Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-05-07T16:14:12Z No. of bitstreams: 1 Steliane Lima Santos.pdf: 758334 bytes, checksum: 78af35be32365e055393819b7a1092ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T16:15:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Steliane Lima Santos.pdf: 758334 bytes, checksum: 78af35be32365e055393819b7a1092ab (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Frutosiltransferase (FTase) is an enzyme that catalyzes the breakdown of the glycosidic bonds of the sucrose molecule by transferring the fructosyl group to another molecule, which can be sucrose or fructooligosaccharides (FOS), resulting in the release of glucose. FOS is a conventional prebiotic that has a low calorimetric value and promotes the selective stimulation of the intestinal microbial growth, especially of bifidobacteria and lactobacilli, reducing the risks of cardiovascular disease, colon cancer and obesity. However to obtain the use of enzymatic processes is more expensive due to the high cost of production. However, these factors can be overcome with the use of microorganisms and agroindustrial residues as a culture medium for a solid fermentation, making the procedure more economical and feasible. The objective of this work was the production of the enzyme fructosyltransferase in solid fermentation using coffee grounds from Aspergillus flavus, where it was possible to verify that 72h of growth presented higher production of the enzyme with specific activity of 31.5 U / mg in the following conditions, 60% moisture, spore concentration 106 spores / mL at 30 ° C for 120 hours. The crude extract containing the enzyme was subjected to a precipitation selection between ketone, ammonium sulfate and ethanol, where the highest enzymatic activity was given using the precipitation with acetone 161.85 U / mL and relatively high purification factor of 10.70. Subsequently the sample was purified by DEAE SEPHADEX A50 and SUPERDEX AKTA ion exchange chromatography systems on the DEAE-sephadex system haithap and superdex 75 columns being carried out in sequence. The purified enzyme had 57 kDa molecular weight in Superdex G-75. Regarding the characterization, it presented optimum temperature of 60ºC respectively, obtaining thermo stability at 50ºC. The purification results showed a fraction with enzymatic activity for pure fructosyltransferase in which it obtained a purification factor of 86.16. When observed its enzymatic synthesis it was verified that the enzyme can produce fructooligosaccharides, being kestose and nystose. The results obtained in the present study show the promising potential of the fructosyltransferase produced by Aspergillus flavus and its use for the production of fructooligosaccharides. / Frutosiltransferase (FTase) é uma enzima que catalisa a quebra de ligações glicosídicas da molécula de sacarose transferência do grupo frutosil para uma outra molécula, podendo ser sacarose ou frutooligossacarídeos (FOS), ocorrendo a liberação de 6 glicose. O FOS é um prebiótico convencional que apresenta um baixo valor calorimétrico e promove a estimulação seletiva do crescimento microbiano intestinal, especialmente de bifidobactérias e lactobacilos, reduzindo os riscos de doenças cardiovasculares, câncer de cólon e obesidade. No entanto para obtenção a utilização de processos enzimáticos é mais caro devido ao alto custo de produção e baixa estabilidade das enzimas. Contudo esses fatores podem ser contornados com a utilização de microrganismos e resíduos agroindustriais como um meio de cultivo para uma fermentação solida, tornando o procedimento mais econômico e viável. O objetivo desse trabalho foi à produção da enzima frutosiltransferase em fermentação solida utilizando borra de café a partir de Aspergillus flavus, onde foi possível ainda verificar que 72h de crescimento apresentou maior produção da enzima com atividade especifica de 31,5 U/mg nas seguintes condições, 60% de umidade, concentração de esporos 106 esporos/mL a 30°C durante 120 horas. O extrato bruto contendo a enzima foi submetido a uma seleção de precipitação entre a cetona, sulfato de amônia e etanol, onde a maior atividade enzimática se deu utilizando a precipitação com acetona 161,85 U/mL e fator de purificação relativamente alto de 10,70. Posteriormente a amostra foi purificada através de sistema de cromatografia de troca iônica DEAE SEPHADEX A50 e SUPERDEX AKTA nas colunas DEAE-sephadex sistema haithap e superdex 75 sendo realizadas em sequência. A enzima purificada apresentou peso molecular de 57 kDa em Superdex G-75. Quanto a caracterização, apresentou temperatura ótima de 60ºC respectivamente, obtendo termo estabilidade a 50ºC. Os resultados da purificação mostraram uma fração com atividade enzimática para frutosiltransferase pura na qual obtive um fator de purificação de 86,16. Quando observado sua síntese enzimática foi constatado que a enzima consegue produzir frutooligossacarideos, sendo eles kestose e nistose. Os resultados obtidos no presente estudo mostram o potencial promissor da frutosiltransferase produzida por Aspergillus flavus e na sua utilização para produção de frutooligossacarideos.

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:08:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlvaradoHuallanco_MonicaBeatriz_D.pdf: 1075413 bytes, checksum: f34b7681cc54bc046c7344d2601d8d16 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os frutooligossacarídeos são considerados prebióticos, uma vez que promovem seletivamente o crescimento de micro-organismos probióticos como Lactobacillus acidophillus e Bifidobacterium bifidus. Novas enzimas, na forma livre ou imobilizada, representam uma das possibilidades para síntese destes compostos. Neste trabalho procedeu-se ao estudo da modelagem cinética e simulação da síntese de frutooligossacarídeos a partir de sacarose em diferentes tipos de reatores, pela enzima frutosiltransferase produzida pela levedura do gênero Rhodotorula, isolada em trabalhos prévios. Os estudos foram realizados sob condições de pH 4,5, 50°C e 5 UTF/mL de concentração da enzima. Tanto a enzima livre quanto a imobilizada mostraram seguir a cinética de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato para concentrações acima de 70% e 60% (p/v), respectivamente. Observou-se inibição competitiva da glicose para os substratos sacarose, kestose e nistose. Por outro lado, considerou-se significativa a atividade hidrolítica da nistose, sendo incluída no modelo. Após a análise de sensibilidade dos parâmetros cinéticos, estes foram ajustados por simulação, e determinou-se seus valores intrínsecos. O modelo mostrou-se válido com desvios menores que 4% para a enzima livre (57% de FOS) e de 5% para enzima imobilizada (46% de FOS), indicando que ele pode ser utilizado no desenvolvimento e controle de biorreatores. No caso da enzima imobilizada incluiu-se no balanço de massa o efeito da resistência à transferência de massa externa. Devido ao suporte ser um sólido compacto, com porosidade interna desprezível, desprezou-se a difusão intraparticular, considerando-se que a imobilização da enzima foi somente na superfície da partícula. A otimização do processo em reator de cesto em batelada, tanto quanto na do reator de cesto contínuo, foi realizada segundo delineamentos do tipo composto central rotacional (DCCR), nas condições de 50% de sacarose, 50?C e pH 4,5. As condições ótimas para o processo em batelada, foram de 14 Ui/mL para a enzima imobilizada e 45 rpm para a agitação, sendo o rendimento de FOS igual a 50,60% após 24 horas de síntese. Para o reator de cesto contínuo as variáveis otimizadas foram de 15 Ui/mL para a enzima imobilizada e 45 rpm para a agitação, com rendimentos de FOS de 32,1% e produtividade de 5,0 g?L.h, com tempo de residência de 32 h. Neste último caso, o componente principal de FOS foi o GF4 (25%). Os resultados mostraram que a atividade biocatalítica e o coeficiente de transferência de massa tiveram influência significativa no curso da reação e no rendimento de produção de FOS e que o melhor processo foi o de batelada em reator de cesto / Abstract: Fructooligosaccharides (FOS) are considered prebiotics, since selectively promote the growth of microorganisms as probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium bifidus acidophillus. New enzymes, in its free or immobilized form, represent one of the possibilities for this development. In this work, the kinetic modeling and simulation of the synthesis of FOS from sucrose in different types of reactors were carried out. The enzyme utilized was the fructosyltransferase from Rhodotorula sp., a microorganism isolated in a previous study. The studies were performed under conditions of pH 4.5, 50°C and 5 UFT/mL concentration of enzyme. Both free and immobilized enzymes showed the Michaelis-Menten kinetics with substrate inhibition, at concentrations above 70% and 60% (w/v), respectively. Additionally, it was shown that there is competitive inhibition of glucose over sucrose, kestose and nystose uptake. Moreover, the hydrolytic activity on nystose was considered significant, therefore, it was included in the model. After the parameter sensitivity analysis the intrinsic kinetic parameters were determined and the model was validated against experimental data for sucrose concentrations of 50 and 70%. The model proved to be valid with deviations of less than 4% for the free enzyme (57% FOS) and 5% for immobilized enzyme (46% FOS), indicating that it can be used in the development and control of bioreactors. The enzyme immobilization was by adsoption on the surface of a niobium ore, which is a compact solid with negligible internal porosity. For the batch and continuous basket reactor processes, the optimization experiments were simulated in two central composite rotatable designs (DCCR), using 50% of sucrose concentration, 50?C and pH 4.5. The optimum conditions for the batch reactor were: 14 Ui/mL for the activity of immobilized enzyme and agitation speed of 45 rpm, with yield of 50.60% of FOS, after 24 hours of synthesis. For the continuous basket reactor, the optimum conditions were: an activity of immobilized enzyme of 15 Ui/mL and an agitation speed of 45 rpm, performing a FOS yield of approximately 32.1% and produtivity of 5.0 g?L.h, with a residence time of 32 h. In the latter case of the main FOS fraction was the GF4, with about 25% of the total, a result very different from those obtained with other types of reactors. The results showed that the immobilized enzyme activity and the coefficient of mass transfer had a significant influence on the course of the reaction and the yield of FOS and that the best process for FOS production is the batch basket reactor / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JunioCota_M.pdf: 1041148 bytes, checksum: 4cc2da3de714f40ac19aea72962747ef (MD5) Previous issue date: 2009 / Abstract: Impulsionados pela grande demanda por alimentos ¿saudáveis¿ e de calorias controladas, têm surgido desde os anos 80 um grande número de adoçantes alternativos e, entre eles, diversos oligossacarídeos. Entre os oligossacarídeos mais estudados estão os frutooligossacarídeos (FOS), que se tornaram mais importantes por suas propriedades funcionais que pelo seu poder adoçante. Os FOS podem ser produzidos por meio da reação de transfrutosilação catalisada pela enzima frutosiltransferase (FTase), onde uma molécula de sacarose é hidrolisada e o radical frutosil é transferido para outra sacarose. Diversos microrganismos possuem o gene que codifica para a FTase, e sua aplicação industrial já está bem estabelecida, contudo, o Brasil detém apenas uma pequena fração do total de patentes desses processos tecnológicos. Esse trabalho teve por objetivo selecionar novas linhagens microbianas produtoras de frutosiltransferase que sejam eficientes e competitivas com as já descritas na literatura. Para isso, novas linhagens de microrganismos foram isoladas do Baru, um fruto do cerrado. Inicialmente 54 linhagens foram avaliadas quanto à atividade de transfrutosilação, sendo identificadas 13 como potenciais produtoras de FTase. Cada uma das 13 linhagens foi testada com relação à síntese de FOS em diferentes tempos de reação (6, 12, 24, 48 e 72 h), tendo sido utilizadas preparações enzimáticas parcialmente purificadas. A FTase de Penicillium sp. apresentou o maior rendimento da reação de síntese de FOS (50%), sendo as condições de reação 500g.L-1 de sacarose, 20% de enzima (v/v), agitação de 100 rpm, temperatura de 50°C e tempo de reação de 48 horas, em tampão acetato 50 mM (pH 4,5). Baseando-se no rendimento da reação de síntese de FOS, essa linhagem de Penicillium sp. foi selecionada para realização de estudos dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da FTase. Foi utilizada a metodologia de superfície de resposta para avaliar as condições ótimas de atividade enzimática, sendo estas: pH de 4,8 a 5,2, 54 a 57°C e sacarose (410 a 520 g.L-1). Os parâmetros termodinâmicos tempo de meia vida (t1/2), constante de desnaturação (kd) e valor de redução decimal (D) foram determinados para cada uma das quatro temperaturas estudadas (45, 50, 55 e 60°C). A energia de ativação da desnaturação (Ead) e o valor z também foram calculados para a FTase. A enzima estudada apresentou inibição pelo substrato quando a concentração de sacarose foi superior a 400 g/L. Os parâmetros cinéticos vmax, km e ki foram estimados pelos métodos de linearização de Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen e pelo modelo de clássico de inibição combinado com o modelo de Hill utilizando o software Statistica® 8.0. A análise das constantes sugere que há um fenômeno de inibição que afeta a enzima e não foi possível a identificação de quais componentes do sistema reacional causam a inibição enzimática, utilizando apenas o modelo clássico de inibição, sendo necessários estudos futuros para desenvolver o modelo cinético adequado para a FTase. Os resultados obtidos indicam que a FTase de Penicillium sp. tem potencial para ser aplicada em processos industriais para produção de FOS / Abstract: Nowadays, there is a high demand on health and low caloric food. Since the years of 1980 a big number of sweteners have appeared to replace sucrose. The fructooligosacchrides (FOS) are considered the most important sweeteners among them due their properties to promoting health by increasing of the amount of beneficial bacteria in human gut. They can be produced by simple transfructosilation reaction catalysed by fructosyltransferase (FTase), wherein one molecule of sucrose is hydrolyzed and the fructosyl radical is bonded to another sucrose. Some microorganisms have the gene encoding FTase and its industrial applications are well known. However, Brazil has a small share of patents registered around the world in these technological process. In this work, we aimed to find potential microorganisms strains that produce both FTase and FOS. New strains were isolated from Baru fruits of Brazilian Cerrado biome. Initially 54 isolated strains were screened for transfructosilating activity. As result it was found 13 strains which were able to produce FTase. Enzimatc extracts partially purified from each of 13 strains were evaluated in the ability to produce FOS in several reaction times (6, 12, 24, 48 and 72 h). The reaction conditions were 500 g.L-1 sucrose, 20% (v/v) enzime:solution, 100 rpm, 50°C and 48 h reaction time in acetate buffer 50 mM (pH 4,5). The Penicillium sp. FTase showed the highest yield of FOS synthesis. Hence this strain was selected to study the FTase kinetical and thermodynamical properties. The best conditions found using the Response Surface Methodology were: pH 4.8 to 5.2; 54 to 57°C and 410 to 520 g.L-1 sucrose. The thermodynamic parameters half-life (t1/2), denaturation constant (kd) and the decimal reduction time (D) were calculated to each of the four tested temperatures (45, 50, 55 e 60°C). The activation energy of denaturation (Ead) and the z-value were also calculated. This enzyme showed inhibition by substrate when the sucrose concentration was above 400 g.L-1. The kinetical parameters vmax, km e ki were estimated by Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen linearization methods. In addition, these constants were also estimated by classic model of inhibition combined with the Hill model using the StatisticaTM 8.0 software. The data analisys indicated an enzimatic inhibition fenomena. However, it was not possible to identify which agents triggered the enzimatic inhibition using only the classic model. It is necessary more future studies to elucidate the appropriated model to FTase. These results sugest that the FTase from Penicillium sp. has a great potential to be applied in further FOS industrial processes / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-27T15:37:31Z No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-27T20:47:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T20:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) Previous issue date: 2015-09-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cáries dentárias resultam de um desequilíbrio metabólico do biofilme dental, formado por bactérias, principalmente estreptococos e lactobacilos. Uma das formas de prevenir o processo carioso seria inibir a formação deste biofilme cariogênico. Este trabalho, portanto, objetiva verificar a inibição da formação de biofilme dentário formado por Streptococcus mutans (S. mutans) através da ação de quatro substâncias (epigalocatequina, clorexidina, xilitol e resveratrol), e verificar o provável mecanismo de ação a partir da expressão gênica das enzimas glicosiltransferase (GTF) e frutosiltransferase (FTF). O ensaio de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizado para quantificar a expressão dos genes. Foram realizados ainda, ensaios de viabilidade celular e para verificação de formação de biofilme após tratamento com as substâncias testes para determinar concentrações em que houvesse inibição da formação de biofilme em condições de viabilidade celular. As concentrações de xilitol, resveratrol e clorexidina que se mostraram eficazes foram 100 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,001 mg/mL, respectivamente, ou seja, concentrações nas quais houve inibição da formação de biofilme sem modificação da viabilidade bacteriana. A epigalocatequina não apresentou uma concentração que proporcionasse inibição de biofilme sem a consequente morte bacteriana. Os tratamentos foram realizados com o xilitol, o resveratrol e a clorexidina, e após realização de RT-qPCR (reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real de transcrição reversa) foram obtidos os resultados referentes à expressão dos genes ftf e gtfb. Houve uma diminuição significativa (72,8%) na expressão gênica do ftf após o tratamento com xilitol. O resveratrol não interferiu na expressão deste gene e a clorexidina provocou redução da expressão do gene de controle (housekeeping gene), inviabilizando a avaliação da expressão do ftf na concentração avaliada. Não houve modificação significativa na expressão de gtfb após o tratamento com o resveratrol e a clorexidina nas concentrações definidas. O xilitol reduziu a expressão do housekeeping gene 16S rRNA, indicando morte celular na concentração testada. Os resultados nos levaram a concluir que as três substâncias - resveratrol, xilitol e clorexidina - atuam como potenciais agentes inibidores de biofilme dentário formado por S. mutans. Verificou-se, entretanto, que o xilitol inibe a expressão do gene ftf, indicando que o provável mecanismo de ação de tal inibição da formação do biofilme foi através da redução da expressão deste gene do S. mutans. A clorexidina já possui reconhecida ação bactericida, entretanto neste trabalho verificamos uma concentração desta substância em que houve inibição de biofilme sem a consequente morte celular. Diante dos achados podemos propor outras formas de aplicação do xilitol e da clorexidina, em odontologia, e também a utilização do resveratrol como um agente inibidor do processo carioso, já que o mesmo é capaz de inibir a formação de biofilme dentário. A inibição do biofilme por estas substâncias seria interessante de modo que não geraríamos um desequilíbrio na flora bacteriana, mantendo, portanto, bactérias que atuam de forma positiva na cavidade bucal. Desta forma, outros estudos laboratoriais e clínicos são necessários 16 para demonstrar a eficácia de tais substâncias para prevenção ou até mesmo tratamento de cáries dentárias. / Dental caries results from a metabolic imbalance in the biofilm, formed by bacteria, especially streptococci and lactobacilli. One way of preventing caries process would be inhibit cariogenic biofilm formation. This work therefore aims to verify the possible inhibition of biofilm formation by Streptococcus mutans (S. mutans) after the treatment with four substances (epigallocatechin, chlorhexidine, xylitol and resveratrol), and to investigate the action mechanism through the expression of the genes glycosyltrasferase (GTF) and fructosyltransferase (FTF). The test of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was carried out to quantify the expression of these enzymes. Cell viability assays as well as tests for verification of biofilm formation were also carried out after the treatment with the test substances to determine the concentration when the inhibition of biofilm formation occurred under conditions of cell viability.The xylitol, resveratrol and chlorhexidine concentrations that proved effective were 100 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.001 mg/mL, respectively, concentrations in which there was inhibition of biofilm formation without modification of the bacterial viability. The epigallocatechin didn’t demonstrate a concentration that would provide biofilm inhibition without the consequent inhibition of bacterial viability. The treatments were performed with xylitol, resveratrol and chlorhexidine, and after completion of RT-qPCR (reverse transcription real time polymerase chain reaction), they’re obtained the results for enzyme expression of FTF and GTFB. There was a significant decrease (72.8%) in the enzyme FTF expression after treatment with xylitol. The resveratrol didn’t affect the expression of this enzyme and chlorhexidine caused reduced gene expression control (housekeeping gene), precluding to evaluate the FTF gene expression in the assessed concentration. There was no significant change in GTFB expression after treatment with resveratrol and chlorhexidine in defined concentrations. Xylitol reduced housekeeping gene 16S rRNA expression, indicating cell death in the concentration tested. The results led us to conclude that the three substances (resveratrol, xylitol and chlorhexidine) act as potential dental biofilm inhibitors formed by S. mutans. It was found, however, that xylitol inhibits FTF gene expression, indicating that the probable mechanism of action of such inhibition of biofilm formation was by reducing the expression of this S. mutans gene. Chlorhexidine has already recognized bactericidal action, however this work we see a concentration of this substance that was inhibiting biofilm without subsequent cell death. Considering those findings may suggest other ways of applying the xylitol and chlorhexidine in dentistry and also the use of resveratrol as an inhibitory agent of the carious process, since it is capable of inhibiting dental plaque formation. Biofilm inhibition these substances would be interesting to such an extent that there would generate an imbalance in the bacterial flora, thus keeping bacteria that act in a positive manner in the oral cavity. Thus, clinical studies are necessary to demonstrate the efficacy of these substances to prevent or even caries treatment.