L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques récessives. FRDA est due à une mutation du gène de la frataxine (FXN) situé sur le chromosome 9, q13. Cette mutation est une augmentation du nombre de répétitions du trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de moins 30 chez les sujets normaux jusqu’à 1300 chez les patients. Cela a pour conséquence de diminuer l’expression de la protéine frataxine, une protéine qui joue un rôle important dans le métabolisme du fer dans la mitochondrie. Monprojet traite de l’utilisation des protéines TALE-platinum (plTALE) fusionnées avec des systèmes permettant une stimulation de la transcription(FT), tel que VP64 ou P300. Ces plTALEs ciblent spécifiquement la région régulatrice du gène FXN pour augmenter sa transcription et ainsi induire une augmentation de l’expression de la protéine frataxine. Les plTALEs contiennent des variations au niveau des acides aminés 4 et 30 pour chaque RVD (Repeat Variable Di-residues) en plus des variations des acides aminés 12 et 13. Ces variations permettent d’augmenter la spécificité des plTALEs pour les séquences nucléotidiques ciblées. L’assemblage des RVD de plTALEs a été fait par 4-modules RVD ce qui permet d’obtenir un rendement d’assemblage de 100%. Nous avons produit 34 effecteurs plTALE-FT qui ciblent 14 séquences du gène FXN afin, de sélectionner 3 plTALE-VP64 et 2 plTALE-SunTag10X qui peuvent augmenter la transcription et l’expression du gène FXN de 2 fois jusqu’à 19 fois dans les différentes cellules modèles FRDA. Nous avons quantifié le taux de synthèse des ARNm et de la protéine FXN après le traitement in vitroavecces plTALEs-FT par qRT-PCR et westerns. Les résultats montrent que ces plTALES-FT sélectionnés induisent l’activité transcriptionnelle du gène endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine in vitro. L’augmentation de la frataxine augmente l’activité d’aconitase qui est modulée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Nous avons utilisé un virus AAV9 pour livrer plTALE-FT dans les souris modèles de FRDA dans le but de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivoavant de passer aux tests précliniques. Les résultats de ces traitements in vivo ne sont pas encore disponibles. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most frequent autosomal recessive hereditary ataxia. FRDA is due to a mutation of the frataxin gene (FXN) located on chromosome 9, q13. This mutation is an increase in the number of repetitions of the trinucleotide GAA in the 1st intron of the frataxine gene (FXN). The number of trinucleotides increases from less than 30 in normal subjects up to 1300 in patients. This decreases the expression of the protein frataxin, a protein which plays an important role in the metabolism of iron in the mitochondria. My project deals with the use of TALE-platinum (plTALE) proteins fused with transcription-enhancing systems (FT), such as VP64 or P300. These plTALEs specifically target the regulatory region of the FXN gene to increase its transcription and thusinduce an increase in the expression of the frataxin protein.The plTALEs contain variations in amino acids 4 and 30 for each Repeat Variable Diresidues in addition to the variations of amino acids 12 and 13. These variations make it possible to increase the specificity of the plTALEs for the targeted nucleotide sequences. The assembly of the RVDs of plTALEs was done using modules containing 4 RVDs, which makes it possible to obtain anassembly efficiency of 100%. We produced 34 plTALE-FT effectors that target 14 sequences of the FXN gene to select 3 plTALE-VP64 and 2 plTALE-SunTag10X, which increased FXN gene transcription and expression by up to 19-folds in different FRDA model cells. We quantified the synthesis of mRNAs and of FXN protein after in vitro treatment with these plTALEs-FT by qRT-PCR and westerns. The results show that these selected PlTAL-FT induced the transcription of the endogenous FXN gene as well as the expression of the frataxin protein in vitro. The increase in frataxin increased the aconitase activity, which is modulated reversibly by the level of frataxin in the mitochondria. We used an AAV9 virus to deliver plTALE-FT in FRDA model mice to validate the efficacy of these effectors in vivobefore proceeding to preclinical testing. The results of these in vivotreatments are not yet available.

L’immunité végétale est garantie par plusieurs niveaux d’action dont l’interconnexion et les voies signalétiques sont peu élucidées. Deux des trois couches de défenses immunitaires sont constituées par les protéines NB-LRR (Nucleotide-Binding Leucine-Rich Repeat), encodées par les gènes de Résistance (gènes R), et l’interférence à ARN (iARN). L’étude de la voie de signalisation induite par l’activation des NB-LRR en réponse à la reconnaissance (directe ou indirecte) de protéines pathogéniques est très compliquée, car cette réponse culmine, dans la majeure partie des cas, en un phénotype macroscopique de mort cellulaire dénommée Réponse hypersensible (HR), empêchant toute analyse biochimique. Récemment, il a été montré chez Nicotiana benthamiana que la réponse antivirale déclenchée par la protéine NB-LRR N, qui n’induit pas de HR lorsqu’activée, implique la répression de la traduction de l’ARN viral. Dans ce système, la résistance conférée par N est dépendante de la protéine AGO4 dont le rôle dans l’iARN est assez bien défini. En effet, bien que l’ARN viral se multiplie à l’intérieur de la cellule hôte, il n’est pas associé à la machinerie de traduction et ne produit donc plus de virions. Cependant, nous ne connaissons pas à ce jour les évènements de régulation de l’expression génique responsables de ce mécanisme de défense. Les études du transcriptome immunitaire chez Arabidopsis thaliana n’ont révélé que peu de candidats majeurs impliqués dans la réponse NB-LRR, alors que certaines études mettent en lumière l’implication de la régulation de l’expression génique, au niveau traductionnel, dans la réponse immunitaire. En s’appuyant sur les travaux de Bhattacharjee et al. (2009), nous avons entrepris de caractériser, au niveau cellulaire, la répression de la traduction de l’ARN viral pendant la réponse induite par N. Nous observons, dans un système inductible permettant de déclencher la réponse immunitaire après l’établissement de l’infection virale, une large formation de granules à ARN appelés PBs (Processing Bodies), en conséquence de l’inhibition spécifique de la traduction de l’ARN viral. Le mécanisme effecteur de cette répression est différent des mécanismes de répression traductionnelle mis en place en réponse à la perception de stress tel que les UVs, ou de l’induction des mécanismes de répression traductionnelle par l’iARN. De plus, des plantes d’Arabidopsis mutantes pour une protéine fonctionnant dans les PBs sont plus résistantes à des bactéries phytopathogènes. D’une façon intéressante, on détecte un niveau d’expression augmenté de certains gènes de défense dans ce mutant, de manière similaire à des mutants d’Arabidopsis compromis dans l’une des voies de dégradation des ARNm. En parallèle, nous avons développé des outils transgéniques pour déterminer si la régulation de la traduction des ARNm de l’hôte, à l’échelle génomique, joue un rôle dans l’établissement de l’immunité. Nous avons généré une lignée d’Arabidsopsis exprimant sous le contrôle d’un promoteur inductible le facteur d’Avirulence (Avr) AvrRpm1, dont la présence est reconnue par la protéine NB-LRR RPM1; en combinaison avec une protéine ribosomale étiquetée nous permettant d’immunopurifier les ribosomes avec les ARNm en cours de traduction. Le séquençage à haut-débit des ARN totaux et des ARNm engagés dans la traduction a révélé que cinq fois plus de gènes sont régulés au niveau traductionnel par rapport au niveau transcriptionnel, après l’induction de la réponse NB-LRR. Une analyse comparée avec les connaissances précédentes a révélé que la réponse NB-LRR induit l’expression de 20% des gènes NB-LRR totaux, qui sont aussi constitutivement exprimés dans des mutants compromis dans certains processus de dégradations des ARNm. Cependant, la réponse NB-LRR induit l’expression de centaines de gènes précédemment impliqués dans les défenses, ce qui n’est pas le cas dans les mutants de dégradation d’ARNm, soulignant ainsi la spécificité de la réponse NB-LRR. Une analyse bio-informatique a déterminé qu’environ cinq cent gènes sont régulés au niveau traductionnel de manière indépendante de leur abondance totale, fournissant une liste de nouveaux candidats potentiellement impliqués dans l’immunité NB-LRR et spécifiquement régulés au niveau traductionnel. Une analyse génétique de certains mutants de ces gènes candidats dans les défenses a été entreprise, et a révélé que des plantes d’Arabidopsis TOR-déficientes ou mutantes pour les gènes CIPK5, CCT2 et BIG possèdent une résistance altérée positivement pour les TOR-déficientes ou négativement pour les autres, par rapport à une plante sauvage. Dans leur ensemble, ces résultats prouvent une grande implication de la régulation de la traduction dans la mise en place de l’immunité végétale.

La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels. L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13 carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin-Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post-Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes (créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes autonomes bénins. Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres groupes (Huang et al, 2001 ; Wasenius et al, 2003 ; Jarzab et al, 2005 ; Eszlinger et al, 2004). De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman) ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie). L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire et tissulaire de ces protéines. La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N-cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées. L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) implique l’utilisation d’un système de livraison musculaire efficace. L’évaluation d’oligonucléotides antisens (ASO) en conformation gapmer nous a permis d’identifier deux ASO, un de chimie 2’-O-méthoxyéthyle et l’autre avec des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint, dont l’efficacité dans les modèles cellulaires et de souris de la DM1 était suffisante pour réduire significativement l’ARNm étendu de la DMPK. Il fut possible d’observer une réduction des foci nucléaires menant à une redistribution d’un régulateur d’épissage séquestré au noyau, ainsi corrigeant des erreurs d’épissage caractéristiques de la DM1. Plus particulièrement chez la souris DMSXL, l’injection systémique bihebdomadaire a mené à une maturation des fibres musculaires ainsi qu’au rétablissement de la force musculaire des sujets. Ce projet est la preuve de principe in vitro et in vivo qu’une thérapie génique par les ASO est concevable pour le traitement de la DM1. / A gene therapy for myotonic dystrophy type 1 (DM1) implies an effective muscular delivery method. The evaluation of antisenses oligonucleotides (ASO) enabled us to identify two gapmer ASOs, one with a 2’-O-methoxyethyl chemisty and the other with a constrained ethyl bicyclic nucleic acid, whose efficacy in DM1 cell and mouse models was sufficient to significantly reduced expanded hDMPK mRNA levels. Furthermore, reduction in DMPK induced nuclear foci resulted in redistribution of a sequestered alternative splicing regulator, leading to correction of mis-splicing events characteristic of DM1. In DMSXL mouse, biweekly systemic injection of ASOs induced muscle fiber maturation and a gain in forelimb strength. This project is the in vitro and in vivo proof of the principle that an ASO gene therapy is conceivable for treatment of DM1.

Depuis les dernières décennies, la parentalité est un projet qui se voit pour plusieurs repoussé à un âge plus avancé. Par conséquent, de plus en plus de couples font face à des problèmes d'infertilité lors que vient le temps de fonder une famille. Le recours aux techniques de procréation médicalement assistée, telle que la fécondation in vitro, est donc lui aussi en constante augmentation. Malgré les nombreux progrès réalisés depuis l'introduction de la fécondation in vitro dans les années 80, le taux de succès de cette technique demeure insatisfaisant, avec un taux de grossesse autour de 30%. La réponse des patientes au traitement de stimulation ovarienne précédant la fécondation in vitro est extrêmement variable et difficile à prédire. De plus, lorsqu'un cycle échoue, c'est généralement sans raison apparente. Les travaux de cette thèse reposent sur l'hypothèse qu'il existe une signature moléculaire liée aux différentes réponses/causes d'échec. L'expression des gènes pourrait être utilisée pour caractériser la réponse des patientes à la stimulation hormonale de façon à pouvoir adapter le traitement suivant et potentiellement améliorer les chances de succès. Nous nous sommes donc intéressés à l'expression des gènes dans les cellules de la granulosa provenant principalement de follicules en contexte de stimulation hormonale, durant la période 34 heures post hCG ou encore provenant d'un modèle in vitro de culture cellulaire. Dans un premier temps, des cellules folliculaires provenant de femme ayant recourt à la fécondation in vitro ont été récoltées lors de la ponction ovarienne. Une biopuce fut utilisée afin de comparer l'expression des gènes entre les patientes pour qui le cycle de fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) et celles pour qui ce fut un succès(grossesse). Nous avons constaté qu'il existe une signature transcriptomique différente chez les patientes pour qui le cycle a échoué. De plus, l'analyse des gènes différentiellement exprimés et des principales voies biologiques y étant associée nous ont renseignés davantage sur les mécanismes physiologiques potentiellement liés à l'échec, notamment un débalancement inflammatoire, une différenciation anormale et une augmentation de l'apoptose. Par la suite, 135 échantillons de cellules folliculaires provenant exclusivement de patientes pour qui la fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) ont été utilisés. Des gènes liés à différentes causes d'échec potentielles ont été analysés en qRT-PCR, avant de réaliser une analyse de regroupement hiérarchique (clustering). La population de patientes non enceintes fut divisée en trois groupes possédant chacun un modèle d'expression génique particulier lié à une cause d'échec potentielle. Nous avons ainsi pu voir qu'il était possible de distinguer différentes causes d'échec ou différentes réponses folliculaires chez les patientes dont le cycle a échoué. Nous avons finalement utilisé un modèle in vitro de cellules de la granulosa humaine (lignée cellulaire KGN) afin d'étudier la capacité des cellules de la granulosa de répondre, à elles seules, à différents stimuli inflammatoires. Cette étude nous a permis de voir, via l'expression de gènes d'inflammation, que les cellules de la granulosa peuvent créer une réponse inflammatoire et que celle-ci est différente selon le type de stimulus. Globalement, les résultats de ces études améliorent les connaissances et la compréhension de l'échec en contexte de fécondation in vitro. Ils mettent également en lumière le potentiel de l'expression des gènes comme outil de diagnostic de la réponse folliculaire. Finalement, ils confirment également l'importance de l'inflammation et de son contrôle, particulièrement en contexte de procréation assistée. / Since the last few decades, couples tend to postpone parenthood to later in life. As a result, an increasing number of couples are facing infertility problems when it comes to building a family and have children. Consistently, the use of assisted reproductive technologies such as in vitro fertilization is also increasing. Despite all the progress that has been made since the introduction of in vitro fertilization in the 1980s, the success rate of this technique remains low, with a pregnancy rate around 30%. The patient's response to the stimulation treatment that precedes in vitro fertilization is extremely variable and difficult to predict. Moreover, when a cycle fails, most of the time there is no apparent reason. The hypothesis of this thesis is that there is a transcriptomic signature in follicular cells that reflects the ovarian response. Gene expression could be used to characterize the patient's response to the hormonal stimulation in order to adapt the next treatment accordingly and thus potentially improve the chances of success. Our work focuses on the gene expression in granulosa cells coming mainly from stimulated follicles in the context of in vitro fertilization or from an in vitro cell culture model. First, follicular cell samples from women undergoing in vitro fertilization treatment were obtained. We used a microarray to compare gene expression between patients that did not become pregnant following the in vitro fertilization cycle and those that did. We found that there is a different transcriptomic signature in patients who failed to conceive following in vitro fertilization. In addition, the analysis of the differentially expressed genes and the related biological pathways gave us more information on the physiological mechanisms potentially related to IVF failure, such as inflammatory imbalance, abnormal differentiation and increased apoptosis. For the next study, 135 follicular cell samples coming exclusively from patients who failed to conceive following in vitro fertilization (no pregnancy) were used. Genes related to different potential failure causes were analyzed using qRT-PCR and a hierarchical clustering analysis was then performed. The population of non-pregnant patients was divided into three groups, each one having a specific gene expression pattern related to a potential failure cause. The results of this study showed that it is possible to distinguish different failure causes or different follicular responses in patients whose cycle had failed. We finally used an in vitro model of human granulosa cells (KGN cell line) to see if pure granulosa cells were able to respond to different inflammatory stimuli. This preliminary study showed, through the expression of inflammation-related genes, that granulosa cells alone are able to create an inflammatory response and that this response differs depending on the type of stimulus. Taken together, the results of these studies improve the current knowledge and our understanding of in vitro fertilization failure. They also highlight the potential of gene expression to serve as a follicular response diagnostic tool. Finally, they also confirm the importance of inflammation and its control, particularly in the context of assisted reproductive technologies.

Thèse ou mémoire avec insertion d’articles / La complexité et le coût de production à grande échelle des rAAV présentent un sérieux obstacle à la commercialisation des thérapies géniques. Des améliorations dans la fabrication des vecteurs rAAV sont réalisables à l'aide de lignées cellulaires d'empaquetage ou productrices, qui, dans le cas des rAAV, sont difficiles à générer en raison de la toxicité des protéines AAV Rep et des gènes auxiliaires d'adénovirus nécessaires à la production. Le gène AAV REP code pour quatre protéines Rep (Rep -78, -68, -52, -40) qui ont de multiples fonctions et rôles qui se chevauchent dans la production d'AAV. Les gènes auxiliaires adénoviraux utilisés dans la production de rAAV sont E2A, E4 et VA et jouent des rôles uniques dans le cycle de vie de l'AAV. Pour générer une lignée cellulaire d'empaquetage de AAV, tous ces composants doivent être intégrés de manière stable dans le génome des cellules. L'expression doit être étroitement régulée en raison de la cytotoxicité et lorsque l'expression est induite, les niveaux doivent être adéquats pour soutenir la production de rAAV. Une telle lignée cellulaire d'empaquetage serait un point de départ pour créer une lignée cellulaire productrice pour la production d'un sérotype spécifique d'AAV et d'un gène thérapeutique spécifique en intégrant un gène CAP d'intérêt et une séquence thérapeutique flanquée d'ITR. Le travail présenté dans cette thèse décrit le processus de génération et de caractérisation des lignées cellulaires d'empaquetage 293SF-CymR/λR-GyrB AAV exprimant les protéines Rep et les conceptions et tentatives de création d'une lignée cellulaire d'empaquetage Rep/Helper. Nous avons identifié et intégré avec succès une combinaison de deux protéines Rep (Rep68 et Rep40) exprimées à partir de deux promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. Les lignées cellulaires créées ont démontré leur capacité à produire des titres à des niveaux comparables aux productions par transfection transitoire avec les lignées cellulaires parentales et se sont avérées stables en culture sans sélection. Nous décrivons également notre conception et nos travaux de recherche sur la faisabilité pour générer des lignées cellulaires d'emballage Rep/Helper où les séquences codant pour les protéines E4orf6 et E2A DBP sont également exprimées à partir de promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. / The complexity and cost of large-scale rAAV production present a serious obstacle in commercialization of rAAV gene therapies. Improvements in rAAV vector manufacturing are achievable using packaging or producer cell lines, which in case of rAAVs are difficult to generate due to the toxicity of AAV Rep proteins and adenovirus helper genes required for production. The AAV REP gene encodes four Rep proteins (Rep -78, -68, -52, -40) which have multiple overlapping functions and roles in AAV production. The adenoviral helper genes used in rAAV production are E2A, E4 and VA and serve unique roles in the AAV lifecycle. To generate an AAV packaging cell line all these components must be stably integrated into the genome of the cells. Expression must be tightly regulated due to cytotoxicity and when expression is induced, the levels must be adequate to support rAAV production. Such a packaging cell line would be a starting point to create a producer cell line for production of a specific serotype of AAV and specific therapeutic gene by integrating a CAP gene of interest and ITR flanked therapeutic sequence. The work presented in this thesis describes the process of generating and characterizing 293SF-CymR/λR-GyrB AAV packaging cell lines expressing the Rep proteins and the designs and attempts of creating a Rep/Helper packaging cell line. We successfully identified and integrated a combination of two Rep proteins (Rep68 and Rep40) expressed from two cumate and coumermycin inducible promoters. The created cell lines demonstrated ability to produce titers at levels comparable to transient transfection productions with the parental cell lines and were shown to be stable in culture without selection. We also describe our design and investigation into the feasibility of Rep/Helper packaging cell line generation where the E4orf6 and E2A DBP protein coding sequences are also expressed from cumate and coumermycin inducible promoters.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique liée au chromosome X qui atteint un garçon sur 3 500. Cette maladie est caractérisée par l'absence de dystrophine à la surface des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres se brisent plus fréquemment et une faiblesse musculaire progressive apparait. Les patients décèdent généralement au début de la vingtaine. Il n'y a présentement aucun traitement pour cette pathologie. La greffe de cellules myogéniques est une thérapie possible, mais se heurte à un rejet par le système immunitaire du patient. Pour contourner ce problème, il est possible de développer une thérapie génique ex vivo, basée sur la greffe de cellules autologues modifiées génétiquement. Malheureusement, aucune technique efficace de modification génétique des cellules n'était disponible il y a quatre ans. Nous avons testé deux nouvelles techniques de modification génétique. Une première est non virale et la seconde utilise les lentivirus. La première consiste à transfecter un plasmide d'expression de la dystrophine par Nucléofection. Pour intégrer les séquences, un second plasmide, codant pour l'intégrase PhiC31, est aussi introduit dans les cellules. Cette technique nous a permis de stabiliser des plasmides allant de 7 kb à 21 kb, ce qui en fait les plus grosses séquences jamais stabilisées dans des cellules de culture primaire humaine. Cette expression a pu être détectée dans les fibres musculaires après une greffe. Nous avons aussi utilisé des lentivirus pour effectuer une modification génétique des cellules. Ce vecteur viral est très efficace pour introduire des cassettes d'expression pour des versions tronquées de la dystrophine. L'expression de cette dystrophine est détectable in vitro, mais aussi in vivo après la transplantation. De plus, une cassette servant à faire le saut d'exon thérapeutique a aussi été introduite dans des cellules myogéniques et a permis de faire exprimer une dystrophine presque complète par des cellules issues de patients DMD. Cette expression a aussi été détectée dans des modèles murins. Ces travaux constituent une preuve de principe de la faisabilité d'une thérapie génique ex vivo pour la DMD. Plusieurs améliorations restent à apporter, mais il semble que ces travaux laissent croire qu'un essai clinique sera réalisable. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked muscle genetic illness that afflicts one boy per 3 500. Cell therapy is a possible cure for this illness that usually kills patients around age 25. Transplantation of the heterologus myogenic cells is, however, restricted by the immune rejection by the patient. Ex vivo gene therapy offers an evasion to this problem. Introduction of the therapeutic gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation is the base of this therapeutic. Four years ago, no efficient procedure to stably modify myogenic cells was available. New gene introduction techniques were thus tested in the present thesis. The first one is a non-viral method. We used a new transfection technology (Nucleofection) to introduce plasmid DNA coding for dystrophin with success. To stabilize the expression, human myogenic cells were co-nucleofected with a PhiC31 expressing plasmid. This integrase was capable of stabilising expression plasmids ranging from 7 kb to 21 kb. This very large sequence was the largest plasmid ever stabilised into human primary cultured cells. The presence of full-length dystrophin protein was detected in vitro and confirmed in vivo, after the transplantation of the myogenic precursor. Another technique was used: the lentiviral vectors. These viral vectors were designed to deliver an expression cassette for a truncated version of the dystrophin gene. The viral vector was efficient at modifying the cells. The expression was shown in vitro and in vivo after the transplantation of the modified cells. The lentiviral vectors were also essayed to deliver a U7 exon skipping cassette into DMD cells. It was then possible to demonstrate that this introduction led to the expression of a quasi normal dystrophin protein in vitro. The expression was also shown in vivo after the transplantation into SCID mice model. A non-viral approach combining nucleofection and the PhiC31 integrase may eventually permit safe auto-transplantation of genetically modified cells. The utilisation of lentiviral vectors also provided evidences that an ex vivo gene therapy is possible for DMD. We believe these results are paving the way to an eventual clinical trial for ex vivo gene therapy.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.