CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os venenos de serpentes contem substÃncias biologicamente ativas, primariamente consistindo de proteÃnas (90-95%). Algumas delas apresentam atividade enzimÃtica como as fosfolipases A2 e L-aminoÃcido oxidase. O presente estudo verificou a aÃÃo dos venenos de Bothrops leucurus (BleuVT) e Bothrops marajoensis (BmarVT), e suas fraÃÃes PLA2 (BleuPLA2 e BmarPLA2) e LAAO (BleuLAAO e BmarLAAO) sobre cepas de bactÃria, C. albicans, Leishmania sp e T. cruzi, bem com sua toxicidade sobre macrÃfagos murinos. A susceptibilidade das cepas bacterianas e fÃngica foi analisada atravÃs do mÃtodo de difusÃo em Ãgar, para determinaÃÃo do potencial antimicrobiano; e microdiluiÃÃo em caldo, para determinaÃÃo da CIM e CLM, com modificaÃÃes. A atividade antiparasitÃria foi avaliada atravÃs do tratamento das culturas de parasitos com diferentes concentraÃÃes dos venenos ou de suas fraÃÃes. As formas promastigotas de Leishmania sp. foram cultivadas, durante 72h, em meio NNN/Schneider a 28ÂC; e as formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT, durante 5 dias, a 28ÂC. Os macrÃfagos foram cultivados em meio RPMI 1640, em presenÃa de diferentes concentraÃÃes dos venenos e fraÃÃes, durante 24h, e submetidos ao ensaio com MTT. Os resultados foram estatisticamente analisados atravÃs do teste t ou ANOVA seguida do teste Bonferroni, quando apropriado, com p<0.05. A BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento bacteriano do Gram-negativo P. aeruginosa, da levedura C. albicans e do Gram-positivo S. aureus; e o BleuTV inibiu o crescimento de S. aureus, sendo a inibiÃÃo dose-dependente. A ordem de susceptibilidade dos microorganismos testados com BmarLAAO foi S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. Por outro lado o BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO nÃo apresentaram nenhum grau de inibiÃÃo sobre as cepas em estudo. O potencial inibitÃrio foi mais significante sobre S. aureus apresentando CIM= 50Âg/mL e CLM=200Âg/mL para BmarLAAO, e CIM=CLM=25Âg/mL para BleuTV. Em concentraÃÃes maiores que 1.56Âg/mL a BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. chagasi e L.amazonensis, sendo os valores de IC50, apÃs 72h de cultivo, para L. amazonenis, 2.55Âg/mL e 2.86 Âg/mL para L. chagasi. BmarTV e BleuTV tambÃm apresentaram significante inibiÃÃo sobre o crescimento parasitÃrio, sendo os valores de IC50 86.56 Âg/mL para L. amazonensis e 79.02Âg/mL para L. chagasi, quando tratado com BmarTV; e 5.49Âg/mL para L. amazonensis e 1.94Âg/mL para L. chagasi, quando tratado com BleuTV. Os venenos e BmarLAAO mostraram efeito inibitÃrio sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Os valores de IC50 para BleuTV, BmarTV e BmarLAAO foram, respectivamente, 1.14Âg/mL, 24.19Âg/mL e 0.89Âg/mL. As fraÃÃes BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO nÃo foram capazes de promover nenhum efeito inibitÃrio sobre os parasitos em estudo. O BmarLAAO , BmarTV e BleuTV apresentaram baixa toxicidade sobre macrÃfagos nas concentraÃÃes estudadas. Em conclusÃo, os veneno de B. leucurus e de B. marajoensis, bem como a L-aminoÃcido oxidase de Bothrops marajoensis mostraram ser capazes de interferir no crescimento de diferentes microorganismos como S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa, Leishmania sp. e T. cruzi. / Snakes venoms contain biologically active substances primarily consisting of proteins (90-95%). Some of these present enzymatic activities, such as phospholipases A2 and the L-amino acid oxidases. In this study we verify the action of Bothrops leucurus (BleuTV) and Bothrops marajoensis (BmarTV) venoms, and fractions PLA2 (BleuPLA2 and BmarPLA2) and LAAO (BleuLAAO and BmarLAAO) on strains of bacteria, yeast, Leishmania sp and T. cruzi. The susceptibility of bacterial and yeast strains was analyzed through disc-diffusion assay, for determination of antimicrobial potential; and the microdilution method, for determination of MIC and MLC, with modifications. The antiparasitic activity was evaluated through of the culture treatment of parasites with different concentrations of venoms or their fractions. The forms promastigotes of Leishmania sp. had been cultived, during 72h, in NNN/Schneider media, 28ÂC; and the forms epimastigotes of T. cruzi had been cultived in LIT media, during 5d, 28ÂC. The macrophages were cultured in RPMI 1640 media, during 24h, 37ÂC and 5% of CO2, with different concentrations of venoms or fractions. After, they were analyzed by MTT method. The results was statistically analyzed with t test or ANOVA followed the Bonferroniâs test, when appropriated, with p<0.05. The BmarLAAO was able to inhibit the growth of gram negative P. aeruginosa, of yeast C. albicans and of gram positive S. aureus; and the BleuTV inhibited the growth of S. aureus, being the inhibitions dose-dependent. The order of susceptibility of microorganisms tested against BmarLAAO was S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. On the other hand the BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not provided any degree of inhibition on strains in study. The inhibitory effect was more significant on S. aureus presenting CIM= 50Âg/mL and CLM=200Âg/mL for BmarLAAO, and CIM=CLM=25Âg/mL for the BleuTV. In concentrations greater than 1.56Âg/mL BmarLAAO was able to inhibit the growth of promastigotes forms of L. chagasi and L.amazonensis, after 72h of culture. The IC50 values were 2.55Âg/mL for L. amazonenis, and 2.86 Âg/mL for L. chagasi. BmarTV and BleuTV also provided significant inhibition of the parasitic growth, with an IC50 value of 86.56 Âg/mL for L. amazonensis and 79.02 Âg/mL for L. chagasi, when treated with BmarTV; and 5.49Âg/mL for L. amazonensis and 1.94Âg/mL for L. chagasi, when treated with BleuTV. The venoms and BmarLAAO showed inhibitory effect on epimastigotes forms of T. cruzi. The IC50 value for BleuTV, BmarTV and BmarLAAO where, respectively 1.14Âg/mL, 24.19Âg/mL and 0.89Âg/mL.This effects presented behavior dose-dependent. The fractions BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not been capable to promote any inhibition on the growth of these parasites. The BmarLAAO, BmarTV and BleuTV presented low toxicity in studied concentrations. In conclusion, the whole venoms as well as the L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis showed to be capable to interfere in the growth of several microorganisms as S.aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Leishmania sp. and T. cruzi.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva que causa comprometimento cognitivo e demência. O diagnóstico é baseado em parâmetros clínicos, mas sua confirmação é post-mortem, após avaliação patológica durante a autópsia. Os tratamentos disponíveis para a DA são os inibidores da colinesterase (IChEs) e os antagonistas de receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), sendo que os IChEs compõe o principal grupo. Diversos estudos tem mostrado um efeito neuroprotetor dos IChEs, levando a alterações na patogênese da DA. Avaliar e mensurar essas alterações são papeis atribuídos aos biomarcadores. Neste sentido podemos destacar a fosfolipase A2 (PLA2), a principal responsável pelo metabolismo de fosfolípides de membrana, e que tem sido achada diminuída na DA, assim como a glicogênio sintase-quinase (GSK), responsável pela fosforilação da proteína Tau, que é um dos processos alterados na DA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com IChE sobre a atividade da PLA2 e expressão da GSK3B em plaquetas de 30 pacientes com DA após 3 e 6 meses de tratamento. Como grupo controle foram investigados 42 individuos idosos sem doença neurodegenerativa. Encontramos nos pacientes com DA antes do tratamento uma diminuição da atividade da iPLA2 quando comparada ao grupo controle. Após três e seis meses de tratamento a PLA2 aumentou, voltando ao nível dos controles. Os pacientes que apresentaram um aumento maior da iPLA2 apos 3 meses de tratamento apresentaram melhora cognitiva mais marcante após seis meses de tratamento, avaliado pelo CAMCOG. Apos 6 meses de tratamento encontramos um inativação da GSK3B, medida por um aumento em sua forma fosforilada. Nossos resultados sugerem que o donepezil apresenta propriedades modificadoras na doença de Alzheimer, e ainda que a medida da atividade da iPLA2 poderia ser usada como marcador de resposta terapêutica ao donepezil e, possivelmente, a outros IChEs, na doença de Alzheimer / Alzheimer\'s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder that causes dementia and cognitive impairment. The Diagnosis is based on clinical parameters, but confirmation is post-mortem after pathologic evaluation during autopsy. The treatments available for AD are cholinesterase inhibitors (IChEs) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonists. The main group comprises the IChEs. Several studies have shown a neuroprotective effect of IChEs, leading to alterations in the pathogenesis of AD. Evaluate and measure these changes are assigned to biomarkers. In this regard we can highlight the phospholipase A2 (PLA2) the main enzyme in membrane phospholipids metabolism and that has been found decreased in AD as well as Glycogen Synthase kinase (GSK), a major responsible for tau phosphorylation which is one processes altered in AD. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with IChE on PLA2 activity and GSK3B expression in platelet of 30 AD patients after 3 and 6 months of treatment. The control group comprised 42 elderly individuals without neurodegenerative disease The results obtained were a decreased iPLA2 activity in patients with AD before treatment as compared to controls. After 3 and 6 months of treatment, we observed a significant increase in iPLA2 activity, restoring enzymatic activity similar to that observed among control. The patients who showed higher iPLA2 activity in the first three months were those showing cognitive improvement after six months of treatment, measured by CAMCOG. After 6 months of treatment a GSK3B inactivation were found, measured by an increase in its phosphorylated form. Our results suggest that donepezil present modifying properties in Alzheimer disease and that iPLA2 activity measurement could be used as a marker of therapeutic response to donepezil and possibly other IChEs in Alzheimer\'s disease

Os envenenamentos ofídicos constituem um problema relevante de saúde pública em diversas regiões do mundo, particularmente em países da zona tropical e neotropical. A fisiopatologia do acidente ofídico é constituída por uma série de eventos complexos tanto a nível local quanto sistêmico, e o soro antiofídico é o único tratamento utilizado. No entanto, os efeitos tóxicos locais induzidos durante o envenenamento por serpentes, principalmente do gênero Bothrops, não são eficientemente neutralizados pela soroterapia tradicional. Por esta razão, procuram-se alternativas complementares, como as plantas medicinais antiofídicas que são usadas por comunidades que não têm acesso a soroterapia. A flora brasileira possui uma ampla variedade de plantas medicinais com potencial antiofídico, as quais têm sido pouco estudadas cientificamente. Neste estudo foram realizados ensaios in vitro e in vivo de neutralização de peçonhas ofídicas com o extrato aquoso das entrecascas de Anacardium humile (EAAh), e, o isolamento e a caracterização fitoquímica de um inibidor de miotoxinas, o ácido gálico (AG). Para os ensaios de inibição, foram utilizadas soluções contendo peçonha bruta ou toxina isolada misturadas com diferentes quantidades de extrato vegetal que foram previamente incubadas por 30 min a 37°C. Também foi realizada administração do extrato após o envenenamento em diferentes intervalos de tempo para os testes de inibição da miotoxicidade. Observou-se que EAAh tem atividade inibitória sobre os efeitos tóxicos (letalidade, miotoxicidade, e hemorragia) e farmacológicos/enzimáticos (edema, atividade fosfolipásica e coagulante) induzidos pelas peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e das toxinas isoladas. O extrato vegetal inibiu 100% a letalidade induzida pela peçonha de C. d. terrificus e sua principal neurotoxina, a crotoxina. O EAAh foi submetido a fracionamento cromatográfico analítico, e em condições polares foi possível identificar e isolar o ácido gálico, o qual demonstrou tempo de retenção e espectros de ressonância magnética nucleares similares ao padrão comercial e a dados de literatura deste mesmo composto, respectivamente. O ácido gálico isolado foi capaz de inibir a atividade miotóxica induzida pela peçonha bruta de B. jararacussu e sua principal miotoxina, a bothropstoxina-I, uma PLA2-símile Lys49. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido gálico forma um complexo com a BthTX-I de B. jararacussu em seu sítio ativo, inibindo sua atividade tóxica. A ligação do ácido gálico com as miotoxinas não modificou nem a forma e nem a intensidade dos espectros de dicroísmo circular, não induzindo alterações significativas na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária destas proteínas. O ácido gálico assim como outros taninos, tem revelado-se um bom inibidor das ações tóxicas de peçonhas de serpentes e está relacionado com a ação inibitória do extrato de Anacardium humile. / Ophidian envenomations are a significant problem of public health in several regions of the world, particularly in tropical and neotropical countries. The pathophysiology of snakebite accidents is constituted by a complex series of events both locally and systemically, and the antivenom serum is the only treatment used. However, local toxic effects induced during envenomation by snakes, especially from the genus Bothrops, are not effectively neutralized by the traditional serum therapy. For this reason, additional alternatives are made necessary, such as the use of medicinal plants that are used by communities with no access to serum therapy. The Brazilian flora possesses a wide variety of medicinal plants with antiophidian potential, which have been little-studied scientifically. In the present study, we performed in vitro and in vivo neutralization of snake venoms with the aqueous extract of inner bark of Anacardium humile (EAAh), and the isolation and phytochemical characterization of an inhibitor of myotoxins, the gallic acid (GA). For the inhibition assays, we used solutions containing crude venom or isolated toxin mixed with different amounts of plant extracts that were previously incubated for 30 min at 37°C. Administration of the extract after envenomation was also performed at different time intervals for myotoxicity inhibition assays. It was observed that EAAh has inhibitory activity against the toxic (lethality, myotoxicity and hemorrhage) and pharmacological/enzymatic effects (edema-inducing, coagulant and phospholipase activities) induced by snake venoms of the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and isolated toxins. The plant extract inhibited 100% of the lethality induced by C. d. terrificus venom and its major neurotoxin, crotoxin. The EAAh was subjected to analytical chromatographic separation, and in polar conditions, it was possible to identify and isolate the gallic acid, which showed retention time and nuclear magnetic resonance spectra similar to the commercial standard and to literature data of this same compound, respectively. Gallic acid alone was able to inhibit the myotoxic activity induced by crude venom of B. jararacussu and its main myotoxin, BthTX-I, a Lys49 PLA2-like enzyme. The analysis of circular dichroism spectra and interaction studies by molecular modeling suggest that gallic acid forms a complex with BthTX-I in its active site, which inhibits its toxic activity. The binding of gallic acid to myotoxins did not change neither the form nor the intensity of circular dichroism spectra, not inducing significant changes in the percentage of the various domains that form the secondary structure of these proteins. The gallic acid and other tannins have been showed to be good inhibitors of the toxic effects of snake venoms, and our study showed that this acid is related to the inhibitory action of the Anacardium humile extract.

O gênero Candida é responsável pela maioria das infecções fúngicas nosocomiais. A identificação do provável foco de origem é de extrema importância para elucidar a epidemiologia desse tipo de infecção e nesse sentido, a utilização de métodos de tipagem, que avaliam características fenotípicas e moleculares dos isolados, é essencial. Assim, o objetivo desse estudo foi tipar isolados de C. albicans, antes e após armazenamento e em diferentes ocasiões de coleta, a fim de verificar a manutenção dos biotipos apresentados, e o poder de discriminação dos métodos utilizados. Foi avaliada a microbiota leveduriforme da saliva de 73 estudantes universitários (tempo 0) sendo que após 180 dias (tempo 180) foi realizada nova coleta de saliva daqueles que apresentaram isolamento de C. albicans na primeira coleta. Os isolados foram analisados por ocasião das duas coletas, quanto à produção de exoenzimas fosfolipase e proteinase, pela morfologia das colônias, pelo perfil de suscetibilidade frente à anfotericina B, fluconazol e itraconazol e pela tipagem molecular por RAPD. As leveduras, após isoladas, foram armazenadas em ágar Sabouraud dextrose (ASD) e água destilada esterilizada. Após 180 dias, foram realizadas, novamente, as provas de tipagem. Todos isolados de C. albicans foram produtores de fosfolipase, nas duas coletas, embora tenha havido oscilação de atividade enzimática entre moderada e alta, no período. O enzimotipo prevalente nos tempos 0 e 180 foi, respectivamente, 22 e 32. Com relação à proteinase, 100% das leveduras apresentaram atividade moderada da enzima no tempo 0. No tempo 180 esse percentual foi de 85%, sendo que os demais não apresentaram atividade dessa enzima. Após armazenamento em ASD e água destilada, foi detectada alteração da atividade de ambas enzimas e conseqüente mudança de enzimotipos, em 40 e 30% dos isolados, respectivamente. Foram identificados 8 morfotipos diferentes de C.albicans no tempo 0 e apenas 50% foi mantido no tempo 180. O morfotipo mais comum foi 000-0. Após armazenamento, a maioria dos isolados apresentou alteração no morfotipo. Todos isolados mostraram-se sensíveis aos antifúngicos analisados nos tempos 0 e 180, denotando apenas um antifungotipo, o 111. Somente um isolado após estocagem em ASD, teve mudança de perfil de sensível para dose dependente ao itraconazol de modo que o antifungotipo foi alterado. A tipagem molecular por RAPD, com os primers OPA-09, OPB-11 e OPE-18, mostrou 19 tipos moleculares distintos entre os isolados obtidos na primeira coleta e permitiu identificar que um isolado de C.albicans obtido no tempo 180, não era relacionado ao obtido, do mesmo indivíduo, no tempo 0. Os demais mostraram perfil de fragmentos de DNA relacionado entre as coletas. Após estocagem, por ambos métodos, todos isolados mostraram correlação genética com o padrão obtido no tempo 0. Os resultados obtidos demonstram que os métodos de conservação aplicados neste estudo não permitem a manutenção da estabilidade das características fenotípicas avaliadas. Por outro lado, além da estabilidade dos biotipos gerados, a tipagem molecular por RAPD mostrou o melhor índice discriminatório, dentre as metodologias utilizadas, ratificando sua capacidade em diferenciar isolados, de uma mesma espécie e, portanto a sua utilidade em inquéritos epidemiológicos. / The Candida genus is responsible for most nosocomial fungal infections. The identification of the probable origin focus is very important to elucidate the epidemiology of this kind of infection and so, the usage of typing methods that evaluate phenotypic and molecular characteristics are essential. Therefore, the objective of this study was to type C. albicans isolates, before and after culture storage and in two different collection occasions to verify the biotype maintenance and the discriminatory power of the utilized methods. The salivary yeast microbiota of 73 university students (time 0) was evaluated and after 180 days (time 180) a new saliva collection of those that had presented C. albicans on the first collection was made. The isolates were analysed, in the two collection occasions on the basis of exoenzymes phospholipase and proteinase production, by colonial morphology, susceptibility profile to amphotericin B, fluconazole and itraconazole and according to molecular typing by RAPD. After isolation, the yeasts were storaged on Sabouraud dextrose agar (SDA) and in sterile distilled water. After 180 days, typing tests were carried out again. All C. albicans isolates were phospholipase productors, in both collections, even though enzyme activity had oscillated between moderate and high at that period. The prevalent enzymotype at time 0 and 180 were, respectively, 22 and 32. In relation to the proteinase, 100% of the yeasts showed moderate enzyme activity at time 0. At time 180, this percentage was 85%, and the others didn`t show enzyme activity. After storage on SDA and in distilled water, it was detected activity alteration of both enzymes and consequent enzymotype change, in 40 and 30% of isolates, respectively. Eight different C. albicans morphotypes were identified at time 0 and just 50% were maintained at time 180. The most common morphotype was 000-0. After storage most isolates presented changes in the morphotype. All isolates showed susceptibility to the analysed antifungals at times 0 and 180, showing just one antifungaltype, the 111. Only one isolate, after storage on SDA had a profile change from susceptible to dose dependent susceptible to itraconazole in a way that the antifungaltype wasn`t changed. The molecular typing by RAPD, with primers OPA-09, OPB-11 and OPE-18, showed 19 distinct molecular types among first collection isolates and allowed to identify that one C. albicans isolate from time 180 wasn`t related with the isolate obtained at time 0, from the same individual. The others showed DNA fragment profiles related between collection occasions. After storage by both methods, every isolate showed genetic relatedness with the profile obtained at time 0. The obtained results showed that the preservation methods used in this study don`t allow stability maintenance of the phenotypical characteristics evaluated. On the other hand, besides biotypes generated stability, the molecular typing by RAPD showed the best discriminatory index, between methodologies used, ratifying its ability in discriminating isolates of the same specie and so, its utility in epidemiological inquiries

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ludmila de Matos Baltazar _ dissertacao.pdf: 1344528 bytes, checksum: 3adf6afe644493dc3f572d95071acc58 (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cryptococcosis is a systemic mycosis, which the meningoencephalitis is the most severe and most common clinical manifestation. The main species involved in your etiology are Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. The ecology of these species is not well, known, C. neoformans has the excrement of birds, mainly pigeons, as its principal habitat and C. gattii is commonly associate to the trees. The presence of C. gattii was investigated in different regions of Espirito Santo State and it was found in only two (0,7%) of the 209 samples of trees analyzed whereas C. neoformans was isolated in 9 (17%) of the 54 pigeon excrements analyzed. The occurrence of C. neoformans (63 isolates) at both clinical and environmental samples was higher than C. gattii (4 isolates). In the total, 67 isolates, clinical and environmental, of C. neoformans and C. gattii, were analyzed and all of then were sensitive to the voriconazole (VCZ) and amphotericin B (AMB). For the drug itraconazole (ITZ), 82% were sensitive (S), 18% sensitive-dose-dependent (SDD) and for fluconazole (FCZ), 75% S, 24% SDD and 1% resistant (R). Considering the origin of the isolates, the susceptibility profile was similar between the clinical and environmental origin. Among the azoles, the VCZ was the drug that showed higher activity and FCZ which showed less activity in vitro. There was no crossresistance between FCZ and VCZ. Regard the production of the phospholipase enzyme, 84% of the isolates had high production and only 3% showed no production of the enzyme. All the 67 isolates showed activity of phenoloxidase enzyme, being 71% low and none of then with negative activity. Lower production of phospholipase and higher phenoloxidase activity were observed in strains isolated from HIV-pos. All the clinical and environmental strains of C. neoformans belonged to genotype VNI and all C. gattii to VGII genotype. These results showed similarity in the genetic pattern, susceptibility profile of the drugs and production of extracellular enzymes, phospholipase and phenoloxidase between environmental and clinical isolates and confirm that the infection can be from environmental source. / A criptococose é uma micose sistêmica e a meningoencefalite é a sua manifestação clínica mais grave e mais comum. As principais espécies envolvidas na etiologia são Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A ecologia destas espécies não é ainda bem conhecida, C. neformans tem como habitat, fezes de aves, principalmente pombos e C. gattii é comumente associada a árvores. A presença de C. gattii foi investigada em diferentes regiões do Estado do Espírito Santo e foi encontrada em apenas duas (0,7%) das 209 amostras de árvores analisadas enquanto C. neoformans foi isolado em 9 (17%) das 54 amostras de excrementos de aves analisadas. A ocorrência de Cryptococcus neoformans (63 isolados) tanto em amostras ambientais como clínicas foi maior que a de Cryptococcus gattii (4 isolados). No total, 67 isolados, clínicos e ambientais, de C. neoformans e C. gattii, foram analisados e todos foram sensíveis as drogas voriconazol (VCZ) e anfotericina B (AMB). Para a droga itraconazol (ITZ), 82% foram sensíveis (S), 18% sensível-dosedependente (SDD) e para fluconazol (FCZ), 75% S, 24% SDD e 1% resistente (R). Considerando a origem dos isolados, o perfil de suscetibilidade foi semelhante entre os de origem clínica e os ambientais. Entre os azólicos, o voriconazol foi o fármaco que apresentou maior atividade e o fluconazol o que apresentou menor atividade in vitro. Não foi observada resistência cruzada entre voriconazol e fluconazol. Quanto à produção da enzima fosfolipase, 84% dos isolados apresentaram produção alta e apenas 3% não produziram a enzima. Todos os 67 isolados mostraram atividade da enzima fenoloxidase, sendo 71% com atividade baixa e nenhum com atividade negativa. Produção mais baixa da fosfolipase e níveis mais altos de atividade da fenoloxidase foram observados em cepas isoladas de pacientes HIV-positivos. Todas as cepas clínicas e ambientais de C. neoformans pertenceram ao genótipo VNI e todas C. gattii ao genótipo VGII. Esses resultados revelaram semelhança no padrão genético, perfil de suscetibilidade a drogas e produção das enzimas extracelulares, fosfolipase e fenoloxidase, entre isolados ambientais e clínicos e confirmam que a infecção pode ocorrer a partir de fontes ambientais.

Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina. / Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SimoneCristinaBuzzo_D.pdf: 2257171 bytes, checksum: dafe56777caf52fdf6e83be317bb28f9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de glicações sobre a PLA2 secretórias isoladas do veneno das serpentes Crotalus durissus collilineatus e Bothrops jararacussu. A técnica de MALDI-TOF foi usado para comprovar a glicação dos carboidratos nas PLA2: a PLA2 de Cdcolli apresentou glicação a 6 moléculas de D-Glicose e de 5 moléculas de D-Lactose, mas aparentemente não houve glicação com nenhuma molécula de D-Galactose; a BthTX-I apresentou glicação com 5 moléculas de D-Glicose, 1 molécula de D-Galactose e 4 moléculas de D-Lactose; a BthTX-II apresentou ligação a 6 moléculas de D-Glicose, a 1 molécula de D-Galactose e a 4 moléculas de D-Lactose; além disso, a dimerização das PLA2 não ocorreu. A glicação da PLA2 de Cdcolli com D-Glicose e D-Lactose aumentou sua atividade enzimática e mudou seu perfil alostérico, da mesma forma, esses carboidratos aumentaram a ação edematogênica e anularam a atividade citotóxica dessa PLA2. No entanto, D-Lactose e D-Glicose diminuíram o efeito miotóxico e modificaram o perfil de agregação plaquetária da PLA2 de Cdcolli nativa, embora apenas a D-Lactose tenha diminuído significantemente a agregação. A glicação de BthTX-I a D-Glicose e D-Galactose diminuiu sua ação edematogênica, e sua glicação aos carboidratos testados diminuiu seu efeito miotóxico. A glicação de BthTX-II a D-Lactose diminuiu sua atividade enzimática, a ação edematogência foi diminuída pela glicação a todos os carboidratos, enquanto a glicação a D-Glicose e D-Galactose diminuíram seu efeito miotóxico. A fluorescência intrínseca apresenta mudanças na estrutura terciária de BthTX-I e BthTX-II após a glicação e o dicroísmo circular sugere modificação na estrutura secundária da PLA2 de Cdcolli. Além disso, a modelação da PLA2 de Cdcolli apresentou várias regiões da proteína livres onde pode estar ocorrendo a glicação. Esse resultados sugerem que a glicação modifica a estrutura da PLA2, modulando de forma diferente a atividade enzimática e o efeito biológico, possivelmente a mudança estrutural ou mesmo os carboidratos ligados a estrutura da PLA2 estão modificando sua afinidade a receptores de membrana. Adicionalmente, os resultados evidenciam que os sítios responsáveis pelas atividades enzimática e biológica estão em lugares diferentes dentro da estrutura da PLA2 / Abstract: The objective of this work was evaluate the effect of glycations in the secretory PLA2 isolated from Crotalus durissus collilineatus (Cdcolli) and Bothrops jararacussu (BthTX-I, catalytic inative K49 and BthTX-II, catalytic active D49) rattlesnake venom. The MALDI-TOF technic was used to test the glycation in the PLA2: Cdcolli showed glycation to 6 molecules of D-Glucose and 5 molecules of D-Lactose, but no glycation to D-Galactose; the BthTX-I showed glycation to 5 molecules of D-Glucose, 1 molecule of D-Galactose and 4 molecules of D-Lactose; the BthTX-II showed glycation to 6 molecules of D-Glucose, 1 molecule of D-Galactose and 4 molecules of D-Lactose. The glycation of PLA2 from Cdcolli to D-Glucose and D-Lactose increased the enzymatic activity and changed its alosteric profile, in the same way, theses carbohydrates increased the edematogenic effect and annuled the citotoxic activity. However, D-Lactose and D-Glucose decreased the miotoxic effect and changed the platelet aggregation profile of native PLA2, although only D-Lactose had decreased the aggregation. The glycation of BthTX-I to D-Glicose and D-Galactose decreased the edematogenic effect and its glycation to all carbohydrates decreased the miotoxic effect. The glycation of BthTX-II to D-Lactose decreased its enzymatic activity; the edematogenic effect was decreased by the glycation to all the carbohydrates, while the glycation to D-Glucose and D-Galactose decreased the miotoxic effect. The intrinsec fluorescence shows changes in the terciary structure of BthTX-I and BthTX-II after glycation and the circular dichroism suggests modification in the secundary structure of glycated PLA2 from Cdcolli. Besides, the structure modelation shows many free areas in the PLA2 from Cdcolli, where the glycation can be happening. Theses results suggest that the glycation modifies the structure of PLA2, modulating in a different way the enzymatic and the biologic activity; probably the structure changes or even the linked carbohydrates to the PLA2 structure are modifying the affinity for membrane receptors. Additionally, the results show that the enzymatic and biological sites are in different areas in the PLA2 structure. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador:Marcos Hikari Toyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T05:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_D.pdf: 15606775 bytes, checksum: 3232092d1eced36a575f660d994b44a9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e função / Abstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:19:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_M.pdf: 1233125 bytes, checksum: 85502fc7f4b2dd6cdb2a6fc0c220c5b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As serpentes do gênero Crotalus incluem várias espécies amplamente distribuídas nocontinente Americano. Os venenos crotálicos das serpentes encontradas no Brasil apresentam características próprias. Entre os componentes bioativos, as fosfolipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) destacam-se por ser a principal componente, tais enzimas são dependentes de cálcio e hidrolisam a ligação sn-2 éster dos fosfolipídios e alem disso induz uma variedade de efeitos. Nesta tese, primeiramente nos desenvolvemos um novo protocolo de purificação com uma coluna C18 µ-Bondapack em HPLC de fase reversa destas toxinas, Os perfis obtidos mostraram que o veneno total da espécie Crotalus durissus cumanensis foi fracionado em quatorze picos, onde as frações 9 e 10 apresentam atividade PLA2. Do veneno de Crotalus durissus ruruima foram obtidos dezoito picos, sendo que as frações 12 e 13 apresentaram atividade PLA2 também. Assim, neste trabalho, nos apresentamos o isolamento, purificação determinação de sua estrutura primaria de duas isoformas fosfolipase A2 para cada espécie crotálica: Crotalus durissus cumanensis e Crotalus durissus ruruima denominados como Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13, respectivamente. Todas elas são formadas por 122 resíduos de aminoácidos. O alinhamento dos aminoácidos, das isoformas Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 e Cdr-13 mostram um alto nível 93.4 % de homologia seqüencial para as duas primeiras e 92.6% para as outras, observaram-se com respeito a distintas PLA2 que diminuíram para cerca de 50 % de homologia. Todas elas foram identificadas como miotoxinas e apresentaram atividade fosfolipásica. Foi possível realizar, a partir das isoformas nativas um processo de modificação química, utilizando-se reagentes seletivos para amino ácidos específicos (His, Tyr e Lys) os quais estão envolvidos na rede catalítica ou na interação com sua interface, logo após, foram analisadas quanto a suas características físico-químicas e biológicas. Nossos estudos de miotoxicidade local e sistêmica de todas as isoformas nativas e modificadas dos venenos crotálicos in vivo, evidenciaram o incremento nos níveis de creatina cinase (CK) séricos e nas isoformas modificadas foram inibidas na sua atividade catalítica ou devido às mudanças estruturais que afetam outras regiões alem do sitio catalítico, revelando a importância de conhecer a relação estrutura-função. Em contraste, o efeito indutor de edema, não pode ser rapidamente correlacionado com suas diferenças estruturais. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar nosso conhecimento da relação dos sítios farmacológicos alem da região catalítica nas fosfolipases A2 / Abstract: The serpents of the genus Crotalus include several species widely distributed in the American continent. The poisons crotálicos of the serpents found in Brazil, they present own characteristics. Among the components bioativos, the phospholipases A2 (E.C. 3.1.1.4.) standing out to be the main component, such enzymes are dependents of calcium and hidrolise the bond sn-2 éster of the fosfolipídios and besides that induced a variety of effects. In this thesis, firstly we develop a new purification protocol with a column C18 µ- Bondapack in HPLC of reverse phase of these toxins, The obtained profiles showed that the total poison of the species Crotalus durissus cumanensis was fractioned in fourteen picks, where the fractions 9 and 10 present activity PLA2. Of the poison of Crotalus durissus ruruima they were obtained eighteen picks, and the fractions 12 and 13 also presented activity PLA2. This way, in this work, we present the isolation, purification, determination of his primary structure of two isoforms fosfolipase A2 for each species crotálics: Crotalus durissus cumanensis and Crotalus durissus ruruima denominated like Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13, respectively. All of them are formed by 122 residues of amino acids. The alignment of amino acids of the isoforms Cdc-9, Cdc-10, Cdr-12 and Cdr-13 it shows a high level of sequential homology 93.4% for the first two and 92.6% for the other ones, they were observed with regard to different PLA2 that decreased for about 50% of homology. All of them were identified as miotoxins and they presented phospholipasic activity. it was possible to carry out starting from the native isoforms a process of chemical modification, being used selective reagents for amino specific acids (His, Tyr and Lys) which are involved in the catalytic net or in the interaction with his interface, soon after, they were analyzed as for their physio-chemical and biological characteristics. Our studies of local and systemic miotoxicity of all the native and modified isoforms in vivo of the poisons crotálicos, evidenced the increment in the levels of creatine kinase (CK) séricos and in the modified isoformas they were inhibited in his activity catalytic or due the structural changes that they affect other regions besides the catalytic place, revealing the importance of knowing the relationship structure-function. In contrast, the effect producing edema, it cannot be correlated quickly with their structural differences. The results presented in this work provide the obtaining of an useful biochemical tool to increase our knowledge of the relationship of the pharmacological sites also of the catalytic region in the phopholipases A2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.