Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est une cause majeure de mortalité parcancer gynécologique. Il est associé à un mauvais pronostic car il est souventdécouvert à un stade tardif. Mieux comprendre les causes et les mécanismesmoléculaires et cellulaires associés à la progression de ce cancer représente unenjeu majeur.Les deux chimiokines CXCL12/SDF-1 et fractalkine (FKN)/CX3CL1 ont étéimpliquées dans diverses tumeurs. La chimiokine SDF-1, a un effetimmunosuppresseur dans le CEO. Elle est aussi impliquée dans l’angiogenèsetumorale. L’effet de SDF-1 médié par CXCR4 est également impliqué dans larégulation de la prolifération, la survie, la migration et l'invasion des cellulescancéreuses. La FKN, a largement été mise en évidence dans les tissusépithéliaux et dans divers cancers où elle peut avoir soit un rôle anti-tumoral soitun rôle pro-tumoral. Jusqu’à présent la FKN n’a pas été étudié dans le CEO.Dans notre étude, nous avons démontré l’expression de SDF-1 et de la FKNdans l’épithélium de surface de l’ovaire sain et dans les tumeurs bénignes etmalignes. Ces résultats montrent que l’expression de SDF-1 et de la FKNpréexiste à la tumorigenèse. Nous avons démontré une expression hétérogènedes deux chimiokines dans les cellules du CEO. Les niveaux d’expression deSDF-1 dans les cellules tumorales sur une cohorte de 183 patientes n’ont aucunevaleur pronostique sur la survie globale et sur la survie sans progressiontumorale des patientes atteintes par le CEO. L’étude de la corrélation del’expression de la FKN avec les deux marqueurs de prolifération, Ki-67 etGILZ, sur une autre cohorte de 54 patientes, complétée par des expériences invitro, a montré que GILZ augmente l’expression de la FKN et d’autre part que laFKN elle-même augmente la prolifération. Cette étude contribue à élucider lerôle de SDF-1 et de la FKN dans le CEO. / Little is known about the molecules that contribute to tumor growth ofepithelial ovarian carcinomas (EOC) that remains the most lethal gynecologicalneoplasm in women.The two chemokines CXCL12/SDF-1 and fractalkine (FKN)/CX3CL1 havebeen widely studied in tumorigenesis. In epithelial ovarian cancer (EOC), SDF-1enhances tumor angiogenesis and contributes to the immunosuppressivenetwork. SDF-1 also acts on tumor cell proliferation and survival and, throughits main receptor CXCR4, governs the migration of malignant cells and theirinvasion of the peritoneum. The chemokine FKN has been documented inepithelial tissues and in various cancers. FKN have paradoxical effects intumors: anti-tumoral effect in some tumor entities and pro-tumoral effect inother tumor entities.In our study, we demonstrated the expression of SDF-1 and FKN on thesurface epithelium of normal ovaries and benign and malignant tumors,suggesting that the expression of these chemokines preexists to tumorigenesis.We also demonstrated an heterogeneous expression of both chemokines in EOC.In our large and homogeneous cohort (183 specimens of EOC), SDF-1expression levels had no effect on overall survival or progression-free survival.Thus, SDF-1 expression by tumor epithelial cells is not in itself a valuableprognostic factor in patients with advanced EOC. FKN immunostaining scores(in 54 specimens of EOC) correlated positively with the two proliferationmarkers : Ki-67 and GILZ. In vitro, we demonstrated that GILZ increases theexpression of FKN and that FKN itself increased proliferation. This studycontributes in elucidating the role of the two chemokines SDF-1 and FKN inEOC.

Malgré les avancées thérapeutiques récentes, le pronostic des patients porteurs de métastases osseuses (MO) reste faible, ce qui incite à chercher des nouvelles stratégies thérapeutiques. Les chimiokines sont des acteurs majeurs de la réponse immune, et apparaissent comme des cibles potentielles de l’immunothérapie anti-cancéreuse. Nous avons recherché à définir si la chimiokine CX3CL1 pouvait représenter un axe thérapeutique efficace dans le contexte des MO. Pour cela nous avons développé des modèles murins de MO de cancer du rein et du poumon. Dans le modèle de MO de cancer du poumon, notre travail a démontré que l'expression de CX3CL1 inhibe la croissance tumorale. L’analyse transcriptomique des tumeurs a montré que CX3CL1 diminue (i) l’ostéloyse via un effet sur la triade OPG/RANKL/RANK (ii) l'expression de certains checkpoints, en faveur d’une réponse immune antitumorale. En revanche, dans le modèle de MO de cancer du rein, l’expression de CX3CL1 stimule le développement tumoral et l'ostéolyse via une action sur la triade OPG/RANKL/RANK et inhibe la réponse immune antitumorale via une augmentation de l'expression de certains checkpoints immunitaires. Les bisphosphonates (BPs) sont des agents utilisés pour le traitement des MO. Afin de réduire leurs effets indésirables, nous avons utilisé des ciments de phosphate de calcium (CPC), pour délivrer localement dans l’os des BPs (alendronate, ALN). Notre travail a mis en évidence que (i) ces ciments chargés en ALN relarguent en continue les BPs, (ii) le relarguage d’ALN est efficace pour induire des effets cytotoxiques et pro-apoptotiques vis à vis des cellules de cancer du sein / Despite recent therapeutic improvments, the prognosis for a patient with bone metastases (BM) remains poor, this situation prompting the research of new therapeutic strategies. Chemokines are central players in the immune response, and appear as potential targets in anti-cancer immunotherapies. We are interested to determine whether the CX3CL1 chemokine exerted pro or anti-tumor actions within the bone metastatic context. To address this issue, we developed mouse models of lung or renal cancer BM. In lung cancer BM model, our work demonstrated that CX3CL1 expression led to tumor growth inhibition. Tumors transcriptomic analysis revealed that CX3CL1: (i) impacted bone metabolism by modulating the OPG/RANKL/RANK triad (ii) decreased the expression of certain immune checkpoints, this up-regulating the anti-tumor immune response. By contrast, in renal cancer BM model, CX3CL1 expression stimulated bone tumor development and transcriptomic analysis showed that CX3CL1 (i) promoted osteolysis through an action on the OPG/RANKL/RANK triad (ii) -induced tumor development correlated with an increased expression of certain immune checkpoints, this down-regulating the anti-tumor immune response. Bisphosphonates (BPs) are targeted agents used for BM treatment. In order to reduce their side effects, we used resorbable calcium phosphate cements (CPC), which are frequently used as bone void fillers, as platform for a local delivery of BPs (alendronate, ALN). As a whole, our in vitro data demonstrated that: (i) ALN-CPC cements continuous released ALN; (ii) this ALN release was effective in inducing cytotoxic and pro-apoptotic effects in breast cancer cells

As a consequence of aging, the brain is subject to chronic neuroinflammatory conditions. The resident immune cells of the brain, microglia, act similarly to peripheral macrophages to protect the brain from insults, infection, and physical trauma. However, without proper regulation of their respective host defense mechanisms, these actions can become neurotoxic. In the healthy brain neurons have several signaling systems that directly interact with microglia in order to maintain a calming influence upon their actions, one of particular interest is the chemokine CX3CL1. This chemokine is found predominantly on neurons, while its cognate receptor CX3CR1 is found exclusively on microglia. There has been a recent surge in literature as to the exact role CX3CL1 signaling plays various physiological and neuropathological animal models, with still no well-defined role. In an attempt to address the current discordance regarding the role of CX3CL1 signaling we have used three different models. The first examines how genetic ablation of CX3CR1 impacts hippocampal dependent cognitive function. Secondly, we examined the impact of chronic LPS-induced neuroinflammation affects CX3CL1 signaling and ultimately cognitive function. Lastly, we used an acute mouse model of Parkinson's disease induced by MPTP to examine the effects of specific subtypes of CX3CL1. Although three unique approaches were used to examine the anti-inflammatory properties of CX3CL1, parallels can be drawn from the separate studies as similar results were obtained. CX3CL1 signaling has significant anti-inflammatory actions within the brain and alterations that prevent this signaling to occur can result in impairments in cognitive function as well as exacerbation of neurodegenerative conditions.

Les cellules microgliales, qui sont les macrophages du système nerveux central, ont été principalement étudiées en conditions pathologiques. Néanmoins, l'étude de la microglie aux stades périnataux indique qu'elle influence le développement normal du système nerveux central. Des interactions directes et indirectes entre la microglie et les synapses existent mais les mécanismes par lesquels ces cellules immunitaires ciblent les synapses et modulent leur maturation fonctionnelle durant le développement postnatal sont peu connus. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée aux cellules microgliales et à leurs fonctions dans le développement postnatal du cortex somato-sensoriel de la souris. Dans une première étude, nous avons montré qu'au cours de la première semaine post-natale le recrutement des cellules microgliales aux sites synaptiques en maturation met en jeu une voie de signalisation impliquant la chimiokine neuronale fractalkine et de son récepteur microglial CX3CR1. En effet, un défaut d'expression de ce récepteur retarde le recrutement des cellules microgliales aux sites synaptiques et entraine un retard de maturation fonctionnelle des synapses thalamocorticales. Dans une seconde étude, nous avons caractérisé le phénotype des cellules microgliales lors de la maturation fonctionnelle des réseaux synaptiques corticaux. Nous avons montré que les cellules microgliales adoptent un phénotype particulier lorsqu'elles sont recrutées aux synapses en maturation. Ce phénotype diffère de celui exprimé par la microglie adulte en conditions physiologiques et pathologiques et pourrait permettre aux cellules microgliales d'accomplir des fonctions spécifiques nécessaires à la maturation synaptique. Dans une troisième étude, nous avons testé les effets de la minocycline sur le développement cortical. Cette tétracycline est connue pour bloquer l'activation microgliale chez l'adulte. De façon surprenante, nous avons observé que pendant une période critique se situant à la fin de la première semaine post-natale la minocycline induit une importante mort cellulaire qui s'accompagne d'une altération de la distribution des cellules microgliales et déclenche leur activation. L'ensemble de mes données montrent que les cellules microgliales sont très sensibles aux changements de leur environnement, que leur phénotype fonctionnel change en conditions physiologiques en fonction de cet environnement et que des interactions réciproques entre neurones et microglie influencent la maturation fonctionnelle des réseaux synaptiques corticaux lors du développement postnatal.

Les cellules microgliales, qui sont les macrophages du système nerveux central, ont été principalement étudiées en conditions pathologiques. Néanmoins, l'étude de la microglie aux stades périnataux indique qu'elle influence le développement normal du système nerveux central. Des interactions directes et indirectes entre la microglie et les synapses existent mais les mécanismes par lesquels ces cellules immunitaires ciblent les synapses et modulent leur maturation fonctionnelle durant le développement postnatal sont peu connus. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée aux cellules microgliales et à leurs fonctions dans le développement postnatal du cortex somato-sensoriel de la souris. Dans une première étude, nous avons montré qu'au cours de la première semaine post-natale le recrutement des cellules microgliales aux sites synaptiques en maturation met en jeu une voie de signalisation impliquant la chimiokine neuronale fractalkine et de son récepteur microglial CX3CR1. En effet, un défaut d'expression de ce récepteur retarde le recrutement des cellules microgliales aux sites synaptiques et entraine un retard de maturation fonctionnelle des synapses thalamocorticales. Dans une seconde étude, nous avons caractérisé le phénotype des cellules microgliales lors de la maturation fonctionnelle des réseaux synaptiques corticaux. Nous avons montré que les cellules microgliales adoptent un phénotype particulier lorsqu'elles sont recrutées aux synapses en maturation. Ce phénotype diffère de celui exprimé par la microglie adulte en conditions physiologiques et pathologiques et pourrait permettre aux cellules microgliales d'accomplir des fonctions spécifiques nécessaires à la maturation synaptique. Dans une troisième étude, nous avons testé les effets de la minocycline sur le développement cortical. Cette tétracycline est connue pour bloquer l'activation microgliale chez l'adulte. De façon surprenante, nous avons observé que pendant une période critique se situant à la fin de la première semaine post-natale la minocycline induit une importante mort cellulaire qui s'accompagne d'une altération de la distribution des cellules microgliales et déclenche leur activation. L'ensemble de mes données montrent que les cellules microgliales sont très sensibles aux changements de leur environnement, que leur phénotype fonctionnel change en conditions physiologiques en fonction de cet environnement et que des interactions réciproques entre neurones et microglie influencent la maturation fonctionnelle des réseaux synaptiques corticaux lors du développement postnatal.

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine entzündliche Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems. Die klinisch und pathologisch heterogene Erkrankung wird im Tiermodell am besten durch eine experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) abgebildet. Entzündliche Läsionen einer EAE sind neben Lymphozyten durch Monozyten/ Makrophagen gekennzeichnet. Der in dieser Arbeit untersuchte Chemokinrezeptor CX3CR1 findet sich auf murinen Monozyten des Blutes und wird dort unterschiedlich hoch exprimiert. Im ZNS werden der Rezeptor auf Mikroglia und der Ligand Fraktalkin (CX3CL1) konstitutiv und somit entzündungsunabhängig auf Neuronen exprimiert. In verschiedenen Tiermodellen neurologischer Erkrankungen wurden unterschiedliche Auswirkungen dieser Interaktion beschrieben. Die vorliegende Studie untersucht die Fragestellung, ob sich in einem spontanen EAE-Modell CX3CR1-defiziente OSE-Mäuse von CX3CR1-kompetenten OSEMäusen hinsichtlich spontaner EAE-Inzidenz, Erkrankungsverlauf und Läsionspathologie unterscheiden. CX3CR1-defiziente OSE-Mäuse zeigen in diesem Modell eine erhöhte Inzidenz (54% vs. 32%), aber einen milderen Krankheitsverlauf gegenüber Rezeptor-Wildtypen. Dem milderen Krankheitsverlauf entsprechend weisen OSE CX3CR1-defiziente Mäuse histopathologisch in der akuten Phase kleinere demyelinisierte Läsionen der spinalen weißen Substanz und geringere meningeale spinale entzündliche Infiltrate auf mit einer signifikant geringeren Makrophageninfiltration in den Läsionen. In der spinalen grauen Substanz zeigen sie eine mildere neuronale Schädigung. In der chronischen Krankheitsphase findet sich eine reduzierte Infiltration von Entzündungszellen ohne signifikanten Unterschied zwischen OSE CX3CR1-defizienten Mäusen und Rezeptorwildtypen. Molekularbiologisch zeigen OSE CX3CR1-defiziente Mäuse eine verstärkte Expression von IL-17a in der akuten Krankheitsphase. Die erhöhte EAE-Inzidenz in CX3CR1-defizienten OSE-Mäusen ist am ehesten auf ein vermehrte Generierung von enzephalitogenen 2D2 T-Zellen im Darm in diesem spontanen EAE-Modell zurückzuführen. Der mildere Krankheitsverlauf bei CX3CR1- defizienten Mäusen weist auf eine Bedeutung von CX3CR1 in der Migration von Monozyten in das entzündete ZNS hin. Die vorliegende Arbeit ist die Grundlage für weiterführende Studien, in welchen die Bedeutung der Fraktalkin-CX3CR1-Interaktion für kortikale Pathologie bei der EAE untersucht werden wird.

Adult neurogenesis, is a lifelong process by which relatively few cells are added into two restricted regions of the brain. Integration of the cells into the existing neuronal circulatory, with the unique properties involved in the maturation of these cells, is possibly critical to the acquisition and retrieval of new memories. With the chronological aging of the organism a process of cellular senescence occurs throughout the body; a portion of which is independent of primary alterations to the stem cells; instead, it appears to be dependent on the environment where the cells reside, and is in part regulated by inflammation. Microglia, the resident immune cells in the brain, are neuroprotective but chronic activation of the microglia, such as the chronic activation that occurs with advanced age, can promote neurotoxic inflammation. However, it not clear if the aged-related increase in neuroinflammation is at least partly responsible for the aged related decrease in neurogenesis. To address the involvement in neuroinflammation in regulating neurogenesis we used 3 different potential therapeutically relevant manipulations. The first was a targeted approach directed at disrupting the synthesis of Interleukin-1beta (IL-1B), which is a proinflammatory cytokine that is consistently found elevated in the aged brain. The second was a cell therapy approach in which human umbilical cord blood cells were injected into the systemic circulation. The final approach was directed at a chemokine system, fractalkine/CX3CR1, which has been shown as an important paracrine signal, from neurons that regulates the activation state of microglia. While the three approaches used to manipulate, aging-rodent model system were different, a consistent finding was reached in all three studies. In the aged brain, microglia which are the predominate produces of IL-1B, negatively regulate neurogenesis. When IL-1B is decreased or microglia activation is decreased, neurogenesis can be partially restored in the aged brain. The results of these studies, demonstrate a key role for microglia in regulating the neurogenic neiche, which are amendable to therapeutic manipulations.

Pruning, the elimination of excess synapses is a phenomenon of fundamental importance for correct wiring of the central nervous system. The establishment of the cerebellar climbing fiber (CF)-to-Purkinje cell (PC) synapse provides a suitable model to study pruning and pruning-relevant processes during early postnatal development. Until now the role of microglia in pruning remain under intense investigation. Here, we analyzed migration of microglia into the cerebellar cortex during early postnatal development and their possible contribution to the elimination of CF-to-PC synapses. Microglia enrich in the Purkinje cell layer at pruning-relevant time points giving rise to the possibility that microglia are actively involved in synaptic pruning. We investigated the contribution of microglial fractalkine (CX3CR1) signaling during postnatal development using genetic ablation of the CX3CR1 receptor and an in–depth histological analysis of the cerebellar cortex.:1 Introduction 6 1.1 Origin of microglia 6 1.2 Synaptic refinement 7 1.3 Fractalkine Receptor CX3CR1 9 1.4 Climbing fiber maturation and PCL development 10 1.5 Aim of the study 12 2 Materials and Methods 13 2.1 Materials 13 2.1.1 General material 13 2.1.1.1.1 Hardware 13 2.1.1.1.2 Consumable supplies 13 2.1.2 Chemicals 14 2.1.3 Solutions 14 2.1.4 Animals 14 2.1.5 Primary Antibodies 15 2.1.6 Secondary Antibodies 15 2.1.7 Software 15 2.2 Methods 15 2.2.1 Genotyping 15 2.2.2 Fixation and cryopreservation 16 2.2.3 Fluorescence Immunohistochemistry 16 2.2.4 Quantification of Microglia in the Cerebellum 16 2.2.5 Assessment of VGluT2 in the cerebellum 18 2.2.6 Statistical Analysis 19 3 Results 20 3.1 Postnatal enrichment of microglia cells in the cerebellar Purkinje cell layer 20 3.2 Microglial proximity to Climbing fibers 22 3.3 Population of the granular und molecular layer of CX3CR1 knock-out mice during early postnatal development 23 3.4 Influence of CX3CR1 knock-out on microglial morphology 25 3.5 Influence of CX3CR1 deletion on the VGluT2 expression during postnatal development 29 4 Discussion 31 4.1 Role of microglia in the developing cerebellum 31 4.2 CX3Cr1 Signaling and influence on microglial motility and morphology 32 4.3 CX3CR1 signaling and synaptic pruning 33 4.4 CX3CR1 signaling and formation of functional synapses 34 4.5 Correlation of immunohistological data with electrophysiological findings 35 5 Summary and conclusion 36 6 Zusammenfassung der Arbeit 38 7 References 41 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 49 9 Publications 50

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