Environ 3500 tonnes de pesticides sont étendues chaque année sur les terres agricoles du Québec. L’utilisation de plusieurs de ces substances a été interdite, car les ingrédients actifs qui les composaient avaient des effets toxiques sur les humains et/ou l’environnement. Malheureusement, certains qui sont toujours en vente ont aussi des effets secondaires non désirables. En effet, ces molécules exogènes ont le potentiel de moduler l’activation de protéines régulatrices comme le récepteur aux dioxines (AhR). AhR active, entre autres, l’expression de gènes faisant partie de la famille du cytochrome P450 (CYP1A1 et CYP1B1) qui sont impliqués dans la détoxification. Or, dans certains cas, ces enzymes mènent à la production de molécules mutagènes en augmentant la toxicité des ingrédients actifs en les métabolisant. Le projet global dans lequel s’insère ce projet de maîtrise vise à déterminer les effets génomiques des pesticides environnementaux sur des organismes vivants en milieu naturel dans les environs de la région de l’Estrie. Les espèces choisies comme modèles d’étude sont des insectivores, car les pesticides s’accumulent dans les lipides et que les insectes en sont une excellente source. Les consommateurs d’insectes sont donc d’excellents marqueurs du niveau de contamination de leur environnement par les pesticides. Les deux espèces sélectionnées sont l’hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor) et la grande musaraigne (Blarina brevicauda). De façon plus spécifique, le projet de maîtrise se divise en deux principaux objectifs. Le premier objectif est de valider que les pesticides présents dans l’environnement sont en concentration suffisante pour modifier la régulation génétique d’animaux en milieu naturel. Cette validation se fera en comparant le taux d’expression de CYP1A1 et CYP1B1 (suite de leur activation par AhR) chez des bêtes ayant été exposées (ou non) à des pesticides. Comme le génome des deux modèles d’étude n’est pas encore séquencé, le clonage partiel des gènes à étudier (AhR et CYP1) a été entamé de même que la conception d’amorces qui permettra de quantifier le niveau d’expression de ces gènes par des réactions en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR). À ce jour, une partie de la séquence d’AhR, de CYP1B1 et de trois gènes contrôles ont été séquencés pour l’hirondelle, ce qui a permis de concevoir des amorces pour la quantification de l’expression d’AhR et de deux contrôles. Pour la musaraigne, ce sont les gènes AhR, potentiellement CYP1A1 et trois contrôles qui ont été séquencés partiellement et ce sont les gènes AhR et les contrôles pour lesquels des amorces sont prêtes à être utilisées pour la quantification par qPCR. Le deuxième objectif est d’observer les effets génétiques des pesticides de manière globale sur des organismes vivants. Un génome de référence est donc nécessaire pour identifier les régions qui vont être régulées (directement ou indirectement) par les polluants d’origine agricole. Pour la grande musaraigne, c’est le génome de la musaraigne commune (Sorex araneus) qui sera utilisé, car ces deux espèces sont très proches phylogénétiquement. Par contre, pour l’hirondelle bicolore, le séquençage, l’assemblage et l’annotation de son génome seront essentiels parce que les espèces d’oiseaux actuellement séquencées sont trop éloignées pour permettre l’identification des régions qui seront régulées différemment en présence de pesticides. Le séquençage a été fait et l’assemblage a permis de couvrir 55% du génome de l’hirondelle bicolore. Cependant, il est très fractionné avec un N50 de 1339 et un peu plus de 600 000 contigs. Quelques étapes restent à accomplir pour optimiser l’assemblage tel que l’élimination de la contamination (estimée à 5%). L’annotation pourra être faite lorsque l’étape précédente sera finie. Compte tenu de l’ampleur du projet, ce qui a été effectué dans le cadre de la maîtrise contribuera grandement à la bonne continuation de celui-ci. Le projet global permettra de mieux comprendre l’impact des pesticides sur des organismes sauvages.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines des groupes Polycomb et trithorax sont des régulateurs épigénétiques très conservés qui permettent le maintient de l'identité cellulaire en régulant le niveau d'expression des gènes. Ils agissent sur leurs gènes cibles à travers des éléments régulateurs en cis, appelés éléments de réponse aux Polycombs (PRE). Dans des tests transgéniques, il a été montré que deux copies du même PRE sont fréquemment regroupés dans la même région nucléaire. Dans le cas particulier du PRE Fab-7, ce regroupement corrèle avec sa fonction répressive. Durant ma thèse, j'ai tenté de cloner un outil bicolore qui permet la visualisation en 4D de deux PRE Fab-7 stablement intégrés dans le génome de Drosophila melanogaster. De plus, j'ai amélioré le protocole de DNA-FISH du labo. Ceci m'a permis d'identifier vestigial et apterous comme étant des loci qui forment des associations nucléaires, de façon dépendante de la transcription, dans Drosophila melanogaster. / Polycomb- and trithorax-Group proteins are highly conserved epigenetic regulators which maintain cell identities by maintaining states of gene expression. They act on their target genes through /cis/ regulatory elements, named Polycomb Response Elements (PREs). In transgene assays it has been shown that two copies of the same PRE are frequently found clustered in nuclear space and for one particular PRE named Fab-7 clustering is correlated with its repressive function. In the course of this thesis I tried to clone a two colour real-time tool which allows distinguishing in 4D two /Fab-7/s stably integrated into the genome of Drosophila melanogaster. Additionally, I improved the DNA-FISH protocol of the lab and identified vestigial and apterous as potential gene loci forming nuclear associations dependent on transcription in Drosophila melanogaster.

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Notre travail concerne la transfection génique. Celle-ci nécessite l'envoi au noyau cellulaire d'ADN exogène, c’est-à-dire, d'une grosse molécule hydrophile, qui, normalement ne peut pénétrer dans la cellule que par endocytose. Or, un tel processus conduit habituellement à une dégradation de la molécule, en grande partie dans les lysosomes. Dans notre introduction, après un bref rappel sur l'endocytose, nous présenterons les moyens qui permettent à l'ADN exogène d'échapper à une hydrolyse intracellulaire et d'atteindre le noyau sous une forme fonctionnelle. Les résultats que nous avons présentés nous apportent des informations sur l’influence de l’injection hydrodynamique sur l’endocytose par le foie. Rappelons que notre travail avait deux buts principaux : contribuer à l’élucidation du mécanisme de la transfection hydrodynamique et rechercher si l’injection hydrodynamique pouvait présenter des avantages pour introduire des protéines dans les cellules hépatiques.

Deux classes de poly(A)-binding protein (PABP) lient la queue poly(A) des ARNm chez la plupart des mammifères: PABPC1 au cytosol et PABPN1 au noyau. PABPC1 stimule la traduction des ARNm tandis que PABPN1 stimule la processivité de la poly(A) polymérase tout en contrôlant la taille des queues poly(A). Il est à noter que les orthologues de PABPC1 sont bien caractérisés chez la levure, toutefois un homologue de PABPN1 n'avait jamais été identifié. Précédemment, le Dr. Bachand avait réalisé une purification par affinité avec la protéine d’arginine méthyltransférase I (Rmt1) couplée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d'identifier l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission. Différentes expériences ont démontré que Pab2 est une protéine nucléaire non-essentielle qui lie spécifiquement des séquences poly(A) in vitro. Pab2 a été identifiée par son interaction avec Rmt1 et cette enzyme méthyle les arginines présentes dans le domaine riche en arginine de la protéine Pab2. Cette modification post-traductionnelle n'affecte pas la localisation nucléaire et l’affinité aux séquences poly(A) de Pab2. Par contre, les niveaux d’oligomérisation de Pab2 sont nettement augmentés lorsque Pab2 n’est plus méthylée. De plus, les ARNs provenant de cellules [Delta]pab2 sont hyperadénylés, ce qui corrobore avec la fonction de PABPN1 à contrôler la taille des queues poly(A) in vitro. Par la suite, j'ai caractérisé l’implication de Pab2 durant la maturation du pré-ARNm. Des essais d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont établi que Pab2 est recrutée co-transcriptionnellement aux gènes activement transcrits. De façon surprenante, mes études ont démontré que le recrutement de Pab2 précède celui d'un facteur impliqué dans le clivage et la polyadénylation. De plus, le recrutement de Pab2 dépend de l’ARNm naissant. Conséquemment, j'ai voulu identifier les protéines associées à Pab2. Ainsi, une purification d’affinité par tandem couplée à la spectrométrie de masse a révélé que Pab2 est associée à plusieurs protéines ribosomales ainsi que des facteurs de traduction générale. Ces données étaient étonnantes puisque la traduction des ARNm implique la protéine Pab1. Par conséquent, il était pertinent de vérifier le rôle possible de Pab2 sur la traduction. À priori, j ’ai confirmé que Pab2 fait la navette entre le noyau et le cytosol, ce qui concorde avec l’orthologue PABPN1. Par la suite, j'ai démontré qu’une fraction de la protéine Pab2 demeure associée aux ARNm activement traduits. Il devenait alors intéressant de connaître les cibles de Pab2. L’analyse génomique a établi que Pab2 régule l’expression de certains transcrits, tels que les gènes méïotiques, les snoRNAs et les rétrotransposons. Pour la suite de mes recherches, je me suis concentrée sur le gène codant pour la protéine ribosomale de la large sous-unité Rpl30-2, dont l’expression augmente de 4 fois en absence de Pab2. Il est intéressant de noter que le changement d ’expression de Rpl30-2 dans une souche [Delta]pab2 dépend de la présence de l’intron Rpl30-2. Mes travaux démontrent que l’expression de Rpl30-2 est régulée au niveau du pré-ARNm par Pab2 et Rrp6, une composante de l’exosome nucléaire. De plus, l’analyse du transcriptome par RNA-seq a établi que ce mécanisme permet de réguler l’expression d'une soixantaine de gènes qui sont inefficacement épissés. En ce qui concerne Rpl30-2, l’épissage de ce transcrit est ralenti par Rpl30-1, le paralogue de Rpl30-2. L’ensemble de mes travaux ont pu caractériser l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission tout en établissant une fonction spécifique pour cette poly(A)-binding protein.

Les résultats d’expériences de microarray furent décriés par le manque de concordance inter-expériences. Les listes immenses de gènes résultant de filtrages statistiques sont difficiles à exploiter. La Food and Drug Administration a montré que le choix d’indicateurs de filtrage de gènes était la source d’une grande disparité entre expériences de microarray issus de laboratoires indépendants. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode de sélection basée sur la modélisation de l’allure de la courbe d’expression avec le Log2 du « fold-change » entre les points de cinétique. En effet, des gènes co-régulés au cours d’une cinétique temporelle présentent des courbes d’expression d’allure similaire alors que leur niveau d’expression peut être différent. Nous avons validé la méthode grâce à 2 expériences indépendantes de microar-ray étudiant la différenciation des ovaires d’embryons de souris. Ainsi, nous avons obtenu une liste réduite et pertinente de gènes exprimés. Puis, une analyse de ces résultats dans le cas de la différenciation ovarienne nous a permis d’identifier 9 nouveaux gènes candidats validés in silico et restant à être testés biologiquement. / Microarray results were blamed because of their lack of concordance. Moreover, the huge candidate gene lists from statistical filterings are not useful for biologists. FDA proved that the lack of reliability between microarray experiments came from the choice of gene filtering indicators. In this context, a filtering method was developed based on expression curve shape modelling with the use of Log 2 of fold-change between kinetic points. Actually, the co-regulated genes display similar expression shape but with heterogeneous expression level.Our method was developed and validated thanks to two independent microarray experiments (Affymetric®) from mouse embryonic ovaries. Therefore, a short and relevant list of genes was obtained. Thus, a study of results linked to ovarian differentiation permitted to identify nine new candidate genes that were in silico validated. These genes might be biologically tested (i.e. RT PCR) by the scientific community.