Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T04:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_MarcioAndre_D.pdf: 2102313 bytes, checksum: fdea105054da02b28218af6251f421dd (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Flavonóides são compostos polifenólicos amplamente consumidos na dieta humana, podendo chegar ao consumo diário de 1,0 grama. Uma variedade de efeitos biológicos in vitro e in vivo é descrita para os flavonóides tais como: inibição e alteração da expressão enzimática, antioxidantes e pró-oxidantes, síntese e reparo de DNA, indução a apoptose e anti-tumorais. Fosfatases são enzimas da classe das hidrolases que catalisam a desfosforilação de monoésteres fosfatos e são divididas em três grupos principais: proteínas fosfatases, fosfatases ácidas e fosfatases alcalinas. Juntamente com as proteínas quinases, as proteínas fosfatases são responsáveis pelo mecanismo de fosforilação/ desfosforilação que controla os principais eventos celulares como crescimento, diferenciação e divisão celular.Após a purificação, caracterização cinética e eletroforética da fosfoproteína tirosina fosfatase de membrana de linfócitos (CD45), verificou-se que está enzima era inibida por morina na concentração máxima de 400mM (30%) e ativada por fisetina na mesma concentração (30%), sendo estes efeitos dependentes da concentração dos flavonóides analisados. Nos testes biológicos com a linhagem de células promielocíticas (HL60) pode-se verificar que, na concentração de 200mM, fisetina e morina foram capazes de promover 90% de morte celular, tendo sido determinados os valores de IC50 para os parâmetros de viabilidade celular. Três parâmetros foram utilizados para estabelecer a viabilidade cellular: atividade de fosfatase, redução de MTT e conteúdo proteico. Os resultados obtidos foram: 50 e 150mM para a atividade de fosfatase ácida total na presença de rutina e fisetina respectivamente; 45, 190 e 80mM para redução de MTT na presença de fisetina, morina e quercetina; e não foram obtidos valores correspondentes para o conteúdo total de proteínas. Já para cultura primária de linfócitos humanos, fisetina foi o único flavonóide que apresentou efeito tóxico e determinação do IC50 para os três parâmetros de viabilidade celular sendo de 75mM (para conteúdo de proteína total), 100mM (para atividade fosfatásica) e 200mM (para redução de MTT). Por outro lado, a quercetina, na concentração acima de 10mM, promoveu um aumento de 50% na quantidade de proteína total de linfócitos, sendo um indicativo de que possa estar induzindo a proliferação celular; no entanto, sem variar os outros parâmetros. Os resultados de Westem blotting para fisetina em cultura de HL60, indicaram a capacidade deste flavonóide de promover a ativação da MAPK p38 e de inibir as MAPKs ERK e JNK, sendo que este efeito pode resultar em atividade antiproliferativa nestas células. Os testes in vivo de quercetina e morina mostraram que estes flavonóides foram capazes de induzir o aumento de expressão de proteínas no fígado (17%). De maneira geral, a morina foi capaz de diminuir as atividades da fosfatase ácida total (F A T) e da fosfatase alcalina (FAlc) em 10 e 60% respectivamente, nos rins, e da FAT e fosfatase ácida de baixa massa molecular (FAB) em 45% e 40% respectivamente, no plasma. Já a quercetina apresentou a capacidade de aumentar a atividade fosfatásica em 15% para as FAB e FAlc no figado, 15%, 18% e 75% respectivamente, para as FAlc, FAB e TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato), nos rins e 100% da atividade fosfatásica da FAB no plasma sangüíneo. Assim, podese verificar que os flavonóides quercetina e morina, possuem todas as características estruturais importantes para apresentar os efeitos biológicos analisados, e uma pequena mudança na posição de uma hidroxila no anel do catecol já foi o suficiente para que estes flavonóides apresentassem efeitos antagônicos / Abstract: Flavonoids are polyphenolic compounds largely consumed in the human diet, and can reach a dairy consumption of 1.0 gram. A great variety of in vitro and in vivo biological effects has been described for the flavonoids, such as, inhibition and alteration of the enzyme expression, antioxidant and prooxidant, synthesis and repair of DNA, apoptosis induction and antitumoral. Phosphatases are enzymes of the class of hydrolases that catalyze the dephosphoryrilation of phosphate monoesters and are divided into three main groups: protein phosphatases, acid phosphatases and alkaline phosphatases. The protein phosphatases, in conjunction with the protein kinases, are responsible for the mechanism of phosphorylation/dephosphorylation that controls the main cellular events, such as, cellular growth, differentiation and division. A protein tyrosine phosphatase - CD45 - was purified from human membrane lymphocytes through gel filtration and ion exchange chromatograhies. The purified enzyme was inhibited 30% by 400 mM of the flavonoid morin, and activated (30%) at the same concentration of fisetin, in concentration-dependent processes. Biological tests with the human mieloid leukemia cells (HL60) showed that fisetin and morin promoted 90% of cellular death. Three parameters were used to establish the cell viability: phosphatase activity, MTT reduction, and protein content. The following IC50 flavonoid concentrations were obtained: 50 e 150mM for the total acid phosphatase activity in the presence of rutin and fisetin, respectively; 45, 190 e 80mM for the MTT reduction in the presence of fisetin, morin and quercetin, respectively; none corresponding flavonoid concentration values for the total protein content were obtained. For the primary human lymphocytes cultures, fisetin was the only flavonoid that exhibit toxic effects, with the following cell viability parameters: 75mM (protein content), 100mM (phosphatase activity) and 200mM (MTT reduction). On the other hand, concentrations of quercetin higher than 10mM promoted an increase of 50% in the protein content, an indication of cell proliferation, with no changes of the other parameters. Westem blot tests for fisetin in HL60 cultures indicated a capacity of this flavonoid to promote an activation of MAPK p38 and inhibitions of MAPKs ERK and JNK; these effects in HL60 can result in an antiproliferative activity . In vivo, quercetin and morin induced an increase in the protein expression in the liver (17%). In general, morin decreased the total acid phosphatase (FAT), and alkaline phosphatase (FAlc) activities in the kidney of about 10 and 60%, respectively; and FAT and low-molecular mass acid phosphatase (FAB) of 45% and 40%, respectively, in the plasm. In contrast, quercetin increased the enzyme activities 15% for FAB and FAlc in the liver; 15%, 18% and 75%, respectively for FAlc, FAB and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the kidney; and 100% for the FAB activity in the plasm. Our results showed that the antagonic effects of quercetin and morin were related to small modifications in the structures of these flavonoids, ie, the change in the position of a hydroxyl group in the cathecol ring / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freire_AnaClaudiaGalvao_D.pdf: 5573587 bytes, checksum: 42953ae5b64a43727a0686fe5fb30d9c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A linhagem celular da leucemia promielocítica humana (HL60) foi estabelecida a partir do sangue periférico de uma paciente com leucemia promielocítica aguda. Essa cultura prolifera continuamente em suspensão, consiste predominantemente de promielócitos e tem sido utilizada como alvo para o estudo do efeito citotóxico de drogas, diferenciação e morte celular. Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade de inibidores de proteínas fosfatases (ácido okadáico e pervanadato) e da desidrocrotonina (t-DCTN) através dos seguintes parâmetros de viabilidade, após 24h de tratamento: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem do teor de proteínas (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Os dois inibidores de proteínas fosfatases apresentaram efeito citotóxico sobre as células HL60. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células apresentaram somente 20% de viabilidade em presença do ácido okadáico (100 nM) e pervanadato (200 11M). Para a t-DCTN foram obtidos os seguintes valores de ICso: 500 e 300 11M para o teor de proteína e redução do MTT, respectivamente. Outro aspecto abordado foi a relação entre o estado redox celular com uma possível indução da diferenciação e morte celular. Para este propósito foram determinados: redução do NBT, fragmentação do DNA, perda da assimetria da membrana plasmática e conteúdo total de GSH. A t-DCTN apresentou uma baixa capacidade de indução de diferenciação (20%). No entanto, na presença dos inibidores de proteínas fosfatases este efeito foi observado. A apoptose foi induzida na presença do ácido okadáico (34%) e este efeito foi aumentado em combinação com a t-DCTN (65,28%). De acordo com os resultados obtidos, sugere-se a importância da modulação química das proteínas fosfatases em diversos processos celulares, uma vez que os efeitos citotóxicos apresentados por estes compostos podem ser explicados pela alteração do estado redox celular e/ou efeito direto (formação de adutos) sobre estas enzimas ou outras macromoléculas / Abstract: patient with acute myeloid leukemia. This culture proliferates continuously in suspension and predominantly consists of promyelocytes and has been used as tool for cytotoxic studies of drugs, differentiation and cell death. ln this work was evaluated the cytotoxicity of protein phosphatases inhibitors (okadaic acid and pervanadate) and dehydrocrotonin (tDCTN) through following viability parameters, after 24h of the cells treatment: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein determination (cell number indication) and fosfatase activity (cell metabolism). Both inhibitors presented cytotoxic effect on HL60 cells. In relation to mitochondrial function and phosphatase activity, these cells presented only 20% of viability in presence of okadaic acid (100 nM) and pervanadate (200 1lM). For t-DCTN were obtained the following IC50 values: 500 and 300 mM for protein content and MTT reduction, respectively. Other approached aspect was the relation to cellular redox state with a possible differentiation and cell death induction. For this purpose were determined: NBT reduction, DNA fragmentation, the loss of plasma membrane asymmetry and total GSH. t-DCTN presented low capacity of differentiation induction (20%). However, in the presence of protein phosphatase inhibitors this effect was not observed. Apoptosis was induced when the cells were treated with okadaic acid (34%) and plus t-DCTN this effect was increased (65,28%). According to the results obtained, we can suggest the importance of chemical modulation of protein phosphatases in several cellular processes, since cytotoxic effects presented by these compounds could be explained by redox state changing and/or direct effect (adducts formation) on these enzymes or other macromolecules / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T23:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Picardi_PatyKaroll_M.pdf: 10576328 bytes, checksum: 4b3d1020e8bfdcab6dde7ac5f6e92049 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de antimaláricos na atividade das fosfatases isoladas de linfócitos humanos e a ação destes fármacos na viabilidade dos linfócitos. A atividade fosfatásica foi determinada através da dosagem do pnitrofenol e a viabilidade celular foi avaliada através de 3 parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem de proteína (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). A cloroquina não apresentou efeito significativo sobre as fosfatases de membrana, citoplasmáticas e da fração total. No entanto, o efeito inibitório de 25% sobre as fosfatases citoplasmáticas e de 30% fração total foi observado após pré incubação da enzima na presença da quinina. Ao contrário dos outros antimaláricos, a desferoxamina ativou as fosfatases da fração total (40%) e de membrana (70%). Nos estudos de citotoxicidade a cloroquina mostrou baixa citotoxicidade analisando a atividade da fosfatase total (ICso=360j.lM) e quantificação de proteína (ICso=346j.1M), quando comparada com a maior toxicidade observada para o teste do MTT (lCso=75j.1M). A quinina também apresentou uma toxicidade maior para a mitocôndria (aumento de 130% na redução do MTT), quando comparado com a quantificação da proteína e atividade fosfatásica (inibição de 40%). Nossos resultados sugerem que a ação citotóxica dos antimaláricos (quinina e cloroquina) pode ser devido a dois fatores: inibição direta de proteínas fosfatases, já que estudos cinéticos mostraram que as fosfatases predominantes em linfócitos são proteínas tirosina fosfatases e proteínas serinaltreonina fosfatases ou inibição de enzimas dependentes de grupamento sulfidrila e alteração de organelas como mitocôndria por induzirem estresse oxidativo. A desferoxamina teve uma ação ativadora sobre as proteínas fosfatases de membrana, provavelmente agindo na CD45. A presença de antioxidantes (GSH e ácido ascórbico) causou ativação das fosfatases, porém, em presença da quinina, cloroquina e desferoxamina essa ativação foi ainda maior / Abstract: The aim of this work was to verify the effect of antimalarial drugs in phosphatases isolated from human Iymphocytes and the action of these pharmaceutical drugs on Iymphocytes viability. Phosphatase activity was determined through the pnitrophenol assay and cell viability through 3 parameters: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein content (cell number index) and phosphatase activity (cell metabolism). Phosphatases from membrane and cytoplasm were not affected by chloroquine. However, an inhibitory effect on cytoplasmic phosphatases (30%) on total fraction (25%) was observed after pre-incubation of the enzyme in presence of the quinine. In contrast to other antimalarials desferoxamine, the phosphatases actived from the total fraction and membrane, 40 and 70%, respectively. In the citotoxicity studies, chloroquine showed low citotoxicity when the activity of total phosphatase (IC50=360_M) and protein content (IC50=346_M) were analysed, when compared to the toxicity observed with MTT test (IC50=75_M). Quinine also had a high toxicity for the mitochondria (130% increased MTT the reduction), when compared to protein quantification and phosphatase activity (40% inhibition). Our results suggest that the cytotoxic action of antimalarials (quinine and chloroquine) can be due to two factors: direct inhibition of protein phosphatases, since kinetic studies had shown that the predominant phosphatases in Lymphocytes are protein tyrosine phosphatases and protein serine/treonine phosphatases or inhibition of sulfhydryl group dependent enzymes and alteration of organelas such as mitochondria by inducing oxidative stress. Desferoxamine had an activator action in membrane protein phosphatases of, probably acting on the CD45. Antioxidant substances (GSH and ascorbic acid) caused activation of phosphatases, but, in presence of quinine, cloroquine and desferoxamine this activation was more significative / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmem Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_TelmaMariaAraujo_D.pdf: 6074336 bytes, checksum: e6dab7e3aafad9713e6fc89d823e83ff (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi relacionar o efeito citotóxico do ácido okadáico um potente e específico inibidor de serinaJtreonina fosfatase (PP1 e PP2A) e trans-desidrocrotonína, um 19-nor-clerodane, é o maior norditerpeno obtido da croton Cajucara; uma planta medicinal brasileira, a qual apresenta importante atividade bíologica como antineoplásica e antiulcerigênica sobre a cultura primária de linfócitos humanos com a atividade de fosfatases. Primeiramente, a fosfatase total foi caracterizada cineticamente através dos seguintes estudos: efeitos de substrato, pH, potenciais inibidores, metais e outros compostos. Nossos resultados mostraram que a fosfatase predominante nos linfócitos trata-se de uma proteína tirosina fosfatase, uma vez que hidrolisou eficientemente tirosina fosfato (60%), foi fortemente inibida pelo pervanadato (100%), vanadato (80%), p-cloromercuribenzoato (90%), coquetel inibidor de proteína tirosina fosfatase (70%) e apresentou insensibilidade ao ácido okadáico (100 nM). Nos estudos de citotoxicidade avaliamos o efeito do ácido okadáico e da desidrocrotonina, através dos seguintes parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), conteúdo total de proteínas (número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). Nos testes de citotoxicidade o ácido okadáico e a desidrocrotonina (na ausência do mitogêno) apresentaram efeito tóxico sobre linfócitos humanos quando analisados os parâmetros fosfatase e MTT com valores de ICso 47 e 100nM para o ácido okadáico; 450 fJM para a desidrocrotonina. O efeito mitogênico do OKA (10nM) sobre os linfócitos foi detectado 10 min após o tratamento com este composto, o qual causou aumento de 30% no número de células, este efeito foi inibido na presença da desidrocrotonina. Quando avaliamos o efeito da desidrocrotonina na CD45 purificada observamos uma inibição significativa. Este composto apresenta ação oxidante, portanto a inibição da fosfatase por estes compostos pode ser devido a formação de adutos. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a PTP presente nos linfócitos pode servir de forma complementar, como um parâmetro de viabilidade celular e nos fornecer informações importantes sobre o metabolismo celular / Abstract: The aim of this work was to correlate the cytotoxic effeet of Okadaic acid is a potent, speeifie inhibitor of protein serine/threonine phosphatase (PP1 and PP2A).and trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane, is the major norditerpene obtained from Croton cajueara, a Brazilian medicinal plant, which present important biological activities as antineoplasic and antiulcerogenic on the primary culture of human Iymphocytes with phosphatase activities. Firstly, the kinetic of total phosphatase from these cells was studied through the following properties: substrate specificity, optimum pH, effect of potential inhibitors, metais and compounds. Our results showed that the main phosphatase present in the cellular extract was a protein tyrosine phosphatase, once the tyrosine phosphate was effieiently hydrolized by the enzyme (60%), inhibíton by vanadate (100%), pchlromereuribenzoate (90%), PTP cocktail inhibitor and insensíbílity by okadaíc acid. The eytotoxicity studies of okadaic acid and dehydrocrotonin on human Iymphoeytes were evaluated through three endpoints of cytotoxicity: MTT reduction (mitochondrial function), protein content (cel! number indication) and phosphatase activity (cel! metabolism). Okadaic acid and dehydrocrotonin presented toxíc effects when the parameters phosphatase and MTT were analyzed, with the following ICso values: 47 and 100 nM for okadaic acid and 450 jJM for dehydrocrotonín. The mitogenic effect of OKA (10nM) was detected after 10 minutes of treatment with this compound, which inereased 30% of cell number. However, when OKA was incubated with dehydrocrotonin, the cel! proliferation was prevented. Dehydrocrotonin caused significative inhibition of CO45 purified from Iymphocyte membranes. This compound presents oxidant action, then the inhibition of PTP by dehydrocrotonin could be due the adducts formation. The results obtained in this study indicate that PTP from Iymphocytes could be utilized as parameter of cel! viability and provi de important information about cel! metabolism / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T19:01:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_CarmenVerissima_D.pdf: 6306570 bytes, checksum: 7e2d3f29ed75ce5b46cfeb7b2e85985c (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As quatro isofonnas de fosfatases ácidas purificadas de sementes de soj:quiescentes foram caracterizadas do ponto de vista fisico-químico e cinético. A isofonnas AP1, AP2, AP3A e AP3B apresentaram pontos isoelétricos de 4,9, 5,7 9,8 e 7,4, e quantidade de carboidratos totais de 30, 25, 18 e 10%, respectivamente Somente as isoformas AP 1 e AP3A apresentaram feITo em suas estruturas. As 4 isoformas apresentaram alta atividade catalítica à 80°C quando o pNPP foi utilizado como substrato, no entanto, quando TyrP foi utilizada, esta temperatura foi de 60 °C e para o PPi a temperatura máxima foi em tomo de 60°C para as isoformas AP 1 AP2 e AP3B e de 50°C para a isoformas AP3A. Estudos de estabilidade térmica foram realizados pré incubando-se as isoformas na ausência do substrato. Todas as isoformas perderam 20% da atividade quando pré incubadas a 60°C por 60 min. A 70°C as isoformas AP3A e AP3B mantiveram 30% de atividade residual. Todas a isoformas foram inativadas quando pré incubadas a 80°C. Estudos de estabilidade térmica na presença de alguns possíveis protetores, mostraram que os produtos da reação com o pNPP (pNP e fosfato) eram responsáveis pela estabilização de toda isoformas, favorecendo a alta atividade catalítica a 80°C. As 4 isoformas não foram significativamente afetadas por compostos que interagem com grupos -SH (pCMB, H2O2, CU²+), indicando a ausência de tais grupos no sítio ativo. Piridoxal fosfato também não apresentou efeito inibitório, (que mostra que estas enzimas não contêm resíduos de lisina essenciais para catálise. Todas as isoformas foram inibidas competitivamente pelo fosfato, vanadatc pervanadato, fluoreto e molibdato. A determinação das constantes de inibição (Ki revelou que o molibdato é o inibidor mais potente para todas as isoformas. A ConA apresentou efeito ativador somente para a isoformas API, o qual era dependente d4 substrato utilizado. As isoformas AP 1 e AP2 mostraram uma maior especificidade por substrato: que AP3A e AP3B. Foram realizados estudos cinéticos detalhados utilizando-S4 PEP, PPi, TyrP, Glic6P e Frut6P como substratos. Os resultados cinético: mostraram que estas isoformas poderiam participar em diferentes rotas metabólicas / Abstract: The four isoforms of acid phosphatase (AP1, AP2, AP3A and AP3B) purified from mature soybean seeds, had their physico-chemical and kinetil properties detennined. The APl, AP2, AP3A and AP3B isofonns presentel isoeIectric points of 4.9, 5.7, 9.8 and 7.4 and total carbohydrate of 30, 25, 18 anl 10%, respectiveIy. Among the four isoforms only APl and AP3A presented iron u their structures. The four isoforms of soybean seeds acid phosphatases presentel high activities, even at temperatures above 80°C when pNPP was utilized a: substrate. On the other hand, Iowest optimum temperature values were obtainec using other substrates. With tyrosine phosphate, the maximum activity was observec at 60°C, and when PPi was used as substrate, the optimum temperature values wen 60°C for APl, AP2 and AP3B, and 50°C for AP3A. In order to investigate the thermal stability of the four acid phosphatases, the enzymes were preincubated it the absence of substrate. The four isoforms Iost only 20% activity at 60°C, afier 60 min; the isoforms AP3A and AP3B retained 30% of activity at 70°C, after 60 min; alI the isoforms were inactivated at 80°C, after 5 min. In order to verify whether the enzymatic forms could be protected against thermal inactivation, we tested some compounds with different characteristics. The best protective effect was observec when the enzymes were incubated in the presence of both reaction products, p-nitrophenoI and inorganic phosphate. The soybean seeds acid phosphatases were not significantly affected by compounds that interacted with -SH residues (pCMB, H2O2, CU²+), indicating th absence of such residues in the active sites. Pyridoxal phosphate had no effecl suggesting that lysine residues were not important to the enzyme catalysis. The four acid phosphatase isoforms API, AP2, AP3A and AP3B wer competitively inhibited by phosphate, vanadate, molybdate and fluoride; inhibitio: constant studies showed that molybdate was the most potent inhibitor. The AP soform was activated by lectin (ConA), which effect was dependent on the substrat utilized. The AP 1 and AP2 isoforms showed higher substrate specificity whe: compared with AP3A and AP3B. Detailed kinetic properties were studied using PEP, PPi, TyrP, Gluc6P an, Frut6P as substrate. These studies suggest that these isoforms could participated I different metabolic routes / Doutorado / Doutor em Ciências

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:38:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Granjeiro_JoseMauro_M.pdf: 8247934 bytes, checksum: 5318589631bcde894c7e375254a1cfda (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A fosfatase ácida de BPM do rim bovino foi purificada 1.640 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 7%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, tratamento ácido e cromatografia de trocaiônica em SP-Sephadex com eluição por íon-afinidade. Os critérios de pureza utilizados foram a A.E., PAGE, SDS-PAGE, filtração em gel (Superdex HR 70) e análise da composição de aminoácidos. A enzima purificada (A.E. de 100 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 13,6 e 17,8 kDa, como determinado através da filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. A composição parcial de aminoácidos (Cys e Trp não foram determinados) foi obtida após a hidrólise ácida da proteína purificada seguida da análise dos resíduos de aminoácidos e evidenciou a existência de, pelo menos, 152 resíduos de aminoácidos. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,5 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 60°C e, nesta temperatura, maior estabilidade no pH 5,5. A atividade da enzima foi relativamente pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+ e Cu2+ e pela ativação por guanosina. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki, 0,465 µM), piridoxal-5-fosfato (Ki, 2,18 µM), fosfato inorgânico (Ki, 0,769 mM), pCMB e molibdato de amônio. A energia de ativação para a hidrólise do p-NPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 43,31 kJ.mol-1. A análise da capacidade da enzima catalisar a reação de transfosforilação demonstrou que diversos álcoois atuaram como aceptores de fosfato neste tipo de reação, tendo se destacado o glicerol e o metanol como os melhores aceptores. Dos substratos testados, o p-NPP, ß-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com KM de 0,14; 0,4; 0,3 e 7,9 mM, respectivamente. A faixa de pH ótimo para a hidrólise da Tyr-P e FMN foi de 5,0 a 5,5 / Abstract: A low molecular weight bovine kidney acid phosphatase was purified 1640 fold to homogeneity, with 7% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, acid treatment, and SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution. The following homogeneity criteria were used: specific activity, PAGE, SDS-PAGE, gel filtration (Superdex HR 70) and amino acid composition. The purified enzyme (specific activity 100 µmol mL-1mg-1) contained a singIe peptide chain and had a reIative moIecuIar mass of 13.6 and 17.8 kDa as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. The partiaI amino acid composition of this enzyme, after acid hydroIysis, showed at least 152 amino acid residues. The amino acid Cys and Trp were not determined. The p-NPP hydrolysis reaction catalyzed by this enzyme had a broad pH optimum of 4.5-5.5 and maximal activity at 60°C. In this temperature the enzyme was more stable at pH 5.5. Reducing thiol compounds, metal ions and other different compounds did not affect significantly the enzyme activity except for the inhibition by Zn2+ and Cu2+ and activation by guanosine. The enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.465 µM), pyridoxal-5-phosphate (Ki, 2.18 µM), inorganic phosphate (Ki, .769 mM), pCMB and ammonium molybdate. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. An activation energy value of 43.31 kJ.mol-1 was determined from Arrhenius plot for the hydrolysis of p-NPP reaction catalyzed by the enzyme. Both glycerol and methanol increased significantly the acid phosphatase activity, acting as good acceptors in the transphosphoryIation reaction also catalyzed by the enzyme. The apparent KM values obtained, at 37°C and pH 5.0, for the best substrates were 0.14 mM, 0.4 mM, 0.3 mM and 7.9 mM for p-NPP, ß-Naphtyl-P, FMN and Tyr-P, respectively. At the same conditions, a pH optimum value of 5.0-5.5, was obtained for the FMN- and Tyr-P-directed acid phosphatase reaction / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Marcio Hipolito / Resumo: Durante a metamorfose dos anuros, além da natação, a cauda tem como função fornecer nutrientes necessários para as transformações morfofisiológicas da fase larval aquática em adultos terrestres, pois os animais não se alimentam durante esse período. A fosfatase alcalina é uma enzima importante na mobilização do fosfato necessário para o anabolismo de biomoléculas essenciais à vida, enquanto a fosfatase ácida é uma marcadora lisossomal. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade das fosfatases ácida e alcalina obtidas da cauda de girinos de rã-touro (Lithobates catesbeianus), visando fornecer informações acerca do processo de mobilização de nutrientes durante o desenvolvimento e a metamorfose. Os animais foram mantidos em aquários a 27 °C, e separados por estádios de desenvolvimento. As caudas foram coletadas de animais em cada estádio e homogeneizadas em tampões acetato, TRIS.HCl ou 2-amino-2-metil-1-propanol, contendo MgCl2 2 mM e ZnCl2 1 μM, centrifugadas a 10000 g, durante 10 minutos, a 4°C, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 °C. A atividade de p-nitrofenilfosfatase foi estável quando as amostras homogeneizadas foram armazenadas em diferentes valores de pH, contudo, a atividade da fosfatase alcalina reduziu aproximadamente 70% após 12 horas de armazenamento no pH 4. O pH ótimo aparente para a hidrólise do p-nitrofenilfosfato pelas fosfatases ácida e alcalina foi 5,0 e 10,5, respectivamente, enquanto a hidrólise do pirofosfato de sódio e do ATP para as atividades de pirofosfatase e ATPase foram de 7,5 e 7,0. A temperatura ótima para a atividade das fosfatases ácida e alcalina foi 45°C por 15 minutos de reação. O estudo da ação de compostos sobre a atividade da fosfatase alcalina revelou que o arsenato, EDTA, metavanadato, teofilina, levamisol, íons fosfato e o p-hidroximercuriobenzoato agem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During anurans metamorphosis, besides swimming, the tail has the function to supply with nutrients the morphophysiological changes of the larval aquatic stage to terrestrial adults, because the animals do not eat during this period. Alkaline phosphatase is an important enzyme in phosphate mobilization required to the anabolism of essential biomolecules, whereas the acid phosphatase is a lysosomal marker. Thus, the aim of this study was to evaluate the activity of acid and alkaline phosphatase obtained from the tail of bullfrog tadpoles (Lithobates catesbeianus), to provide information about the process of nutrients mobilization during development and metamorphosis. The animals were kept in aquaria at 27 °C, and separated by stages. The tails were collected from animals at each stage and homogenized in acetate buffers, Tris.HCl or 2-amino-2-methyl-1-propanol, containing 2 mM MgCl2 and 1 mM ZnCl2, centrifuged at 10000 g for 10 minutes at 4 °C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. The activity of p-nitrophenylphosphatase was stable when the homogenized samples were stored at different pH values, however, alkaline phosphatase activity decreased about 70% after 12 hours of storage at pH 4. The apparent optimum pH for the hydrolysis of p-nitrophenylphosphate by acid and alkaline phosphatase was 5.0 and 10.5, respectively, while the hydrolysis of sodium pyrophosphate and ATP by the activities of pyrophosphatase and ATPase were 7.5 and 7.0. The optimum temperature for the activity of acid and alkaline phosphatases was 45 ° C for 15 minutes of reaction. The study of the action of compounds on the activity of alkaline phosphatase revealed that arsenate, EDTA, metavanadate, theophylline, levamisole, phosphate ions and p-hydroxymercurybenzoate act as inhibitors, and arsenate showed greater inhibition... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-03-18T21:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 332316.pdf: 2343461 bytes, checksum: b72cdaa5eabb7abd76a2a2792d0fe79b (MD5) Previous issue date: 2014 / O desenvolvimento de complexos modelos para centros ativos de enzimas é um dos focos da química bioinorgânica. Atualmente, objetiva-se o desenvolvimento de ligantes e subsequentemente, de complexos que representem não apenas a primeira esfera de coordenação do centro ativo da enzima, mas que efeitos de segunda esfera de coordenação também possam contribuir para aumentar a eficiência catalítica do modelo mimético. Assim, neste trabalho fez-se uma modificação estrutural de um ligante dinucleante já descrito na literatura, desenvolvido por Neves e colaboradores, seguido da síntese dos seus complexos dinucleares FeIII(µ-OH)-ZnII (1) e FeIII(µ-OH)-CuII (2). O ligante H2LHex foi preparado através de uma aminação redutiva do ligante H2py3mff desenvolvido por Neves com a 1,6-hexanodiamina e o mesmo foi caracterizado por RMN de 1H, infravermelho e ESI-MS, enquanto os complexos foram caracterizados via infravermelho, ESI-MS, condutimetria, espectrofotometria de UV-vis e eletroquímica. Estudos cinéticos da hidrólise do diéster bis(2,4-dinitrofenil)fosfato na presença de 1 ou 2 mostraram que, com a adição do modelo de segunda esfera de coordenação, a constante catalítica kcat é diminuída, porém a associação substrato-complexo é significativamente favorecida frente a complexos que abordem apenas a primeira esfera de coordenação em tais processos. Por fim, conclui-se que o papel da segunda esfera de coordenação é bastante complexo, e que, com o aprofundamento de tais estudos, deverá ser possível se obter consideráveis avanços no entendimento de tais efeitos em processos de catálise através de compostos biomiméticos.<br> / Abstract : The development of model complexes mimicking the active site of metalloenzymes is one of the main focus of research in Bioinorganic Chemistry. Currently, the development of new ligands and their complexes which besides the first-coordination-sphere of the active site, also takes into account the effects of the second-coordination-sphere to enhance catalysis, has increased significantly. This work consists on the structural modification of the dinucleating H2L ligand already described in the literature, followed by the synthesis of its dinuclear FeIII(µ-OH)-ZnII (1) and FeIII(µ-OH)CuII (2) complexes. The ligand H2LHex was prepared by a reductive amination of H2L and 1,6-hexanediamine and was characterized by 1H NMR, IR and ESI-MS while the complexes were characterized by IR, ESI-MS, conductometry, UV-vis spectrophotometry and electrochemistry. Kinetic studies on the hydrolysis of the diester substrate bis(2,4-dinitrophenyl)phosphate in presence of 1 or 2 revealed that, while the catalytic constant kcat is decreased, the association constant of the substrate-complex intermediate is significantly favored when compared to the complexes without the second-coordination-sphere effects. Finally, it is concluded that the role of the second-coordination-sphere seems to be quite complex and that such studiesshould significantly contribute to the understanding of these effects in biomimetic catalysts.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:28:58Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_am_me_araiq.pdf: 787474 bytes, checksum: 139bd29c3e4939fc72732e4ef1db4333 (MD5) / Durante a metamorfose dos anuros, além da natação, a cauda tem como função fornecer nutrientes necessários para as transformações morfofisiológicas da fase larval aquática em adultos terrestres, pois os animais não se alimentam durante esse período. A fosfatase alcalina é uma enzima importante na mobilização do fosfato necessário para o anabolismo de biomoléculas essenciais à vida, enquanto a fosfatase ácida é uma marcadora lisossomal. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade das fosfatases ácida e alcalina obtidas da cauda de girinos de rã-touro (Lithobates catesbeianus), visando fornecer informações acerca do processo de mobilização de nutrientes durante o desenvolvimento e a metamorfose. Os animais foram mantidos em aquários a 27 °C, e separados por estádios de desenvolvimento. As caudas foram coletadas de animais em cada estádio e homogeneizadas em tampões acetato, TRIS.HCl ou 2-amino-2-metil-1-propanol, contendo MgCl2 2 mM e ZnCl2 1 μM, centrifugadas a 10000 g, durante 10 minutos, a 4°C, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 °C. A atividade de p-nitrofenilfosfatase foi estável quando as amostras homogeneizadas foram armazenadas em diferentes valores de pH, contudo, a atividade da fosfatase alcalina reduziu aproximadamente 70% após 12 horas de armazenamento no pH 4. O pH ótimo aparente para a hidrólise do p-nitrofenilfosfato pelas fosfatases ácida e alcalina foi 5,0 e 10,5, respectivamente, enquanto a hidrólise do pirofosfato de sódio e do ATP para as atividades de pirofosfatase e ATPase foram de 7,5 e 7,0. A temperatura ótima para a atividade das fosfatases ácida e alcalina foi 45°C por 15 minutos de reação. O estudo da ação de compostos sobre a atividade da fosfatase alcalina revelou que o arsenato, EDTA, metavanadato, teofilina, levamisol, íons fosfato e o p-hidroximercuriobenzoato agem... / During anurans metamorphosis, besides swimming, the tail has the function to supply with nutrients the morphophysiological changes of the larval aquatic stage to terrestrial adults, because the animals do not eat during this period. Alkaline phosphatase is an important enzyme in phosphate mobilization required to the anabolism of essential biomolecules, whereas the acid phosphatase is a lysosomal marker. Thus, the aim of this study was to evaluate the activity of acid and alkaline phosphatase obtained from the tail of bullfrog tadpoles (Lithobates catesbeianus), to provide information about the process of nutrients mobilization during development and metamorphosis. The animals were kept in aquaria at 27 °C, and separated by stages. The tails were collected from animals at each stage and homogenized in acetate buffers, Tris.HCl or 2-amino-2-methyl-1-propanol, containing 2 mM MgCl2 and 1 mM ZnCl2, centrifuged at 10000 g for 10 minutes at 4 °C, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. The activity of p-nitrophenylphosphatase was stable when the homogenized samples were stored at different pH values, however, alkaline phosphatase activity decreased about 70% after 12 hours of storage at pH 4. The apparent optimum pH for the hydrolysis of p-nitrophenylphosphate by acid and alkaline phosphatase was 5.0 and 10.5, respectively, while the hydrolysis of sodium pyrophosphate and ATP by the activities of pyrophosphatase and ATPase were 7.5 and 7.0. The optimum temperature for the activity of acid and alkaline phosphatases was 45 ° C for 15 minutes of reaction. The study of the action of compounds on the activity of alkaline phosphatase revealed that arsenate, EDTA, metavanadate, theophylline, levamisole, phosphate ions and p-hydroxymercurybenzoate act as inhibitors, and arsenate showed greater inhibition... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4516_1.pdf: 562141 bytes, checksum: 80763c13e25f34576b5b0840cef70297 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Considerando o potencial do gênero Cunninghamella, o presente trabalho teve como finalidade estabelecer os aspectos fisiológicos, bioquímicos e ultraestruturais de Cunninghamella elegans cultivada em meio contendo cobre. O perfil de crescimento foi estabelecido em função da biomassa, do consumo de glicose e fosfato, pH do meio, conteúdo de polifosfato, atividade de fosfatases e remoção do metal. Os resultados obtidos indicam a influência do metal sobre o crescimento como observado pelo rendimento da biomassa. O consumo das fontes de carbono e fósforo foi semelhante para a cultura tratada e controle. A análise do perfil de polifosfato permitiu verificar comportamentos distintos na ausência e presença do metal. A análise do polifosfato celular revelou que, nas amostras tratadas, o polímero é significativamente metabolizado durante o início do cultivo pelas amostras tratadas. O isolado analisado não exibiu atividade para a fosfatase ácida. Contudo, o cultivo em presença de cobre induziu variações na expressão da fosfatase alcalina. Uma diminuição significativa da atividade enzimática foi observada para a cultura tratada com o íon metálico. Através da espectrofotometria de absorção atômica observou-se a remoção do metal do meio de cultivo ao longo do crescimento. Os resultados obtidos pela ultraestrutura demonstraram que C. elegans em presença de cobre, apresentou maior eletrondensidade, hifas mais largas e de textura mais homogênea, menor número de clamidósporos e poder de ramificação. Os estudos demonstram o potencial de C. elegans, visando sua aplicação em processos de biorremediação de ambientes poluídos por cobre