) possibilitaram a identificação de pelo menos 30 genes com evidência de interação com a PP1c. A varredura das bibliotecas com a isca DdPP4 propiciou a identificação de 10 potenciais genes candidatos com evidência de interação com a PP4c. Várias dos candidatos identificados nas varreduras correspondem a genes que codificam para proteínas hipotéticas que não apresentam similaridade significativa com proteínas de função conhecida. Entre essas, identificamos e caracterizamos DdI-3, um ortólogo do inibidor-3 da PP1c de mamíferos. A interação de DdI-3 com DdPP1c foi confirmada através de ensaios independentes no sistema do duplo híbrido em leveduras. Demonstramos que DdI-3 recombinante expresso em bactérias possui atividade inibidora da DdPP1c in vitro, sendo que esta enzima tem 50% de sua atividade de fosforilase fosfatase inibida por cerca de 0,55 nM de rDdI-3. Estes dados indicam que DdI-3 é 50 vezes mais potente do que DdI-2, um ortólogo do inibidor-2 previamente caracterizado em D. discoideum. Neste trabalho, também iniciamos a construção do catálogo (The Dictyostelium Phosphatome) que irá conter todas as subunidades catalíticas e reguladoras das proteínas fosfatases codificadas no genoma de D. discoideum. Até o momento, 101 genes foram catalogados e classificados nas diferentes famílias das proteínas fosfatases, sendo 16 na família das PTPs, 26 na família das DSPs (proteína fosfatase de dupla especificidade), 15 na família das PPMs (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) e 31 na família das PPPs, incluindo genes codificadores de subunidades catalíticas e reguladoras. / Protein phosphatases are responsible for dephosphorylating phosphoaminoacids residues, notably phosphotyrosine and phosphoserine/threonine, thus dividing these enzymes into PTP (protein tyrosine phosphatase) and PP (protein serine/threonine phosphatase) families. Several members of the PP family, in particular those belonging to PPP (Phosphoprotein Phosphatase) are composed of one catalytic subunit and one or more regulatory subunits that provide functional diversity to the holoenzyme. In this work our goal was to identify protein interactors to type 1 (DdPP1c) and type 4 (DdPP4c) phosphatase that might behave as potential regulatory subunits of these enzymes in the social amoeba Dictyostelium discoideum. For this intent, DdPP1c, a mutant isoform of DdPP1 (DdPP1cF269C) and DdPP4c were used as baits in yeast two-hybrid based screening of D. discoideum (AX-4 strain) cDNA libraries from growth as well as developmental stages. At least 30 genes were identified as potential DdPP1c interactors while 10 genes were selected as candidates to interact to DdPP4c. Most of them are currently annotated in D. discoideum genome as hypothetical proteins of unknown function. Among the potential PP1c interactors we selected DdI-3, an ortholog of mammalian inhibitor-3. Interaction of DdI-3 and DdPP1c was confirmed by independent yeast two-hybrid assays. We demonstrated that bacterial expressed recombinant DdI-3 is effective as an inhibitor of DdPP1c in vitro, since 50% of DdPP1c phosphorylase phosphatase activity is inhibited by circa 0,55 nM of purified rDdI-3. Our results also showed that DdI-3 is 50 times more effective than DdI-2, a previously characterized PP1c inhibitor in D. discoideum. In this work we began to organize The Dictyostelium Phosphatome, a catalog of all protein phosphatases, including their catalytic and regulatory subunits, encoded in D. discoideum genome. Until now, we have classified 101 genes into the protein phosphatase families, of which 16 were classified as classic PTP, 26 as DSP (dual-specificity phosphatases), 15 as PPM (Phosphoprotein Phosphatase Magnesium-dependent) and 31 as PPP, including genes for catalytic as well as regulatory subunits.

A fertilização promove incrementos de 30 a 50 % na produtividade de eucaliptos, com especial resposta ao P. O manejo adequado da fertilização fosfatada contribui para a otimização dos custos no primeiro ano. Existem no mercado diversas opções de fornecimento de P às plantas. Em geral, as fontes fosfatadas distinguem-se pela concentração, forma e solubilidade do P. O alto teor de oxihidróxidos de Fe e Al nos solos tropicais diminuem a eficiência desse nutriente devido ao processo de adsorção. Novas tecnologias de fertilizantes fosfatados estão sendo desenvolvidas visando aumentar esta eficiência de utilização, as quais necessitam de validação e comprovação dos seus efeitos em condições reais de crescimento do povoamento. Uma alternativa para aumentar a eficiência do P é a complexação deste com substâncias húmicas (complexo P-metal- SH), pois podem diminuir os processos de adsorção e possibilitar o maior aproveitamento do nutriente. O uso de técnicas de fracionamento do P no solo são amplamente utilizadas para identificar os reservatórios de P no solo e, consequentemente, sua disponibilidade à planta. A dinâmica das frações de P no solo é influenciada diretamente pela planta e pela microbiota do solo por meio de adaptações físicas e químicas do sistema radicular e ou remobilização interna de ácidos orgânicos. Objetivando compreender a dinâmica do P na interface planta- solo em um plantio de Eucalyptus grandis, foram propostos dois estudos: i) caracterização dos reservatórios de P a longo prazo e as adaptações desenvolvidas pelas plantas para aumentar a absorção de P, ii) identificação dos reservatórios de P inorgânico (Pi) lábil e a remobilização dos ácidos orgânicos nos tecidos vegetais ao longo de um ano. Constatou-se que o uso de fontes minerais de P alteram as frações lábeis e moderadamente lábeis do P no solo, não influenciando a fração não-lábil. As frações orgânicas lábeis e moderadamente lábeis contribuem consideravelmente para a nutrição da planta, em especial quando não há fertilização com P. O uso do complexo P-metal-SH incrementou a fração orgânica moderadamente lábil nos primeiros 12 meses com posterior redução. Houve equilíbrio entre as frações de P no solo e após o esgotamento das frações lábeis, as frações não lábeis foram reduzidas. O P-residual diminuiu em todos os tratamentos, em especial, no tratamento Controle. A produção de raízes finas na camada de 0-100 cm ultrapassou 6 Mg ha-1, sem diferenças entre os tratamentos. Todavia, notou-se claramente o efeito da aplicação localizada do fertilizante na densidade do sistema radicular, que apresentou maiores concentrações na linha de plantio. O comprimento específico das raízes finas na camada superficial apresentou distribuição oposta à atividade da fosfatase ácida e da ectomicorrização nos tratamentos Controle e fosfato reativo (FNR), exceto para o P solúvel convencional (PSC) que apresentou distribuição homogênea ao redor da árvore. O uso do P solúvel convencional estimulou a simbiose com micorrizas, e estas contribuíram para os processos de mineralização das frações orgânicas de P no solo por meio da exsudação de fosfatase ácida. Analisando a dinâmica das frações inorgânicas lábeis em curto período, nos primeiros 120 dias pós-plantio foi observado equilíbrio dinâmico entre as frações de Pi lábil no solo, exceto para o Controle que apresentou reduções constantes em todas as frações. Em períodos de excedente hídrico, as plantas absorveram altas quantidades de P, acumulando altos teores de ácidos orgânicos no tronco e, em períodos de estresse hídrico, houve remobilização dos ácidos orgânicos do tronco para as folhas, a fim de manter os processos metabólicos. / Fertilization promotes 30 to 50% increments in forest productivity, with a special response to P input. The adequate management of phosphate fertilization contributes to cost optimization in the first year. There are several options on the market for supplying P to plants. In general, phosphate sources are distinguished by the concentration, form and solubility of P. The high content of Fe and Al oxyhydroxides in tropical soils reduces the efficiency of this nutrient due to adsorption processes. New phosphate fertilizer technologies are being developed aiming to increase this efficiency of use, which need validation and proof of their effects under real conditions of population growth. An alternative to increase the efficiency of the P is the complexation of this with humics substances (AH- CA-P complex), since they can decrease the adsorption processes and allow the greater use of the nutrient. The use of P fractionation techniques in soil are widely used to identify P reservoirs in the soil and consequently their availability to the plant. The dynamics of P fractions in soil are directly influenced by the plant and soil microbiota through physical and chemical adaptations of the root system and / or internal remobilization of organic acids. Two experiments were carried out: i) long-term characterization of P reservoirs and adaptations developed by plants to increase P uptake; and ii) identification of labile Pi reservoirs and remobilization of organic acids in plant tissues over a year. It was found that the mineral source use of P changes the labile and moderately labile fractions of P in the soil, not influencing the non-labile fraction. The labile and moderately labile organic fractions contribute considerably to plant nutrition, especially when not fertilized with P. The use of the P- metal-SH complex increased the moderately labile organic fraction in the first 12 months with subsequent reduction. We observed the equilibrium between the fractions of P in the soil and after the exhaustion of the labile fractions, the non-labile fractions were reduced. The P-residual decreased for all treatments, especially for the control treatment. The yield of fine roots in the 0- 100 cm layer exceeded 6 Mg ha-1, with no differences between treatments. However, the effect of the localized application of the fertilizer on the density of the root system, which presented higher concentrations in the planting line, was clearly noticed. The specific length of the roots in the superficial deep presented opposite distribution to the activity of the acid phosphatase and ectomycorrhizal colonization for all the treatments, except for the PSC that presented homogenous distribution around the tree. The use of conventional soluble phosphorus stimulated the symbiosis with mycorrhizae, and this contributed to the processes of mineralization of the organic fractions of P in the soil through the exudation of acid phosphatase. Analyzing the dynamics ofthe inorganic fractions in a short period, in the first 120 days post-planting, equilibrium was observed between the fractions of labile Pi in the soil, except for the control treatment that showed constant reductions in all fractions. In periods of water supply, the plants absorbed high amounts of P, accumulating high levels of organic acids in the stem and during periods of water stress, it was observed the remobilization of the AOs from the stem to the leaves, to maintain the metabolic processes.