La chromatine est une structure composée d'ADN et de protéines, principalement des histones, permettant la compaction du génome à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. Cette compaction de l'ADN, bien qu'essentielle, représente dans un même temps une barrière à plusieurs processus cellulaires exigeant un accès à l'ADN, dont la transcription génique. L'échange d'histones canoniques par des variants d'histones, tel H2A.Z, est un des moyens utilisés par les cellules pour reconfigurer la chromatine, et ainsi contrôler l'expression des gènes. Connaître les interactions protéiques de H2A.Z est donc une façon de mieux comprendre cette histone, mais également les mécanismes de transcription génique. Dans ce but, nous avons utilisé et optimisé une méthode basée sur une purification par affinité en tandem de protéines complexées à H2A.Z sur la chromatine, chez la levure Saccharomyces cerevisiae . Les partenaires protéiques de H2A.Z isolés de cette façon ont par la suite pu être identifiés à l'aide de la spectrométrie de masse, et c'est ainsi que la protéine Hsm3 a été relevée. La protéine Hsm3 était déjà connue comme étant importante pour la réparation des bases mal appariées, ainsi que comme chaperonne dans l'assemblage de la base de la sous-unité 19S du protéasome, mais aucun rôle en transcription ne lui était jusqu'à présent associé. Nous avons tenté de mieux caractériser cette protéine en construisant une souche de levure n'exprimant plus le gène HSM3 , puis en faisant des essais de croissance avec cette souche sur différents milieux. Ceci nous a permis de constater que Hsm3 est importante pour la croissance des cellules sur un milieu contenant de la caféine. À l'aide d'autres immunoprécipitations, nous avons par la suite pu confirmer l'interaction de cette protéine avec les histones H2A et H2A.Z sur la chromatine. Des essais d'expression ont finalement démontré la nécessité de Hsm3 pour l'induction de l'expression des gènes INO1, SUC2, GAL1 et GAL10 , mais seulement sous certaines conditions de croissance. Puisque cette protéine était déjà connue en tant que chaperonne du protéasome, nous avons vérifié si les phénotypes associés à la suppression de Hsm3 provenaient seulement d'un retard dans l'assemblage de ce complexe. Pour ce faire, nous avons comparé les effets de l'inactivation du protéasome à une suppression de Hsm3 sur l'induction de l'expression des gènes, mais nos résultats ne nous ont pas permis de confirmer ni d'infirmer cette hypothèse. En conclusion, la protéine Hsm3 interagit directement avec la chromatine, et est impliquée dans certains mécanismes de transcription génique, cette implication étant fortement dépendante des conditions de croissance utilisées.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cancer du côlon (CC) est le 3ème cancer le plus fréquent en France avec plus de 40 000 nouveaux cas diagnostiqués par an. Vingt-cinq à 40% des CC sont diagnostiqués à un stade II. La majorité des CC de stade II ne nécessite pas de traitement adjuvant par chimiothérapie, cependant, environ 20% de ces patients vont évoluer avec l'apparition de métastases viscérales. Or, seuls les facteurs histopathologiques ou la détermination du statut avec instabilité des microsatellites (type MSI) permettent d’orienter ou non vers une chimiothérapie complémentaire à la chirurgie. La majorité des CC de stade II ont un profil avec stabilité des microsatellites (type MSS) et les facteurs pronostiques actuels sont mal définis. La découverte de marqueurs pronostiques pour ces patients est donc un enjeu majeur de la prise en charge du CC. De cette façon, notre équipe a mis en évidence l’existence d’une signature moléculaire sur 166 tumeurs, portant sur l’expression différentielle de 7 gènes, entre les tumeurs de CC de stade II et les tumeurs de CC de stade III. Ensuite, le statut mutationnel des gènes KRAS et BRAF, effectué sur 803 CC métastatiques, a mis en évidence que la mutation BRAF V600E est principalement associée au CC de type MSS suggérant un impact pronostique négatif. Enfin, l’étude du statut du gène APC (mutations, LOH, hyperméthylation du promoteur) sur 183 CC de stade II montre que ce gène n’est vraisemblablement pas impliqué dans le développement de métastases du CC. En perspective de ce travail, l’arrivée de techniques de séquençage de nouvelle génération permet d’envisager un traitement adapté à la tumeur, orientant vers une médecine personnalisée. / Colon cancer (CC) is the third most common cancer in France with 40000 new cases diagnosed every year. For thirty years, death-rate has decreased through better therapeutic and screening management, and 40% of CC are diagnosed of stage II. Most of stage II CC do not require chemiotherapy adjuva,t to surgical resection. About 20% of patients with stage II CC relapse within 5 years following the diagnosis. Except microsatelitte instability (MSI) incombination with few hispathologic parameters, the molecular prognosis factors are not well defined and remain a major biological challenge in stage II CC. Our study analyzed the molecular signature of 166 tumors and determined the different expression of seven genes between stage II and stage III CC. KRAS and BRAF mutations were determined on 803 metastatic CC showing an association between V600E BRAF mutation and tumors with microsatellite stability (MSS). This result suggests a negative prognostic impact of BRAF mutation in MSS CC. Finally, the APC gene statut (mutations, LOH, promoter hypermethylation) of 183 stage II CC shows that this gene is probably not involved in the metastatic process. Further developments will consist in applying the next generation sequencing to allow the simultaneous analysis of hundreds target genes. In this way, the treatment will be adapted to each tumor, moving towards personalized medicine.

La floraison, une des étapes cruciales du cycle de vie des plantes, est influencée par les facteurs environnementaux tels que la température et la durée d'ensoleillement. La majorité des espèces végétales évoluant en zones tempérées ont fort avantageusement développé des mécanismes d'adaptation leur permettant de mieux synchroniser leur développement en condition de basses températures et de courte durée d'ensoleillement. En réponse au stress causé par une longue exposition aux basses températures, les plantes induisent un processus nommé vernalisation qui consiste à induire une floraison précoce chez les plantes sensibles. Cette capacité à promouvoir la floraison peut également être acquise selon la sensibilité de chaque plante par une longue ou courte exposition de lumière (photopériode). Ces mécanismes d'adaptation favorisent une floraison au moment opportun et assurent une bonne reproduction. Chez Arabidopsis, des analyses génétiques et moléculaires ont démontré que l'expression de nombreux gènes était modulée en réponse aux variations de basses températures et de lumière afin de bien synchroniser la transition florale. La plupart des gènes ayant un rôle majeur dans la régulation de la floraison en réponse aux variations de températures et de lumière code pour des protéines conservées chez les eucaryotes et impliquées dans divers aspects du développement et la reproduction des espèces: les facteurs de transcription de type MADS-box. D'ailleurs, toutes les voies de régulation de la floraison chez Arabidopsis convergent vers un répresseur central, le gène FLC (Flowering locus C) qui code pour un facteur de transcription de type MADS-box. Chez les céréales, aucun homologue de FLC n'est, à ce jour, identifié et très peu de gènes MADS-box ont une fonction connue. Afin de pousser la caractérisation des gènes MADS-box chez les céréales et d'élucider leurs rôles lors de la régulation de la floraison, l'identification de cette famille de gènes a été entreprise chez le blé. Le blé hexaploïde a été choisi comme modèle d'étude à cause de sa grande variabilité de réponses face aux stress, ce qui lui confère une grande résistance et aptitude à pousser dans des zones où le climat et les saisons sont variables. De plus. il est plus intéressant au niveau agronomique, nutritif et économique qu'Arabidopsis. Par contre, ce choix s'accompagne d'un grand défi du fait de la taille et de la complexité du génome du blé. mais également des caractéristiques structurales et évolutives de la famille de gènes MADS-box. Pour ces raisons, une approche génomique combinant des outils bioinformatiques et des études moléculaires a été utilisée. L'identification d'ADNc de MADS-box chez le blé hexaploïde, par recherche de bases de données, par PCR ou criblage de banques, montre que plus d'une cinquantaine de facteurs MADS-box sont codés par ses génomes. En général, ces facteurs présentent une grande conservation de structures et de fonctions durant l'évolution chez les angiospermes. Une analyse moléculaire sommaire de membres de la famille MADS-box, en réponse à la vernalisation et à la photopériode, a permis d'identifier et d'associer un de ces facteurs, nommé TaVRT-2, à la régulation de la floraison. En réponse à la vernalisation, l'ARNm de TaVRT-2 s'accumule seulement durant la phase végétative du blé d'hiver et ce profil est inversement proportionnel à celui du gène majeur de vernalisation VRNl/TaVRT-l. Ce résultat suggérait que TaVRT-2 pouvait retarder la transition florale en réprimant l'expression de TaVRT-l ou bien que Ta VRT-I induisait la floraison après la répression de TaVRT-2. Or, les études génétiques indiquaient que l'accumulation de TaVRT-l était un des événements les plus tardifs dans l'induction de la floraison. De plus, les études d'interactions protéiques indiquent que TaVRT-2 est capable de former des hétérodimères, surtout avec TaVRT-l. Enfin, la présence au niveau de son promoteur d'un élément cis spécifique au MADS-box suggérait plutôt que TaVRT-2 régule négativement l'expression de TaVRT-l. Toutes ces données soutenaient l'hypothèse que TaVRT-2 est un régulateur négatif de TaVRT-l et donc de la transition florale chez le blé. Grâce à des études de liaisons in vitro et par expression transitoire in vivo, il est démontré que la protéine TaVRT-2 réprime la transcription du gène TaVRT-l en se liant directement sur le promoteur et probablement en recrutant d'autres facteurs importants. Des études chez des plantes transgéniques confirment que TaVRT-2 est capable de retarder la floraison et qu'il est impliqué dans la voie autonome de régulation de la floraison. Le clonage des gènes MADS-box de blé a permis de voir que les acteurs majeurs impliqués dans la régulation de la vernalisation sont différents entre espèces monocotylédones et dicotylédones. En ce sens, l'identification de TaVRT-2 constitue une contribution importante dans l'étude des mécanismes de régulation de la floraison. L'implication de TaVRT-2 dans les voies de régulation de la floraison (vernalisation, photopériode et autonome) démontre qu'il est un répresseur central de la floraison chez les céréales à l'instar de FLC chez Arabidopsis. Ces résultats montrent à quel point une meilleure compréhension des mécanismes d'adaptation des plantes face aux changements environnementaux peut contribuer à une bonne synchronisation de la floraison et du développement chez les céréales. En perspective, cette étude offre des avenues intéressantes sur le plan de l'amélioration des stratégies agricultrices et de l'augmentation de la productivité céréalière. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Blé hexaploïde, Facteurs de transcription, MADS-box, Floraison, Vernalisation, Photopériode.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La préservation d'un stock de cellules souches fonctionnelles est indispensable pour le maintien de nombreux tissus chez l'adulte. Les cellules souches se multiplient pour s'auto-renouveller et entrent en différenciation donnant naissance à des progéniteurs puis à des cellules matures. Récemment, la possibilité pour les progéniteurs de se reprogrammer en cellules souches et de réacquérir un potentiel de régénération à long terme a été suggérée notamment dans le tissu germinal. Ainsi, l'auto-renouvellement et la reprogrammation des progéniteurs pourraient jouer un rôle dans le maintien du pool de cellules souches. Mon travail de thèse portait sur l'étude de ces deux mécanismes de régénération des cellules souches chez la souris. J'ai tout d'abord étudié la reprogrammation des progéniteurs germinaux au cours de la spermatogenèse. Ce travail montre la capacité des progéniteurs germinaux mâles, les spermatogonies différenciées, à modifier leur programme de différenciation et à générer de nouvelles cellules souches germinales après transplantation testiculaire. Les progéniteurs germinaux pourraient ainsi constituer une réserve de " cellules souches potentielles ". Le tissu germinal possède donc une certaine plasticité. La seconde partie de mon travail porte sur l'implication du gène Fancg de l'anémie de Fanconi, voie de réponse aux dommages à l'ADN, dans l'auto-renouvellement et la fonctionnalité des cellules souches hématopoïétiques au cours de l'hématopoïèse. L'intégrité génétique des cellules souches doit en effet être préservée tout au long de la vie de l'individu. Cette étude montre que l'invalidation du gène Fancg perturbe le processus de migration, la quiescence, et la régulation de l'expression de certains gènes clés des fonctions des cellules souches. Ces altérations participent au déficit fonctionnel des cellules souches hématopoïétiques observées dans le modèle murin Fancg-/-.

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative, elle représente 70% des formes de démences et affecte près de 860 000 personnes en France. Cette maladie est caractérisée par deux lésions neuropathologiques : les Dégénérescences neurofibrillaires et les Plaques séniles. Ces dernières sont principalement constituées de peptides amyloïdes (Aβ) résultant du clivage d'une protéine membranaire appelée Précurseur du peptide amyloïde (APP). L'étude des formes familiales monogéniques a montré que des mutations des gènes de l'APP et des Présénilines 1 et 2 conduisaient systématiquement à une augmentation de la production d'Aβ. Cette observation a permis l'élaboration de la cascade amyloïde plaçant le métabolisme de l'APP au centre du processus physiopathologique. Même si aujourd'hui ce métabolisme commence à être relativement bien connu, plusieurs zones d'ombres subsistent encore. Dans l'optique de caractériser de nouveaux acteurs intervenant dans ce métabolisme, nous avons émis une hypothèse qui repose sur deux constatations : (i) les protéines impliquées dans l'étiologie de la maladie sont différentiellement exprimées entre les cerveaux des patients et ceux des témoins (ii) dans le cerveau, de nombreuses métalloprotéases participent aux même mécanismes que l'APP (adhésion cellulaire, neuroinflammation, plasticité neuronale...), certaines sont aussi directement actrices du métabolisme de l'APP en tant qu'α-sécrétase (ADAM9, ADAM10 et ADAM17) ou en dégradant l'Aβ (NEP, IDE, MMP2, MMP3 et MMP9). Nous avons donc supposé que les métalloprotéases présentant une différence d'expression entre le tissu cérébral des malades et celui des témoins soient des candidates intéressantes pour moduler le métabolisme et le trafic de l'APP. Une première analyse transcriptomique par biopuce, à partir d'ARN totaux issus des cerveaux de 12 malades et de 12 témoins, nous a permis d'identifier quatre métalloprotéases présentant une différence d'expression significative (p<10-5) : ADAMTS16, ADAM17, ADAM30 et ADAM33. Nous avons cherché à confirmer ce résultat par une autre technologie sur un plus grand nombre d'échantillons (malades n=52 et témoins n=42). Seules ADAM30 et ADAM33 ont pu être validées. Nous avons également pu observer que l'expression d'ADAM30 dans le tissu cérébral des malades est inversement proportionnelle à la quantité d'Aβ42 déposée dans la parenchyme (Aβ42 la forme d'Aβ la plus neurotoxique). De plus, au niveau cérébral, l'expression d'ADAM30 est restreinte aux neurones, cellules sièges du métabolisme de l'APP. Nous avons donc sélectionné ADAM30 comme intervenante potentielle dans le métabolisme de l'APP. Pour tester notre hypothèse, nous avons sous- et sur-exprimé ADAM30 dans deux modèles cellulaires différents. Nous avons mis en évidence que la sur-expression d'ADAM30 entraîne une diminution de l'ensemble des produits du métabolisme de l'APP. En mutant le site catalytique de cette protéase, nous avons remarqué que cette action sur le métabolisme de l'APP est dépendante de cette activité catalytique. De manière cohérente, une sous-expression d'ADAM30 entraîne une augmentation de l'ensemble des produits du métabolisme de l'APP. En utilisant les inhibiteurs alcalisant, nous avons démontré que l'effet d'ADAM30 sur le métabolisme de l'APP met en jeu la dégradation par le lysosome. Des expériences d'immunofluorescence ont attesté qu'ADAM30 est localisée dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi et qu'elle co-localise fortement avec l'APP dans ces organites. Au vu des résultats obtenus durant ces quatre années, nous pensons qu'ADAM30 pourrait être une protéine clé de la régulation de l'APP en inhibant son acheminement jusqu'à la membrane plasmique et en favorisant sa dégradation par le lysosome. [...]

RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l'expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l'augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l'HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l'HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d'une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l'exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l'adulte (ATL). L'HCL et l'ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l'activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l'HCL et l'ATL. Notre objectif serait d'y restaurer l'expression de RHOH et ainsi d'essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s'est tout d'abord orienté sur l'étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l'expression du gène RHOH est principalement due à l'activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d'initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l'activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d'une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d'autre part, l'importance des membres de la famille Fos dans l'expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l'activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d'observer une variation biphasique de l'expression des transcrits RHOH initiés en amont de l'exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d'abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l'utilisation d'un ionophore pour le calcium, suivie d'une répression, mimée par l'analogue du DAG.

Le gène HIC1 a été caractérisé comme un gène suppresseur de tumeur situé en 17p13.3, une région hyperméthylée ou délétée dans de nombreux cancers. HIC1 code un répresseur transcriptionnel caractérisé par plusieurs domaines fonctionnels. Au niveau de la région centrale, se retrouve un motif conservé MK314HEP important pour la répression des gènes cibles de HIC1 au sein duquel la Lysine 314 est soit SUMOylée soit acétylée. HIC1 est au centre de boucles de régulation complexes mettant en jeu le gène suppresseur de tumeurs TP53 et la désacétylase SIRT1. En réponse aux cassures double brin de l’ADN (DSBs) non réparables, HIC1 réprime l’expression de SIRT1 favorisant ainsi l’apoptose médiée par p53. De plus, dans ces conditions on observe une augmentation de la SUMOylation de la Lysine 314 de HIC1 de manière dépendante de la kinase ATM, ce qui favorise l’interaction avec le complexe répresseur NuRD. HIC1 joue également un rôle dans la réparation des DSBs. Nous avons montré que la SUMOylation de HIC1 n’était pas nécessaire pour la réparation des DSBs. Grâce à une analyse de protéomique, nous avons identifié un site potentiel de phosphorylation LS694QG par des kinases de la famille PIKK. Ainsi, nous avons montré dans des fibroblastes humains BJ-hTERT, que la protéine HIC1 est rapidement phosphorylée sur la Sérine 694 par la kinase ATM en réponse aux DSBs. De plus, par la technique de « Comet Assay » nous avons montré que cette phosphorylation est importante pour la réparation.HIC1 jouerait donc un double rôle dans la réponse aux dommages à l’ADN : soit il agirait en tant que répresseur transcriptionnel dans le cas de DSBs non réparables, soit il faciliterait la réparation des DSBs. / The tumor suppressor gene HIC1 is located in 17p13.3, a region frequently hypermethylated or deleted in many cancers. HIC1 encodes a transcriptional repressor characterized by several functional domains. In the central region, the conserved MK314HEP motif is an Acetylation/SUMOylation switch motif centered on K314 which regulates the recruitment of MTA1, a component of NuRD repressor complexes. A regulatory feedback loop between HIC1, SIRT1 and P53 has been described. HIC1 directly represses the transcription of SIRT1, thereby modulating P53-dependent DNA damage responses. Furthermore, after induction of non-repairable DSBs (DNA Double Strand Breaks), we observed a SUMOylation increase dependant on the ATM kinase. Moreover, HIC1 also plays an important role in the repair of DSBs. Furthermore, comet assays with a non SUMOylable HIC1 point mutant (E316A) demonstrated that SUMOylation of Lysine K314 is dispensable for DNA repair. In addition, upon induction of repairable DSBs, we have identified by proteomic analyses, a potential phosphorylation site “LS694QG” for the PIKK family kinases ATM and DNA-PKcs. Moreover, we have shown that HIC1 is rapidly phosphorylated by ATM upon DNA damage induction in normal human fibroblasts (BJ-hTert). Furthermore, comet assays with a non phosphorylable HIC1 point mutant have shown that this phosphorylation is very important for the contribution of HIC1 to the repair of DSBs. Thus, HIC1 plays different role during the DNA damage response to DNA double strand breaks depending on their intensity.