La fosfatidilcolina (PC) es uno de los glicerofosfolípidos más abundantes en las membranas celulares y es además fuente de segundos mensajeros lipídicos tales como el diacilglicerol (DAG), el ácido fosfatídico (PA), el ácido araquidónico (AA) y la lisofosfatidilcolina (LPC). Por su parte, el DAG es capaz de mediar eventos celulares claves a través de la regulación de diversas proteínas entre las que encontramos: las proteínas quinasas C (PKC), las proteínas quinasas D (PKD), las quimerinas, las proteínas liberadoras de nucleótidos de guanina de Ras (RasGRPs), las Munc13s y las DAG quinasas (DAGK). Estos efectores del DAG participan en funciones celulares como la fusión y el tráfico de las membranas, la inflamación, la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. La generación de DAG por hidrólisis de la PC se produce en respuesta a diversos estímulos celulares y es catalizada principalmente por la acción de dos vías enzimáticas: por la activación de la fosfolipasa D (PLD) (enzima que genera PA, el cual es hidrolizado a DAG por la acción de una fosfatasa de ácido fosfatídico tipo 2 o PAP2) y por la reacción catalizada por la fosfolipasa C específica para PC (PC-PLC) la cual genera DAG y fosfocolina. Los principales objetivos de la presente tesis doctoral fueron demostrar la presencia de la vía de la PC-PLC en las terminales sinápticas (sinaptosomas) de la corteza cerebral de rata y estudiar el efecto del estrés oxidativo en la generación de DAG a partir de la PC. Los resultados de esta tesis fueron divididos en dos capítulos, en la primera parte estudiamos la presencia de la PC-PLC en los sinaptosomas de ratas adultas y seniles y realizamos la caracterización de esta actividad enzimática. En los sinaptosomas (Syn) de ratas adultas los agentes tensioactivos Triton X-100 y deoxicolato de sodio (DOC) estimularon la formación del DAG observándose la máxima generación en presencia de Triton X-100 al 0,1%, concentración que incrementó la generación de DAG en un 330% con respecto al control. Por otra parte, el agregado de los iones Ca2+ (2 mM) y Mg2+ (1 mM) exógenos inhibió la formación de DAG en un 73% y en un 50% respectivamente. En presencia de etanol (2%) evaluamos la reacción de transfosfatidilación catalizada por la PLD por la cual se genera fosfatidiletanol (PEth) en lugar de PA. Dado que la PAP2 no puede hidrolizar el PEth al incluir este alcohol primario en la reacción enzimática pudimos medir la generación de DAG que proviene exclusivamente de la vía de la PC-PLC. Mediante la utilización de etanol, del inhibidor de la PC-PLC (D609) y del DL-propranolol como inhibidor de la PAP2, demostramos que ambas vías enzimáticas (PC-PLC y PLD) participan en la generación de DAG. Luego de 20 min de incubación la vía de la PLD aportó el 40% del DAG generado mientras que la PC-PLC fue responsable del 60% del DAG generado. Este mismo aporte porcentual se observó en los sinaptosomas provenientes de ratas seniles. Los ensayos cinéticos realizados en presencia de etanol permitieron determinar la constante aparente de Michaelis-Menten (KM) y velocidad máxima (Vmáx) para la PC-PLC sinaptosomal, las cuales fueron de 350 μM y 3.7 nmol DAG x (mg proteína x h)-1 respectivamente. Ensayos de Western blot utilizando un suero policlonal anti-PC-PLC de Bacillus cereus evidenciaron la presencia de dos bandas muy próximas, de un peso molecular cercano a 66 kDa, tanto en las terminales sinápticas de ratas adultas como de ratas seniles. La generación de DAG se evaluó en la fracción de membrana plasmática sinaptosomal (SPM), en esta fracción la formación de DAG fue un 73% mayor respecto a la generación en los sinaptosomas mientras que en la fracción soluble la hidrólisis de la PC a DAG fue prácticamente indetectable. Mediante la utilización de etanol demostramos que la actividad específica de la PC-PLC es un 80% mayor en la fracción SPM que en los Syn. Estudiamos también la hidrólisis de la PC en la fracción de membrana resistente a detergentes (DRMs). Esta fracción (aislada por el tratamiento de los Syn de ratas adultas y seniles con Triton X-100 1% a 4C) presentó características de rafts de membrana, ya que se encontró enriquecida en esfingomielina y colesterol, así como también en proteínas marcadoras de rafts como la caveolina y c-Src. La fracción DRM presentó además un perfil proteico diferencial al de los Syn y un enriquecimiento en la isoforma PLD1, mientras que ensayos de Slot blot mostraron que la PC-PLC se localiza en ambas fracciones. También en las DRMs se observó la generación de DAG por hidrólisis de la PC, sin embargo la presencia de etanol en el ensayo no disminuyó la formación de DAG. Estos resultados indicaron que, a pesar de encontrarse enriquecida en la isoforma PLD1, no se detectó actividad de la PLD en la fracción resistente a detergentes. Por el contrario, la actividad de la PC-PLC fue aproximadamente un 60% mayor en las DRMs con respecto a los Syn. En la segunda parte de la tesis estudiamos el efecto del estrés oxidativo inducido por Fe2+ en la hidrólisis de la PC. La incubación de los Syn de ratas adultas con FeSO4 (50μM) generó un marcado aumento en la peroxidación lipídica que se observó a partir de tiempos cortos de incubación. También se afectó la funcionalidad mitocondrial y la integridad de la membrana plasmática, aunque estos dos parámetros se vieron afectados luego de 60 min de incubación con el agente inductor de la injuria oxidativa. El tratamiento de los Syn de ratas adultas con el hierro provocó una mayor generación de DAG por hidrólisis de la PC, este aumento fue del 77, 50 y 65% luego de 5, 30 y 60 min de preincubación respectivamente. En forma contraria, la generación de ácidos grasos libres (AGL) se inhibió en un 50% luego de 5 y de 60 min de preincubación con el hierro. Evaluando la generación de DAG en presencia de etanol (actividad de la PC-PLC) y la formación de PEth como marcador de la actividad de la PLD, demostramos que ambas vías enzimáticas contribuyen a la formación de DAG bajo condiciones de estrés oxidativo. El mismo efecto en la generación de DAG y AGL se observó en las terminales sinápticas de ratas seniles. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de peroxidación lipídica en los Syn de ratas seniles con respecto a las adultas. La generación de DAG en los Syn de ratas adultas fue independiente de la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y de la actividad de tirosinas quinasas. Por otra parte, la inhibición de la fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2-PLC) disminuyó significativamente la generación de DAG en los Syn expuestos al Fe2+, sin embargo este efecto no fue mediado por la actividad de las PKCs. La inhibición de las vías metabolizadoras, DAGK y DAG lipasa (DAGL), tampoco modificó los niveles de DAG generados tanto en la condición control como en la experimental, esto se observó en los Syn de ratas adultas y seniles. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez la presencia de la PC-PLC en las terminales sinápticas de la corteza cerebral de rata. Nuestros hallazgos constituyen el primer indicio acerca de la activación de las vías de la PC-PLC y de la PLD en condiciones de estrés oxidativo en las terminales sinápticas, representando el punto de partida para el estudio del rol de estas vías de generación de segundos mensajeros lipídicos en los procesos neurodegenerativos. / Phosphatidylcholine (PC) is one of the most abundant glycerophospholipids in cellular membranes and is also the source of second lipid messengers such as diacylglycerol (DAG), phosphatidic acid (PA), arachidonic acid (AA) and lyso phosphatidylcholine (LPC). DAG can mediate key cellular events through the regulation of several proteins such as protein kinase C (PKC), protein kinase D (PKD), chimaerins, Ras guanine-releasing protein (RasGRP), Munc13 and DAG kinase (DAGK). These DAG-regulated proteins participate in cellular functions such as membrane fusion and traffic, inflammation, proliferation, differentiation and cell death. In response to several stimuli, DAG generation through PC hydrolysis can be catalyzed mainly by two enzyme pathways, namely by means of the activation of phospholipase D (PLD, which yields PA which is, in turn, hydrolyzed to DAG by a phosphatidic acid phosphatase type 2 or PAP2) or by means of the action of a PC-specific phospholipase C (PC-PLC) that generates DAG and phophocholine. In view of the above, the main objectives of this thesis were to demonstrate the presence of the PC-PLC pathway in rat cerebral cortex synaptic endings (synaptosomes) and to study the effect of oxidative stress on DAG generation from PC. The results collected were divided into two chapters. Chapter I focuses on the presence of PC-PLC in synaptosomes from adult and aged rats and it includes the characterization of this enzyme activity. It was observed that in synaptosomes (Syn) from adult rats the tensioactive agents Triton X-100 and sodium deoxycholate (DOC) stimulated DAG generation which was highest in the presence of 0.1 % Triton X-100. This concentration enhanced DAG formation by 330% with respect to the control condition. Furthermore, the addition of Ca2+ (2 mM) and Mg2+ (1 mM) decreased DAG generation by 73% and 50%, respectively. In the presence of ethanol (2%) we evaluated the transphosphatidylation reaction produced by PLD which generates phosphatidylethanol (PEth) instead of PA. Under this condition DAG generation was evaluated exclusively from PC-PLC because PEth cannot be hydrolyzed by PAP2. The use of ethanol, PC-PLC inhibitor (D609) and DL-propranolol as PAP2 inhibitor, allowed us to demonstrate that both enzyme pathways (PC-PLC and PLD) participate in DAG generation. After 20 min of incubation PLD pathway generated 40% of total DAG whereas PC PLC generated the remaining 60%. The same contribution was observed in synaptosomes from aged rats. Kinetic studies carried out in the presence of ethanol showed a KM and Vmax values for the synaptosomal PC-PLC of 350 μM and 3.7 nmol DAG x (mg protein x h)-1, respectively. Western blot analysis using an anti-PC-PLC polyclonal antibody raised against Bacillus cereus PC-PLC showed two bands with a molecular weight close to 66 kDa in synaptic endings from adult and aged rats. DAG generation was evaluated in the synaptosomal plasma membrane fraction (SPM). In this fraction DAG generation was increased by 73% with respect to that in synaptosomes. In addition, PC hydrolysis to DAG was negligible in the soluble fraction. By using ethanol it was possible to demonstrate that PC-PLC specific activity was increased by 80% in the SPM fraction with respect to Syn. We also studied PC hydrolysis in the detergent resistant membrane fraction (DRMs). This fraction, which was isolated by treating Syn of adult and aged rats with 1% Triton X-100 at 4C, evidenced characteristics similar to those of rafts, as it was enriched in sphingomyelin and cholesterol as well as in raft marker proteins such as caveolin and c-Src. The DRM fraction also showed a different protein profile from that of Syn. DRMs were also enriched in PLD1 while Slot blot assays showed that PC-PLC was located in Syn and DRM fractions. DAG formation from PC was also observed in DRMs. However, in this fraction the presence of ethanol did not decrease DAG formation. These results indicated that, despite being enriched in PLD1, PLD activity was not detected in DRM fraction. In contrast, PC-PLC activity was 60% higher in DRMs with respect to Syn. Chapter II of this thesis deals with the effect of Fe2+-induced oxidative stress on PC hydrolysis. The incubation of adult rat Syn with FeSO4 (50μM) generated a marked increase in lipid peroxidation which could be observed after short incubation times. Mitochondrial viability and plasma membrane integrity were also affected although these parameters were affected with the oxidative stress inductor after 60 min of incubbtfznÐßKn ulwE 4W#Sv{ E gï erb*was stimulated by FeSO4 (50 μM) after 5, 30 and 60 min of incubation by 77, 50 and 65%, respectively. On the other hand, free fatty acid (FFA) generation was inhibited by 50% after 5 and 60 min of incubation with iron. By measuring DAG generation in the presence of ethanol and PEth formation as a marker of PLD activity, we demonstrated that both enzyme pathways contribute to DAG formation under oxidative stress conditions. The same effect on DAG and FFA formation was observed in synaptic endings from aged rats. No differences in lipid peroxidation levels were observed in aged rats Syn with respect to adult rats. DAG generation in Syn from adult rats was independent of tyrosine kinases activity and of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. On the other hand, the inhibition of phosphatidylinositol bisphosphate-specific phospholipase C (PIP2-PLC) decreased DAG formation in Syn exposed to Fe2+. However this effect was not mediated by PKC. The inhibition of metabolizing pathways (DAGK and DAG lipase) did not modify DAG levels generated under control and experimental conditjoaf;ÞjisRas# Vved in Syn from adult and aged rats. In conclussion our results demonstrated for the first time the presence of PC-PLC in rat cerebral corte{ |lnfwicàndjkWadpnÞslgeûMer/E58findings constitute the first evidence of PC-PLC and PLC activation in Syn under oxidative stress conditions and represent the starting point for further studies aimed at understanding the role of lipid second messengers in neurodegenerative events.

Orientador: Celio Kenji Miyasaka / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T23:28:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_CarenFernandaNavarroda_M.pdf: 642682 bytes, checksum: 5ba563cf4536604afdecde132b47d3fe (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Fosfatidilcolina (PC) exerce vários efeitos no organismo humano. Este fosfolipídeo é encontrado em abundância nas membranas celulares e, juntamente com a fosfatidiletanolamina, somam mais de 75% do total de fosfolipídeos presentes nestas. A PC vem sendo utilizada em clínicas dermatológicas, de estética e emagrecimento, pois, parece ser eficaz para eliminar gordura localizada, em especial no abdome, quadril, joelhos, pescoço e pálpebras inferiores. Este trabalho teve por objetivo, estudar os efeitos da PC solubilizada em diferentes compostos (deoxicolato de sódio, etanol, detergente Tween® 80 e albumina) sobre os adipócitos epididimais isolados de ratos machos da linhagem Wistar. Atualmente, não há estudos científicos conclusivos liberando o seu uso farmacológico e, portanto, há a necessidade de mais pesquisas que definam seus mecanismos de ação. Para atingirmos o objetivo proposto, utilizou-se o método de isolamento e contagem dos adipócitos e também a determinação do glicerol no meio de incubação. Sendo assim, o tratamento que obteve maior quantidade de glicerol produzido foi o Tween® 80 e Tween® 80 + PC no tempo de incubação de 15 minutos e o DS + PC no tempo de incubação de 30 minutos / Abstract: The phosphatidylcholine (PC) has severa effects on the human body. This phospholipid is found in abundance in cell membranes and, together with phophatidylethanolamine, up over 75% of total phospholipids present in these. The PC has been used in clinical dermatology, weight loss of aesthetics and therefore appears to be effective for removing localized fat, especially in the abdomen, hips, knees, neck and lower eyelids. This work was aimed at, to study the effects of PC solubilized in different compounds (sodium deoxycholate, ethanol, Tween ® 80 detergent and albumin) on adipocytes isolated epididymis of male rats of Wistar strain. Currently, there is no conclusive scientific studies drug releasing its use and therefore there is a need for more research to define its mechanisms of action. To achieve the proposed objective, we used the method of isolation and counting of adipocytes and the determination of glycerol in the middle of incubation. Thus, the treatment they received higher amount of glycerol produced was the Tween ® 80 and Tween ® 80 + PC in the incubation period of 15 minutes and DS + PC in the incubation time of 30 minutes / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Antonio Carlos de Laurentiz / Resumo: O experimento foi conduzido no Setor de Avicultura da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, com a finalidade de avaliar o efeito da inclusão de níveis crescentes de goma de soja (0, 1, 2, 3, 4 e 5%) na alimentação de poedeiras comercias, e verificar a viabilidade econômica de sua utilização como mais um produto comercial derivado da soja. Foram utilizadas 180 poedeiras comerciais leves da linhagem Lohmann, com 40 semanas de idade, durante o período de 112 dias (quatro ciclos de 28 dias), distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado, totalizando 6 tratamentos com 5 repetições (6 aves por parcela). No experimento foram avaliados dados de parâmetros zootécnicos: porcentagem de postura (ave/dia), consumo de ração (g/ave/dia), peso dos ovos (g), conversão alimentar (kg/kg), qualidade interna e externa dos ovos e estabilidade oxidativa dos ovos. No que se refere aos parâmetros de desempenho a inclusão de 5% de goma na dieta aumentou o consumo de ração e a maior produção de ovos foi observada nos tratamentos com a inclusão de 3 e 5% de goma. Quanto ao peso médio dos ovos e massa de ovos a inclusão de goma a partir de 3% favoreceu o aumento dos mesmos. Para os parâmetros de qualidade dos ovos os tratamentos com 4 e 5% de goma foram os que apresentaram os menores valores de unidade Haugh, o aumento da coloração da gema ocorreu a partir da inclusão de 3% de goma. A estabilidade oxidativa dos ovos apresentou diferença (P<0,05) apen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by ROSEMARY PEREIRA DE PEDRO SOUZA null (rosemaryppsouza@gmail.com) on 2017-04-07T21:23:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Rosemary P. de P Souza 07-04.pdf: 1118611 bytes, checksum: 9417b9cfa0ee4b0a1002991a20e5a5f8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-17T14:40:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_rpp_me_ilha.pdf: 1118611 bytes, checksum: 9417b9cfa0ee4b0a1002991a20e5a5f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T14:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_rpp_me_ilha.pdf: 1118611 bytes, checksum: 9417b9cfa0ee4b0a1002991a20e5a5f8 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O experimento foi conduzido no Setor de Avicultura da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, com a finalidade de avaliar o efeito da inclusão de níveis crescentes de goma de soja (0, 1, 2, 3, 4 e 5%) na alimentação de poedeiras comercias, e verificar a viabilidade econômica de sua utilização como mais um produto comercial derivado da soja. Foram utilizadas 180 poedeiras comerciais leves da linhagem Lohmann, com 40 semanas de idade, durante o período de 112 dias (quatro ciclos de 28 dias), distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado, totalizando 6 tratamentos com 5 repetições (6 aves por parcela). No experimento foram avaliados dados de parâmetros zootécnicos: porcentagem de postura (ave/dia), consumo de ração (g/ave/dia), peso dos ovos (g), conversão alimentar (kg/kg), qualidade interna e externa dos ovos e estabilidade oxidativa dos ovos. No que se refere aos parâmetros de desempenho a inclusão de 5% de goma na dieta aumentou o consumo de ração e a maior produção de ovos foi observada nos tratamentos com a inclusão de 3 e 5% de goma. Quanto ao peso médio dos ovos e massa de ovos a inclusão de goma a partir de 3% favoreceu o aumento dos mesmos. Para os parâmetros de qualidade dos ovos os tratamentos com 4 e 5% de goma foram os que apresentaram os menores valores de unidade Haugh, o aumento da coloração da gema ocorreu a partir da inclusão de 3% de goma. A estabilidade oxidativa dos ovos apresentou diferença (P<0,05) apenas para os ovos provenientes do tratamento com 4% de goma armazenados sob refrigeração por 21 dias. A análise econômica mostrou maior retorno econômico com a inclusão de apenas 1% de goma de soja na dieta. / The experiment was carried in the Poultry Sector of the Universidade Estadual Paulista - UNESP, Ilha Solteira Campus, in order to evaluate the effect of inclusion of increasing levels of soy gum (0, 1, 2, 3, 4 and 5 %) In the feeding of commercial laying hens, and verify the economic viability of this use as another commercial product derived from soybean. The study used 180 Lohmann commercial laying hens with 40 week old Lohmann commercial laying hens during the period of 112 days (four cycles of 28 days), distributed in a completely randomized design, totaling 6 treatments with 5 replicates (6 birds per plot). The evaluated parameters were feed intake (g/bird/day), egg weight (g), feed conversion (kg/kg), internal and external egg quality and oxidative stability of eggs. Regarding the performance parameters, the inclusion of 5% gum in the diet increased the feed intake and, the higher egg production was observed in the treatments with the inclusion of 3 and 5% of soy gum. Regarding the average egg weight and egg mass, the inclusion of soy gum from 3% favored their increase. For egg quality parameters treatments with 4 and 5% of soy gum were the ones with the lowest values of Haugh unit, the increase of the color of the yolk occurred from the inclusion of 3% of gum. The oxidative stability of the eggs presented a difference (P<0.05) only for the eggs from the treatment with 4% of gum stored under refrigeration for 21 days. The economic analysis showed a higher economic return with the inclusion of 1% of soy gum in the diet.

Este projeto teve como objetivo geral continuar a avaliar a adequação de anfifílicos que se agregam em solução aquosa formando bicamadas, para recobrir superfícies de sílica. Em paralelo, foi objetivada a reconstituição do reconhecimento receptor-ligante, tendo como modelo o monosialogangliosídio GM1 e a enterotoxina do vibrião da cólera. Os resultados obtidos poderão se mostrar de grande valor em aplicações práticas que envolvem a construção de sistemas de detecção e quantificação de substâncias ou moléculas específicas. A adsorção e estabilidade de bicamadas contendo fosfatidilcolina (PC) ou misturas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e dipalmitoilfosfatidilcolna (DPPC) sobre a superfície de nanopartículas de sílica foi estudada através de isotermas de adsorção por dosagem do fosfato inorgânico, análises de sedimentação por imagens fotográficas e medidas dos diâmetros médios (Dz) e potenciais-zeta (&#950;) de partículas por espectroscopia de correlação de fótons. Foram avaliadas as afinidades entre as bicamadas e a superfície das nanopartículas e a estabilidade do sistema em função da força iônica, do pH e da concentração adicionada de lipídio. A afinidade das bicamadas pela superfície da sílica apresentou uma correlação com as forças de van der Waals e as pontes de hidrogênio que se formam entre os grupos químicos do anfifílico e aqueles de superfície da sílica. A formação de uma única bicamada lipídica de PC sobre a sílica foi detectada, o que levou à estabilidade coloidal do sistema particulado. As bicamadas mistas de DPPC/DODAB por sua vez apresentaram uma afinidade decrescente pela sílica com a elevação da porcentagem de DODAB na bicamada. Os dados de isoterma e de &#950; das partículas sugerem uma separação física entre o DPPC e o DODAB. O conjunto otimizado partícula de sílica/bicamada de PC (partícula biomimética) foi assim utilizado para promover a incorporação do GM1 micelar nas bicamadas, medida por fluorescência com a utilização da sonda GM1 pireno, seguida do reconhecimento e ligação da toxina da cólera (CT) ao complexo formado. A transferência do GM1 das micelas para as partículas se mostrou dependente da disponibilidade de bicamadas adsorvidas nestas e da ausência de bicamadas não-adsorvidas, livres em dispersão. Para avaliar a ligação da toxina da cólera às partículas biomiméticas foram calculadas isotermas de adsorção a partir da dosagem de proteína não ligada que resta no sobrenadante. A ligação específica da CT na presença de bicamadas de PC e GM1 foi de 67% em massa do total da proteína adicionada, revelando uma ligação positiva entre receptor e ligante. A estequiometria revela que a proporção molar PC: GM1: CT é de 300: 5: 1 respectivamente. A proporção de 1 CT: 5 GM1 está de acordo com a literatura onde experimentos de difração de raios-X mostram a estrutura tridimensional do pentâmero CTB5 ligado a cinco unidades de pentasacarídeo do GM1. / The general objective of this project was to continue evaluating the suitability of amphiphiles that aggregate in aqueous solution forming bilayers, to cover surfaces of silica. A secondary objective pursued was to promote the reconstitution of the receptor-ligand function, having as a model the monosialoganglioside GM1 and the enterotoxin of the choleric vibrio. The results may prove to be valuable in pure research or practical applications for sensing and detection of biomolecules. The adsorption and stability of phosphatidylcholine (PC) bilayers or mixtures of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) over surfaces of silica nanoparticles were evaluated through adsorption isotherms by inorganic phosphate dosage, sedimentation analysis by means of photographic images and measurements of hydrodynamic diameter (Dz) and zeta-potentials (&#950;) of particles by photon correlation spectroscopy. The affinity between the bilayers and the nanoparticles surfaces and the general system stability were evaluated as a function of ionic strength, pH and added lipid concentration. The affinity showed a correlation with the van der Waals and the hydrogen bridges forces that form between the chemical groups of the amphiphile and the silica surface. The formation of a single lipid PC bilayer over the silica was detected, leading to the colloidal stability of the particulate system. Mixed bilayers of DPPC/DODAB on the other hand showed a decreasing affinity for silica with an increasing DODAB percentage in the bilayer. Data from isotherms and &#950; of particles suggests a physical separation of the DPPC and DODAB. The optimized array of silica particle/PC bilayer (biomimetic particles) was thus used to promote the incorporation of micellar GM1 into the bilayers, measured by fluorescence with a GM1 pirene probe, followed by the cholera toxin (CT) binding to the resulting array. GM1 transfer from micelles to particles showed dependence on the adsorbed bilayers availability and on the absence of non-adsorbed bilayers, free in the bulk solution. To evaluate CT binding to biomimetic particles adsorption isotherms were calculated from the dosage of unbound protein remaining in the supernatant. Specific binding of CT in the presence of PC and GM1 bilayer was 67% mass of total protein added, indicating a positive binding between receptor and ligand. Stoichiometry revealed that the molar proportion PC: GM1: CT is 300: 5: 1 respectively. The proportion of 1 CT: 5 GM1 is in good agreement with data in the literature where X-ray diffraction tests show the 3-dimensional structure of the CTB5 pentamer bound to five units of the pentasaccharide GM1.

A astaxantina (AST) é um carotenóide derivado do &#946;-caroteno produzido por algas e cianobactérias, mas que também pode ser encontrada em animais marinhos. Em animais, é reportada como interceptadora de radicais de oxigênio mais eficiente que o &#946;-caroteno. O objetivo central dessa dissertação foi avaliar a capacidade antioxidante da AST em lipossomos enriquecidos com citocromo c (cit c) desafiados com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), um doador de óxido nítrico, em diferentes microambientes (pH e composição das vesículas). Diferenças na interação destas vesículas com o cit c periférico, com reflexos na atividade antioxidante da AST também foram avaliadas. O SIN-1 gera, por termólise, quantidades equimolares de radical superóxido e óxido nítrico, quando há oxigênio no meio. Vesículas unilamelares de fosfatidilcolina (PC), PC contendo 5% ou 10% de fosfatidilglicerol (PG), com ou sem AST, foram incubadas com SIN-1 e/ou cit c. Medidas do índice de lipoperoxidação pelo teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelaram que SIN-1 não causa aumento de TBARS, enquanto o cit c foi capaz de aumentar significativamente este índice. Este fato pode ser explicado pela atividade peroxidásica do cit c. Apenas em vesículas de PCPG10%, ao realizar a incubação do cit c concomitantemente com SIN-1, o índice de TBARS foi maior ao observado em vesículas incubadas apenas com cit c. É conhecido que a interação entre cit c e membranas aniônicas pode alterar a conformação da proteína, aumentando sua atividade peroxidásica. A presença da AST fez com que os índices de lipoperoxidação chegassem a valores próximos aos do controle. A alteração no pH do meio revelou que a AST possui ação antioxidante mais pronunciada em pHs 7,4 e 8,0, em comparação com pHs levemente ácidos. A presença de PG evidenciou ainda mais esta tendência e em pH 6,2, a AST apresentou inclusive pequena atividade próoxidante. Estes resultados podem ser discutidos à luz de alterações da permeabilidade da membrana e da reatividade de espécies reativas induzidas por mudanças da fluidez e de pH. O efeito dos produtos gerados por SIN-1 sobre o cit c foi estudado em condições de normóxia e hipóxia. Resultados de EPR e de fluorescência demonstram que a presença do radical superóxido previne lesões oxidativas causada por peróxido orgânico (t-butOOH) tanto no cit c quanto nas membranas, pois é capaz de reduzir o ferro hemínico do cit c. Através de CD e espectrofotometria UV-Vis e EPR, foi observado que a incubação com SIN-1 promove alterações estruturais no cit c causando ruptura na sexta coordenação do ferro hemínico, levando à geração de uma espécie de cit c com rombicidade menor em comparação ao cit c nativo e que apresenta maior atividade peroxidásica. Este trabalho contribui com informações para entendimento do mecanismo antioxidante da AST em diferentes microambientes, além de demonstrar o efeito paradoxal do superóxido que é capaz de proteger o cit c, através da redução do ferro hemínico, mas também pode expor a proteína à oxidação promovida por peroxinitrito. / Astaxanthin (AST) is a &#946;-carotene derived carotenoid, produced by algae and cyanobacteria, but can also be found in marine animals. In phytoplankton it has the function to absorb light radiation for photosinthesys occurence. In animals AST acts as a scavenger of oxygen free radicals, even more efficiently than &#946;-carotene itself. The main objective of this work is to evaluate the antioxidant capacity of AST over cytochrome c (cyt c) incorporated in liposomes and challenged with 3-morpholinosidnonimine (SIN-1), a nitric oxide donor, under different experimental conditions, namely vesicles composition and pH. Distinct interactions between cyt c and vesicles affecting the AST antioxidant activity were also evaluated. SIN-1 spontaneously generates equal amount of nitric oxide and superoxide anion when oxygen is present. Unilamellar vesicles made from phosphatidylcholine (PC) or PC with 5% or 10% of phosphatidylglycerol (PG), with or without AST, were incubated with SIN-1 and/or cyt c. The extent of lipid peroxidation was evaluated by the classical method of thiobarbituric reactive substances (TBARS). Control experiments with SIN-1 alone showed no increase in TBARS content, whereas cyt c significantly increased TBARS. Concomitant addition of cyt c, SIN-1 to PCPG10% vesicles led to lipid peroxidation indices even higher than those found when cyt c was incubated with PCPG10% vesicles. A peroxidase activity of cyt c resulting from the interaction between this protein and anionic membranes can explain this result. In this system, the presence of AST inhibited formation of TBARS, whose levels were near the control values. Astaxanthin was found to exhibit a more effective antioxidant capacity under basic pH (7.4 and 8.0), in comparison with pH 6.2 and 6.8. In the presence of PG, this trend became more evident. Interestingly, at pH 6.2, AST showed a slight pro-oxidant activity. These results can be explained by differences in membrane permeability and reactivity of reactive species, caused by pH and membrane fluidity alterations. The effects of products of SIN-1 decomposition on cyt c structure and its peroxidase activity were investigated under hypoxia and normoxia. EPR and fluorescence experiments revealed that superoxide anion radical, due to its ability to reduce heme iron, prevents oxidative damage of cyt c and membrane lipids by peroxide-derived free radicals. By means of CD and UV-Visible spectroscopy, we have found that concomitant incubation of SIN-1 and cyt c promoted structural alterations in the protein which changes the irons sixth axial coordination, leading to generation of a less rhombic cyt c, which is reportedly a better peroxidase than native cyt c. This work contributes with information aiming to better understand the antioxidant mechanism of AST under different membrane microenvironments and unveil a paradoxal effect of superoxide ion, which can protect cyt c from oxidative lesions by transferring electron to ferricyt c, but can also expose cyt c to oxidation by peroxynitrite.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

Este projeto teve como objetivo geral continuar a avaliar a adequação de anfifílicos que se agregam em solução aquosa formando bicamadas, para recobrir superfícies de sílica. Em paralelo, foi objetivada a reconstituição do reconhecimento receptor-ligante, tendo como modelo o monosialogangliosídio GM1 e a enterotoxina do vibrião da cólera. Os resultados obtidos poderão se mostrar de grande valor em aplicações práticas que envolvem a construção de sistemas de detecção e quantificação de substâncias ou moléculas específicas. A adsorção e estabilidade de bicamadas contendo fosfatidilcolina (PC) ou misturas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e dipalmitoilfosfatidilcolna (DPPC) sobre a superfície de nanopartículas de sílica foi estudada através de isotermas de adsorção por dosagem do fosfato inorgânico, análises de sedimentação por imagens fotográficas e medidas dos diâmetros médios (Dz) e potenciais-zeta (&#950;) de partículas por espectroscopia de correlação de fótons. Foram avaliadas as afinidades entre as bicamadas e a superfície das nanopartículas e a estabilidade do sistema em função da força iônica, do pH e da concentração adicionada de lipídio. A afinidade das bicamadas pela superfície da sílica apresentou uma correlação com as forças de van der Waals e as pontes de hidrogênio que se formam entre os grupos químicos do anfifílico e aqueles de superfície da sílica. A formação de uma única bicamada lipídica de PC sobre a sílica foi detectada, o que levou à estabilidade coloidal do sistema particulado. As bicamadas mistas de DPPC/DODAB por sua vez apresentaram uma afinidade decrescente pela sílica com a elevação da porcentagem de DODAB na bicamada. Os dados de isoterma e de &#950; das partículas sugerem uma separação física entre o DPPC e o DODAB. O conjunto otimizado partícula de sílica/bicamada de PC (partícula biomimética) foi assim utilizado para promover a incorporação do GM1 micelar nas bicamadas, medida por fluorescência com a utilização da sonda GM1 pireno, seguida do reconhecimento e ligação da toxina da cólera (CT) ao complexo formado. A transferência do GM1 das micelas para as partículas se mostrou dependente da disponibilidade de bicamadas adsorvidas nestas e da ausência de bicamadas não-adsorvidas, livres em dispersão. Para avaliar a ligação da toxina da cólera às partículas biomiméticas foram calculadas isotermas de adsorção a partir da dosagem de proteína não ligada que resta no sobrenadante. A ligação específica da CT na presença de bicamadas de PC e GM1 foi de 67% em massa do total da proteína adicionada, revelando uma ligação positiva entre receptor e ligante. A estequiometria revela que a proporção molar PC: GM1: CT é de 300: 5: 1 respectivamente. A proporção de 1 CT: 5 GM1 está de acordo com a literatura onde experimentos de difração de raios-X mostram a estrutura tridimensional do pentâmero CTB5 ligado a cinco unidades de pentasacarídeo do GM1. / The general objective of this project was to continue evaluating the suitability of amphiphiles that aggregate in aqueous solution forming bilayers, to cover surfaces of silica. A secondary objective pursued was to promote the reconstitution of the receptor-ligand function, having as a model the monosialoganglioside GM1 and the enterotoxin of the choleric vibrio. The results may prove to be valuable in pure research or practical applications for sensing and detection of biomolecules. The adsorption and stability of phosphatidylcholine (PC) bilayers or mixtures of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) over surfaces of silica nanoparticles were evaluated through adsorption isotherms by inorganic phosphate dosage, sedimentation analysis by means of photographic images and measurements of hydrodynamic diameter (Dz) and zeta-potentials (&#950;) of particles by photon correlation spectroscopy. The affinity between the bilayers and the nanoparticles surfaces and the general system stability were evaluated as a function of ionic strength, pH and added lipid concentration. The affinity showed a correlation with the van der Waals and the hydrogen bridges forces that form between the chemical groups of the amphiphile and the silica surface. The formation of a single lipid PC bilayer over the silica was detected, leading to the colloidal stability of the particulate system. Mixed bilayers of DPPC/DODAB on the other hand showed a decreasing affinity for silica with an increasing DODAB percentage in the bilayer. Data from isotherms and &#950; of particles suggests a physical separation of the DPPC and DODAB. The optimized array of silica particle/PC bilayer (biomimetic particles) was thus used to promote the incorporation of micellar GM1 into the bilayers, measured by fluorescence with a GM1 pirene probe, followed by the cholera toxin (CT) binding to the resulting array. GM1 transfer from micelles to particles showed dependence on the adsorbed bilayers availability and on the absence of non-adsorbed bilayers, free in the bulk solution. To evaluate CT binding to biomimetic particles adsorption isotherms were calculated from the dosage of unbound protein remaining in the supernatant. Specific binding of CT in the presence of PC and GM1 bilayer was 67% mass of total protein added, indicating a positive binding between receptor and ligand. Stoichiometry revealed that the molar proportion PC: GM1: CT is 300: 5: 1 respectively. The proportion of 1 CT: 5 GM1 is in good agreement with data in the literature where X-ray diffraction tests show the 3-dimensional structure of the CTB5 pentamer bound to five units of the pentasaccharide GM1.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

A astaxantina (AST) é um carotenóide derivado do &#946;-caroteno produzido por algas e cianobactérias, mas que também pode ser encontrada em animais marinhos. Em animais, é reportada como interceptadora de radicais de oxigênio mais eficiente que o &#946;-caroteno. O objetivo central dessa dissertação foi avaliar a capacidade antioxidante da AST em lipossomos enriquecidos com citocromo c (cit c) desafiados com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), um doador de óxido nítrico, em diferentes microambientes (pH e composição das vesículas). Diferenças na interação destas vesículas com o cit c periférico, com reflexos na atividade antioxidante da AST também foram avaliadas. O SIN-1 gera, por termólise, quantidades equimolares de radical superóxido e óxido nítrico, quando há oxigênio no meio. Vesículas unilamelares de fosfatidilcolina (PC), PC contendo 5% ou 10% de fosfatidilglicerol (PG), com ou sem AST, foram incubadas com SIN-1 e/ou cit c. Medidas do índice de lipoperoxidação pelo teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelaram que SIN-1 não causa aumento de TBARS, enquanto o cit c foi capaz de aumentar significativamente este índice. Este fato pode ser explicado pela atividade peroxidásica do cit c. Apenas em vesículas de PCPG10%, ao realizar a incubação do cit c concomitantemente com SIN-1, o índice de TBARS foi maior ao observado em vesículas incubadas apenas com cit c. É conhecido que a interação entre cit c e membranas aniônicas pode alterar a conformação da proteína, aumentando sua atividade peroxidásica. A presença da AST fez com que os índices de lipoperoxidação chegassem a valores próximos aos do controle. A alteração no pH do meio revelou que a AST possui ação antioxidante mais pronunciada em pHs 7,4 e 8,0, em comparação com pHs levemente ácidos. A presença de PG evidenciou ainda mais esta tendência e em pH 6,2, a AST apresentou inclusive pequena atividade próoxidante. Estes resultados podem ser discutidos à luz de alterações da permeabilidade da membrana e da reatividade de espécies reativas induzidas por mudanças da fluidez e de pH. O efeito dos produtos gerados por SIN-1 sobre o cit c foi estudado em condições de normóxia e hipóxia. Resultados de EPR e de fluorescência demonstram que a presença do radical superóxido previne lesões oxidativas causada por peróxido orgânico (t-butOOH) tanto no cit c quanto nas membranas, pois é capaz de reduzir o ferro hemínico do cit c. Através de CD e espectrofotometria UV-Vis e EPR, foi observado que a incubação com SIN-1 promove alterações estruturais no cit c causando ruptura na sexta coordenação do ferro hemínico, levando à geração de uma espécie de cit c com rombicidade menor em comparação ao cit c nativo e que apresenta maior atividade peroxidásica. Este trabalho contribui com informações para entendimento do mecanismo antioxidante da AST em diferentes microambientes, além de demonstrar o efeito paradoxal do superóxido que é capaz de proteger o cit c, através da redução do ferro hemínico, mas também pode expor a proteína à oxidação promovida por peroxinitrito. / Astaxanthin (AST) is a &#946;-carotene derived carotenoid, produced by algae and cyanobacteria, but can also be found in marine animals. In phytoplankton it has the function to absorb light radiation for photosinthesys occurence. In animals AST acts as a scavenger of oxygen free radicals, even more efficiently than &#946;-carotene itself. The main objective of this work is to evaluate the antioxidant capacity of AST over cytochrome c (cyt c) incorporated in liposomes and challenged with 3-morpholinosidnonimine (SIN-1), a nitric oxide donor, under different experimental conditions, namely vesicles composition and pH. Distinct interactions between cyt c and vesicles affecting the AST antioxidant activity were also evaluated. SIN-1 spontaneously generates equal amount of nitric oxide and superoxide anion when oxygen is present. Unilamellar vesicles made from phosphatidylcholine (PC) or PC with 5% or 10% of phosphatidylglycerol (PG), with or without AST, were incubated with SIN-1 and/or cyt c. The extent of lipid peroxidation was evaluated by the classical method of thiobarbituric reactive substances (TBARS). Control experiments with SIN-1 alone showed no increase in TBARS content, whereas cyt c significantly increased TBARS. Concomitant addition of cyt c, SIN-1 to PCPG10% vesicles led to lipid peroxidation indices even higher than those found when cyt c was incubated with PCPG10% vesicles. A peroxidase activity of cyt c resulting from the interaction between this protein and anionic membranes can explain this result. In this system, the presence of AST inhibited formation of TBARS, whose levels were near the control values. Astaxanthin was found to exhibit a more effective antioxidant capacity under basic pH (7.4 and 8.0), in comparison with pH 6.2 and 6.8. In the presence of PG, this trend became more evident. Interestingly, at pH 6.2, AST showed a slight pro-oxidant activity. These results can be explained by differences in membrane permeability and reactivity of reactive species, caused by pH and membrane fluidity alterations. The effects of products of SIN-1 decomposition on cyt c structure and its peroxidase activity were investigated under hypoxia and normoxia. EPR and fluorescence experiments revealed that superoxide anion radical, due to its ability to reduce heme iron, prevents oxidative damage of cyt c and membrane lipids by peroxide-derived free radicals. By means of CD and UV-Visible spectroscopy, we have found that concomitant incubation of SIN-1 and cyt c promoted structural alterations in the protein which changes the irons sixth axial coordination, leading to generation of a less rhombic cyt c, which is reportedly a better peroxidase than native cyt c. This work contributes with information aiming to better understand the antioxidant mechanism of AST under different membrane microenvironments and unveil a paradoxal effect of superoxide ion, which can protect cyt c from oxidative lesions by transferring electron to ferricyt c, but can also expose cyt c to oxidation by peroxynitrite.